次旦多吉，巴桑卓嘎，達(dá)娃卓瑪

（西藏自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)研究院，西藏自治區(qū)藏藥標(biāo)準(zhǔn)化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西藏 拉薩850000）

十三味菥蓂丸是藏族驗(yàn)方，最初由藏醫(yī)藥學(xué)者嗒布拉吉研制，其配方和功能主治記載于公元十九世紀(jì)著名藏醫(yī)藥學(xué)家貢追·云旦加措編著的《臨床札記》 中，并沿用至今，收載于1995年版《衛(wèi)生部藏藥標(biāo)準(zhǔn)》 第一冊(cè)、國家藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)［WS-625（Z-170）-2002試行］［1］。方中菥蓂子、芒果核、蒲桃、大托葉云實(shí)清熱補(bǔ)腎，干簧水，可治療膀胱炎癥、腎熱［2-5］；紫草茸、茜草、山礬葉、圓柏枝清熱消炎，可治療腎炎擴(kuò)散熱癥、腰肌酸痛、療毒癥［6-8］；豆蔻、刀豆溫腎壯陽，可治療寒、熱性腎虛［9-10］；訶子、波棱瓜子、巴夏嘎清血，可治療膽熱癥［11-14］，全方功效清熱解毒、消炎止痛、通淋，可用于膀胱炎癥、淋病、腎擴(kuò)散熱癥及浮腫、水腫、寒熱引起的陰囊腫脹等疾病。

目前，十三味菥蓂丸在全國共有9個(gè)批準(zhǔn)文號(hào)，但其現(xiàn)行檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)只有性狀、重量差異、水分，以及茜草、紫草茸主要成分的TLC 定性鑒別，缺乏組方藥材質(zhì)控指標(biāo)及定量標(biāo)準(zhǔn)，難以全面保證產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性和用藥安全性，而且該標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)數(shù)十年未作修改。另外，對(duì)中藥品種的研究大多從含有量控制角度出發(fā)，較少考慮到藥品常規(guī)顯微鑒別和薄層鑒別［15-18］。

本實(shí)驗(yàn)從菥蓂子、茜草、豆蔻、山礬葉、紫草茸顯微鑒別，茜草、菥蓂子、刺柏TLC 定性鑒別，以及成分、重金屬含有量測(cè)定等方面出發(fā)，對(duì)十三味菥蓂丸展開了較系統(tǒng)的研究，以期能為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供參考，也可更好地推動(dòng)其質(zhì)量評(píng)價(jià)與監(jiān)管工作。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀（配置DAD 檢測(cè)器）、Agilent 7700ICP-MS 儀（美國Agilent 公司）；XP205、XP504電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；MDS-2002A 微波消解儀（北京合悅達(dá)科技有限公司）；SBX51顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；硅膠G 薄層板（青島海洋化工廠分廠）。

1.2 試藥 茜草（編號(hào)XZBBG-1-9）、刺柏（編號(hào)XZBBG-2-11）對(duì)照藥材，來自西藏自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)研究標(biāo)本室；菥蓂子（批號(hào)121599-201202）對(duì)照藥材，購自中國食品藥品檢定研究院。黑芥子苷對(duì)照品（批號(hào)X1450010），購自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司，含有量高于98.5%。十三味菥蓂丸由5家生產(chǎn)企業(yè)提供，A 廠家提供 13個(gè)批號(hào)（CY20160136、CY20160137、CY20160138、CY20160183、CY20160184、CY20160185、CY20160209、CY20160218、CY20160261、CY20160293、CY20160309、CY20160315、CY20160310，編號(hào)1～13），B廠家提供 8個(gè)批號(hào)（CY20160150、CY20160186、CY20160187、CY20160212、CY20160213、CY20160262、CY20160314、CY20160322，編號(hào)14～21），C 廠家提供3個(gè)批號(hào)（CY20160199、CY20160303、CY20160316，編號(hào)22～24），D 廠家提供1個(gè)批號(hào)（CY20160143，編號(hào)25），E 廠家提供1個(gè)批號(hào)（CY20160307，編號(hào)26）。鉛［編號(hào)-批號(hào)GBW（E）080129-15101，標(biāo)準(zhǔn)值100 μg／mL］、鎘（編號(hào)-批號(hào)GBW08612-15062，標(biāo)準(zhǔn)值1 000 μg／mL）、砷［編號(hào)-批號(hào)GBW（E）080117-15102，標(biāo)準(zhǔn)值100 μg／mL］、汞（編號(hào)-批號(hào)GBW08617-15096，標(biāo)準(zhǔn)值1 000 μg／mL）、銅（編號(hào)-批號(hào)GBW08615-15111，標(biāo)準(zhǔn)值1 000 μg／mL），均購自中國計(jì)量科學(xué)研究院。乙腈為色譜純（美國Fisher Scientific 公司）；其他試劑均為分析純；水為超純水（美國Millipore 公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 顯微鑒別 本品粉末呈紅棕色，種皮細(xì)胞為棕色薄壁細(xì)胞，表面觀類多角形，單個(gè)散在類圓形（菥蓂子）；胚乳細(xì)胞呈多角形，充滿細(xì)小的淀粉粒，集成團(tuán)，包埋細(xì)小偶見的草酸鈣方晶、深淺不一紅棕色色素、石細(xì)胞類圓形或多角形（豆蔻）；草酸鈣針晶束20～70 μm；偏光下呈紅白間多色彩（茜草）、草酸鈣簇晶單個(gè)或多個(gè)（山礬葉）；偶見腺毛長(zhǎng)30～75 μm（紫草茸）。見圖1。

圖1 十三味菥蓂丸顯微特征

表1顯示，菥蓂子、豆蔻、茜草、山礬葉、紫草茸顯微特征在5家生產(chǎn)企業(yè)樣品中均能見到，表明其準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好。

表1 5家生產(chǎn)企業(yè)樣品顯微鑒別結(jié)果

2.2 TLC 定性鑒別

2.2.1 茜草 取本品6 g，研細(xì)，加30 mL 甲醇超聲30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)?0 mL 水溶解，再加1 mL稀鹽酸，等體積乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，蒸干，1 mL 甲醇溶解，作為供試品溶液；取對(duì)照藥材0.5 g，同法制成相應(yīng)溶液。按照2015年版《中國藥典》 四部薄層色譜法0502，吸取上述2種溶液各5 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲苯-丙酮-甲酸（5 ∶5 ∶0.8 ∶0.2）為展開劑，展開，取出，晾干，置于紫外光燈（365 nm）下檢視，結(jié)果見圖2。由圖可知，樣品色譜在對(duì)照藥材相應(yīng)位置上顯相同顏色熒光斑點(diǎn)，分離度較好，陰性無干擾。

圖2 茜草TLC 色譜圖

2.2.2 菥蓂子 取本品4 g，研細(xì)，加20 mL 石油醚（30～60 ℃），過濾，殘?jiān)?0%乙醇加熱回流30 min，濾過，濾液濃縮至1 mL，作為供試品溶液；取對(duì)照藥材0.5 g，同法制成相應(yīng)溶液。按照2015年版《中國藥典》四部薄層色譜法0502，吸取上述2種溶液各3～5 μL，點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水-乙酸（8 ∶1 ∶1 ∶1 ∶0.2）為展開劑，展開（展距12 cm），取出，晾干，噴以3%氯化鋁乙醇溶液，105 ℃下加熱后置于紫外光燈（365 nm）下檢視，結(jié)果見圖3。由圖可知，樣品色譜在對(duì)照藥材相應(yīng)位置上顯相同顏色熒光斑點(diǎn)，分離度較好，陰性無干擾。

圖3 菥蓂子TLC 色譜圖

2.2.3 刺柏 取本品4 g，研細(xì)，加70%甲醇25 mL、鹽酸1 mL，加熱水解1 h，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL 溶解，乙酸乙酯提取2次，每次10 mL，合并乙酸乙酯，蒸干，殘?jiān)? mL 甲醇溶解，作為供試品溶液；另取對(duì)照藥材1 g，同法制成相應(yīng)溶液。按照2015年版《中國藥典》四部薄層色譜法0502，吸取上述2種溶液各5 μL，點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以（環(huán)己烷-三氯甲烷）-乙酸乙酯-冰醋酸（20 ∶5 ∶8 ∶0.1）為展開劑，展開（展距14 cm），取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃下加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置于紫外燈（365 nm）下檢視，結(jié)果見圖4。由圖可知，樣品色譜在對(duì)照藥材相應(yīng)位置上顯相同顏色熒光斑點(diǎn)，分離度較好，陰性無干擾。

圖4 刺柏TLC 色譜圖

2.3 黑芥子苷含有量測(cè)定

2.3.1 溶液制備

2.3.1.1 對(duì)照品溶液 精密稱取黑芥子苷對(duì)照品適量，加水溶解，制成每1 mL 含0.12 mg 該成分的溶液，即得。

2.3.1.2 供試品溶液 取裝量差異項(xiàng)下的樣品，研細(xì)，精密稱取粉末約4 g，置于具塞錐形瓶中、精密加入40%乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，回流提取45 min，放冷，40%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3.1.3 陰性樣品溶液 按照處方比例制備缺菥蓂子的陰性樣品，按“2.3.1.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3.2 色譜條件及專屬性考察 Waters XSELECT CSH C18色譜柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）；柱溫30 ℃；流動(dòng)相乙腈-0.02 mol／L 四丁基硫酸氫銨（氨試液調(diào)pH=6）（15 ∶85）；體積流量1.0 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)227 nm；進(jìn)樣量10 μL，色譜圖見圖5。由圖可知，陰性樣品在對(duì)照品色譜峰相應(yīng)位置上無干擾峰出現(xiàn)，表明該方法專屬性良好。

2.3.3 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液（0.668 5 mg／mL）2、4、8、12、20、30 μL，在“2.3.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，得方程為Y=19 200X＋415（r=0.999 7），在1.34～20.05 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.4 精密度試驗(yàn) 取同一對(duì)照品溶液10 μL，在“2.3.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得黑芥子苷峰面積RSD 為0.3%，表明儀器精密度良好。

圖5 黑芥子苷HPLC 色譜圖

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取樣品（5號(hào)）6份，按“2.3.1.2”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，在“2.3.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得黑芥子苷含有量RSD 為1.40%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品（5號(hào)）溶液10 μL，室溫下于0、2、4、8、10、12 h 在“2.3.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得黑芥子苷峰面積RSD 為1.4%，表明溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取樣品（5號(hào)）6份，加入等量對(duì)照品，按“2.3.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

2.3.8 樣品含有量測(cè)定 取5家生產(chǎn)企業(yè)26批樣品，按“2.3.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含有量，結(jié)果見表3。

表2 黑芥子苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

表3 黑芥子苷含有量測(cè)定結(jié)果

2.4 重金屬含有量測(cè)定

2.4.1 供試品溶液制備 精密稱取樣品細(xì)粉0.25 g，置于聚四氟乙烯消解罐內(nèi)，加硝酸5 mL 混勻，置于微波消解爐中，按操作規(guī)程安裝完裝置后按以下程序進(jìn)行消解。

第1步：1 600 W 功率在3 min 內(nèi)從室溫加熱至110 ℃，保持2 min。

第2步：1 600 W 功率在2 min 內(nèi)從110 ℃加熱至150 ℃，保持3 min。

第3步：1 600 W 功率在3 min 內(nèi)從150 ℃加熱至185 ℃，保持9 min。

消解結(jié)束后，冷卻至罐內(nèi)溫度低于70 ℃，緩緩放氣，取出內(nèi)罐置于加熱板上，110 ℃下加熱以使NO2蒸氣揮盡，并持續(xù)濃縮至2～3 mL，放冷，加水稀釋至50 mL，搖勻，即得。同法制備試樣空白溶液。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)液制備 精密量取Pb、Cd、As、Hg、Cu 標(biāo)準(zhǔn)貯備液適量，2%硝酸制成每1 mL 分別含Pb 2、4、8、10、16、20 ng，Cd 0.2、0.5、1、2、4、5 ng，As 2、4、8、10、16、20 ng，Hg 0.2、0.5、1、2、4、5 ng，Cu 25、50、100、150、200、250 ng，即得。

2.4.3 樣品含有量測(cè)定 按2015年版《中國藥典》 四部鉛、鎘、砷、汞、銅測(cè)定法（2321）測(cè)定，結(jié)果見表4。

3 討論

3.1 顯微鑒別 結(jié)合十三味菥蓂丸工藝流程，個(gè)別藥味經(jīng)過提取加工后無法鑒別顯微特征，在顯微鏡下只有淀粉粒、導(dǎo)管特征。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，菥蓂子、豆蔻、茜草、山礬葉、紫草茸顯微特征在各生產(chǎn)企業(yè)樣品中均能見到，表明可將其作為該制劑顯微特征。

表4 重金屬含有量測(cè)定結(jié)果

3.2 TLC 定性鑒別 課題組前期對(duì)5家生產(chǎn)企業(yè)進(jìn)行實(shí)地考察后發(fā)現(xiàn)，有些廠家對(duì)原藥材入庫檢驗(yàn)不夠完善，而且依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)沒有統(tǒng)一規(guī)范，許多原藥材辨認(rèn)僅靠主觀經(jīng)驗(yàn)。菥蓂子、刺柏是十三味菥蓂丸中特色藥味，而且前者有效成分黑芥子苷含有量較高，是主要藥效成分，故本實(shí)驗(yàn)對(duì)兩者進(jìn)行TLC 定性鑒別。結(jié)果顯示，各生產(chǎn)企業(yè)樣品TLC色譜圖分離度良好，斑點(diǎn)顏色清晰，陰性無干擾。

3.3 成分含有量限度 26批樣品中黑芥子苷含有量范圍在1.12～7.5 mg／g 之間，表明差異較大，結(jié)合十三味菥蓂丸工藝流程及相關(guān)研究數(shù)據(jù)，目標(biāo)成分按照轉(zhuǎn)移率80%計(jì)算，同時(shí)考慮到制劑存放時(shí)間、生產(chǎn)工藝穩(wěn)定對(duì)黑芥子苷含有量的影響，暫訂本品每1 g 含菥蓂子以黑芥子苷計(jì)應(yīng)為4.5～7.5 mg／g，由此可知有8批不符合規(guī)定，占30.8%，其原因可能與原料藥質(zhì)量或生產(chǎn)工藝不穩(wěn)定有關(guān)。另外，同一生產(chǎn)企業(yè)不同批次樣品，以及不同生產(chǎn)企業(yè)樣品中黑芥子苷含有量RSD 均在4% 以上，也印證了上述現(xiàn)象。

3.4 重金屬含有量限度 雖然十三味菥蓂丸不含重金屬，但本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)As、Hg、Cu 超出規(guī)定值，而且差異較大，無明顯規(guī)律差異，可能是原材料引入的污染，也有可能是生產(chǎn)過程中的污染，難以作出統(tǒng)一的限量規(guī)定。WHO 規(guī)定，重金屬暫定每周耐受攝入量分別為Pb 0.025 mg／kg、Cd 0.007 mg／kg、As 0.015 mg／kg、Hg 0.001 6 mg／kg，即最大日攝入量（暫定每周耐受攝入量×60／7×1 000）分別為Pb 214 μg、Cd 60 μg、As 128 μg、Hg 14 μg，而本實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果（表4）遠(yuǎn)低于該規(guī)定，即服用十三味菥蓂丸不會(huì)造成重金屬高攝入。

4 結(jié)論

十三味菥蓂丸為藏族驗(yàn)方，方中用藥遵循藏醫(yī)藥傳統(tǒng)，但課題組前期調(diào)查發(fā)現(xiàn)部分生產(chǎn)企業(yè)用的藥材有茜草、巴夏嘎（塞北紫堇）、婆婆納、鴨嘴花，比較混亂，故應(yīng)考以規(guī)范，明確藥材來源，建立統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)，該制劑原標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)項(xiàng)目過于簡(jiǎn)單，設(shè)置不完善，無法真實(shí)客觀評(píng)價(jià)其質(zhì)量狀況，更無法有效進(jìn)行質(zhì)量控制；本實(shí)驗(yàn)從藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方面對(duì)其顯微特征、TLC 定性鑒別、指標(biāo)成分（黑芥子苷）及重金屬含有量測(cè)定進(jìn)行較為系統(tǒng)的研究，以期為相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高和修訂提供參考依據(jù)。