張 希楊 卓 陳志敏李文兵周海婷權(quán) 亮胡昌江?

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都611137；2.成都市婦女兒童中心醫(yī)院藥學(xué)部，四川 成都611137；3.四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司，四川 成都611930）

五子衍宗丸作為千古名方，有“種子第一方”的美譽(yù)，是中醫(yī)補(bǔ)腎益精的經(jīng)典名方，又名五子丸、五子補(bǔ)腎丸，廣泛用于治療腎虛腰痛、陽(yáng)痿、不育等疾病。最早對(duì)其記載始于明·張時(shí)徹《攝生眾妙方》。方藥組成為五味子、菟絲子、覆盆子、枸杞子、車前子，功善補(bǔ)益腎精。方中用菟絲子性溫，入腎經(jīng)，以壯腎陽(yáng)；枸杞子育陰益精；覆盆子以滋陰養(yǎng)精；五味子酸甘化陰；加車前子利濕固氣，具有很好的補(bǔ)腎填精作用［1-3］。

復(fù)方入藥、炮制是中醫(yī)用藥的兩大特色，目前在復(fù)方中探討藥物炮制機(jī)制的研究較少，但中醫(yī)臨床功效的發(fā)揮是以復(fù)方為載體，將生、熟飲片納入復(fù)方進(jìn)行研究更符合中醫(yī)臨床用藥的特點(diǎn)［4-5］。本實(shí)驗(yàn)先將單味藥物炮制前后作藥效對(duì)比，然后將鹽制后的藥物納入五子衍宗丸中，研究炮制作用的機(jī)制，以反映中藥炮制與中醫(yī)臨床用藥的實(shí)際關(guān)聯(lián)性［6］。

在五子衍宗丸中單味鹽炙藥研究中發(fā)現(xiàn)，車前子鹽炙后其中化合物京尼平苷酸、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷的含有量升高，且鹽炙品對(duì)膜性腎病大鼠的腎保護(hù)作用和對(duì)腎臟中免疫調(diào)節(jié)因子的調(diào)節(jié)作用均優(yōu)于生品［6-8］。菟絲子鹽炙能促進(jìn)槲皮苷在體內(nèi)的吸收，并能延緩其體內(nèi)消除過(guò)程，臨床多用其炮制品，《中國(guó)藥典》 收載為鹽菟絲子，菟絲子鹽炙后能引藥歸腎，具有止瀉、澀精補(bǔ)腎、固胎力強(qiáng)、提高固澀補(bǔ)腎的功效；覆盆子鹽制后能增強(qiáng)補(bǔ)腎固澀作用［9］，宋平順等［10］等測(cè)定了一批鹽制品五味子中的五味子酯甲和五味子甲素的含有量，發(fā)現(xiàn)鹽制后含有量升高。課題組前期工作已證實(shí)枸杞子的鹽制品與生品沒(méi)有顯著性差異，但有一定的趨勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)將生、鹽覆盆子和生、鹽五味子分別入復(fù)方進(jìn)行生品和炮制品藥效比較，并對(duì)炮制前后的藥物復(fù)方進(jìn)行HPLC 研究，分析比較炮制前后組方的圖譜差異，初步探討五子衍宗丸中藥物鹽制的科學(xué)性，以期為后期五子衍宗丸溫腎助陽(yáng)的有效成分或譜效關(guān)系的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 試藥 枸杞子、菟絲子、覆盆子、五味子、車前子均由四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司提供，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)盧先明教授分別鑒定為茄科植物寧夏枸杞Lycium barbarumL.的干燥成熟果實(shí)、旋花科植物南方菟絲子Cuscuta aus-tralisR.Br.的干燥成熟種子、薔薇科植物華東覆盆子Rubus chingiiHu 的干燥果實(shí)、木蘭科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果實(shí)、車前科植物車前Plantago asiaticaL.的干燥成熟種子。對(duì)照品綠原酸（批號(hào)110753-201415）、金絲桃苷（批號(hào)11521-201205）、五味子醇甲（批號(hào) 110857-201714）、槲皮素（批 號(hào) 100081-201610）、山柰酚（批號(hào)110861-201611）均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純；雷公藤多苷購(gòu)于湖南千金協(xié)力藥業(yè)有限公司（批號(hào)20171104）。

1.2 動(dòng)物 SD 大鼠，雄性，體質(zhì)量180～220 g，清潔級(jí)，由四川達(dá)碩動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（川）2015-030。

1.3 儀器 Shimadzu2040C（配PDA 檢測(cè)器，日本島津公司）；JY20002電子天平（百分之一，上海方瑞儀器有限公司）；ME204E 電子天平（萬(wàn)分之一，瑞士Mettler Toledo 公司）；B×60金相顯微鏡（日本Olympus 公司）；DPD-700電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；KQ-300E 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；摩爾超純水機(jī)（重慶摩爾水處理設(shè)備有限公司）；78-1磁力加熱攪拌器（金壇市醫(yī)療儀器廠）。

2 方法

2.1 藥物配制 枸杞子、菟絲子、覆盆子、車前子、五味子炮制前后分別按表1中藥物需求組合（4味藥材鹽炙品為課題組按炮制規(guī)范自制），分別粉碎成細(xì)粉，過(guò)80目篩，按8 ∶8 ∶4 ∶1 ∶2（2015年版《中國(guó)藥典》 處方比例）混勻，共同用純凈水配制成劑量（1.2 g／mL）混懸液備用，使用時(shí)置于磁力攪拌器上保持均勻混懸狀態(tài)［11］。

表1 復(fù)方五子衍宗丸藥物配比Tab.1 Compound ratio of Wuzi Yanzong Pills

2.2 動(dòng)物分組及造模 取SD 大鼠80只，隨機(jī)分為正常組、模型組、組合Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ組，每組10只大鼠。除正常組外，其余各組大鼠均按雷公藤多苷20 mg／（kg·d）灌胃［12］，1次／日共30 d，制備腎精虧虛生精障礙大鼠，同時(shí)灌胃給藥30 d。

2.3 大鼠精子密度、活率及其活力觀測(cè) 于末次給藥后禁食不禁水24 h，處死大鼠。取5 mL 試管，加入2 mL 生理鹽水置于37 ℃恒溫水浴鍋內(nèi)，將大鼠雙側(cè)睪丸剪碎放入試管中，搖勻，37 ℃保溫5 min，使精子充分游離，用內(nèi)徑0.5 mm 的毛細(xì)管吸取中層液體（上層有脂肪油或者漂浮物）滴入血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，100倍顯微鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)中方格內(nèi)精子數(shù)（n）。另取1滴涂片，觀察精子活率和活力（觀察100個(gè)精子，分別計(jì)數(shù)有活力及無(wú)活力的精子數(shù)）［13-14］。

2.5 結(jié)果 對(duì)雷公藤多苷誘導(dǎo)的腎虛精虧型生精障礙大鼠精子密度與精子活率的影響，見(jiàn)表2。

表2 五子衍宗丸對(duì)少弱精癥模型大鼠精子質(zhì)量影響（， n=10）Tab.2 Effects of Wuzi Yanzong Pills on sperm quality in rats with oligozoospermia（， n=10）

表2 五子衍宗丸對(duì)少弱精癥模型大鼠精子質(zhì)量影響（， n=10）Tab.2 Effects of Wuzi Yanzong Pills on sperm quality in rats with oligozoospermia（， n=10）

注：與正常組比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與模型組比較，ΔP＜0.05

表2顯示，雷公藤多苷連續(xù)造模30 d 后，模型大鼠的精子活力與精子密度明顯下降，與正常組比較有顯著性差異（P＜0.05），連續(xù)給藥30 d 后，五子衍宗丸各劑量組動(dòng)物的精子活力和精子密度均明顯增加。與模型組比較，空白組、組合Ⅰ組、組合Ⅵ組的精子密度顯著提高（P＜0.05），活動(dòng)精子數(shù)明顯增多（P＜0.05），而組合Ⅱ組對(duì)大鼠精子密度與精子活率有一定的影響，但無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；根據(jù)組合Ⅲ、Ⅳ組，比較在4味藥都相同的情況下，生五味子與鹽五味子入復(fù)方對(duì)大鼠的藥效影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鹽五味子的組方對(duì)大鼠精子的密度與精子活力都有一定的改善，睪丸指數(shù)與精囊腺指數(shù)也都有提高，且組合Ⅲ組與正常組比較有顯著性差異（P＜0.05）；根據(jù)組合Ⅳ、Ⅴ組，比較在4味藥都相同的情況下，生覆盆子與鹽覆盆子入復(fù)方對(duì)大鼠的藥效影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鹽制組的精子密度與精子活率都有一定改善，且與模型組相比，兩組的精子活率均有顯著性差異（P＜0.05）。

3 HPLC 色譜圖比較

3.1 色譜條件 Agilent Extend C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流 動(dòng)相 乙腈-甲 醇（10 ∶ 1）（A）-0.4%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，5%～15% A；5～15 min，15%～19% A；15～25 min，19%～21% A；25～35 min，21%～26%A；35～80 min，26%～90%A）；體積流量1.0 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)為五味子醇甲254 nm，其他均360 nm；進(jìn)樣量5 μL。

3.2 供試品溶液制備 分別取10批菟絲子、覆盆子、車前子和五味子4味藥材按照處方比例過(guò)篩混勻（4味藥材炮制品為課題組按炮制規(guī)范自制），取約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70% 甲 醇 50 mL，稱定質(zhì)量，超聲（600 W，40 kHz）處理60 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

3.3 對(duì)照品溶液制備 取綠原酸、金絲桃苷、槲皮素、山柰酚、五味子醇甲適量于量瓶中，加入70%甲醇溶解定容至10.0 mL，制成含金絲桃苷123.5 μg、槲皮素121.4 μg、綠原酸222.1 μg、山柰酚74.5 μg、五味子醇甲157.8 μg 的混合對(duì)照品溶液。

3.4 方法學(xué)考察

3.4.1 精密度試驗(yàn) 按“3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“3.1”項(xiàng)色譜條件下，同一樣品精密吸取5 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD 均小于1%，相對(duì)峰面積RSD 均小于2%，表明儀器精密度良好。

3.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“3.1”項(xiàng)色譜條件下，分別于0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣5 μL，測(cè)得各共有峰相對(duì)峰面積RSD 均小于2%，表明供試品溶液在24 h穩(wěn)定性良好。

3.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次的組合藥材6份，按“3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別精密吸取5 μL，在“3.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)得各共有峰相對(duì)峰面積RSD 均小于3%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.5 圖譜比較 供試品溶液在“3.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣得相應(yīng)HPLC 色圖譜，并導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度軟件（2004A 版）處理，選取中位數(shù)法分別生成五子衍宗丸不同炮制品的對(duì)照指紋圖譜［15］，并選 取5個(gè)共有峰為特征指紋峰，見(jiàn)圖1～2。

圖1 各樣品HPLC 色圖譜（254 nm）Fig.1 HPLC chromatograms of various samples（254 nm）

4 討論

本課題組以“鹽味咸，咸入腎”理論為指導(dǎo)，研究五子衍宗丸中單味藥材鹽制后能增強(qiáng)補(bǔ)腎作用，然后以單味篩選藥入復(fù)方來(lái)研究對(duì)腎精虧虛證大鼠的治療改善作用［17］。通過(guò)前期對(duì)3味藥材作了炮制前后的藥效篩選，本實(shí)驗(yàn)以生品與《中國(guó)藥典》 收載的鹽覆盆子和鹽五味子作對(duì)照，將覆盆子和五味子炮制前后分別組成復(fù)方來(lái)驗(yàn)證對(duì)腎精虧虛證大鼠少精癥的治療作用。利用控制變量法＋雙因素法組合入復(fù)方進(jìn)行藥效學(xué)驗(yàn)證，比較覆盆子和五味子鹽制前后入復(fù)方對(duì)少弱精子大鼠的治療作用。在驗(yàn)證試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，鹽制后的藥物組方對(duì)大鼠的精子密度和精子活率具有顯著性差異，表明鹽制之后的復(fù)方對(duì)生精障礙型大鼠的治療效果最佳。

其中在藥效比較中枸杞子以生品為佳，故為了排除干擾只對(duì)炮制品作HPLC 的前后比較［18］；從基于五子衍宗丸不同組合藥材的HPLC 特征圖譜中發(fā)現(xiàn)鹽制品（組合Ⅵ）與生品比較254 nm 下共有峰32個(gè)，360 nm 下共有峰31個(gè)，未發(fā)現(xiàn)成分的增加或消失，但存在某些成分量上的變化。鹽制品組方中綠原酸、金絲桃苷、槲皮素的峰面積增大，峰吸收增強(qiáng)，且在360 nm 吸收下，復(fù)方生品組的吸收峰明顯減弱，峰面積減小，而鹽制組明顯增強(qiáng)，但本實(shí)驗(yàn)只對(duì)比了炮制品和生品HPLC 色圖譜的差異，關(guān)于含有量的差異和共有峰的指認(rèn)還需進(jìn)一步研究。

圖2 生品和炮制品HPLC 色譜圖（360 nm）Fig.2 HPLC chromatograms of raw and processed samples（360 nm）

本實(shí)驗(yàn)考察了乙腈-0.1% 磷酸水系統(tǒng)、乙腈-甲醇（10 ∶1）-0.4%磷酸水系統(tǒng)，結(jié)果表明，后者分離峰較多，分離度較好，且基線較穩(wěn)定。對(duì)于檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇，采用二極管陣列檢測(cè)器（PAD）分別考察了220、254、270、280、320、360 nm 波長(zhǎng)處的色譜圖，結(jié)果表明色譜圖在254 nm 處峰形較好，信息豐富，且分離度較好，360 nm 處綠原酸、金絲桃苷、槲皮素、山柰酚的分離較好。樣品提取方法的選擇，分別以甲醇、乙醇、70%甲醇、70%乙醇作為提取溶劑，70%甲醇超聲提取的樣品峰數(shù)量更多，故選70%甲醇超聲提取60 min。

中藥炮制和復(fù)方入藥是中醫(yī)用藥的特色，近年來(lái)關(guān)于飲片炮制的藥理研究多局限于單味藥，很少納入復(fù)方使用，導(dǎo)致臨床復(fù)方入藥出現(xiàn)差異；中藥復(fù)方成分復(fù)雜，功效多樣，在每個(gè)復(fù)方中發(fā)揮的作用也不盡相同，因此只用單味藥的炮制依據(jù)來(lái)解釋在復(fù)方中是否炮制入藥缺乏理論依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)將中藥炮制理論—“鹽炙入腎”與中醫(yī)基本理論—“腎主生殖”緊密結(jié)合，突出了中醫(yī)藥理論，增強(qiáng)了研究的實(shí)用性，下一步將從“鹽炙入腎-腎主生殖”繼續(xù)深入研究，擬闡明五子衍宗丸的作用機(jī)制。