馬夢雪，吳士筠，李 剛，覃 瑞，董 翔，劉 虹

（中南民族大學生命科學學院，武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護與利用湖北重點實驗室，湖北 武漢430074）

紅花Carthamus tinotoriusL.屬菊科紅花屬的一年生或兩年生草本植物，又名刺紅花、菊紅花和紅花菜等，是一種藥食同源的重要經(jīng)濟作物［1］。紅花適應性較強，能抗寒、耐旱、耐鹽堿［2］，在世界各地均有分布，哈薩克斯坦和印度是其主產(chǎn)國［3］。在我國，紅花的種植地區(qū)幾乎遍布全國25個省市（自治區(qū)），河南、四川、浙江、云南和新疆為主產(chǎn)區(qū)［4］。紅花的花瓣作為傳統(tǒng)的中草藥始載于《開寶本草》，《本草綱目》 記載其具有活血通經(jīng)、去瘀止痛的功效［5］?，F(xiàn)代藥理研究表明，紅花及其活性成分具有廣泛的生物活性，包括擴張冠狀動脈、改善心肌缺血、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、抗凝和抗血栓形成、抗氧化、抗衰老、抗菌、抗炎、抗腫瘤、降血脂、鎮(zhèn)痛等［6-10］。黃酮類是其最主要的化學成分，根據(jù)結構的不同，可以將其分為黃酮、黃酮醇、黃烷酮、異黃酮、查爾酮、花色素等。羥基紅花黃色素A 是紅花中主要的查爾酮類，也是其活血化瘀功效的主要有效成分；槲皮素及其苷類蘆丁為黃酮醇類，是其抗炎、抗病毒、抗腫瘤等藥理作用的主要活性成分［11］；木犀草素是具有代表性的天然黃酮，具有消炎、抗過敏、抗腫瘤、抗菌、抗病毒等多種藥理活性［12］，但紅花中木犀草素研究相對較少，花中木犀草素的含有量測定尚未見報道。

中藥質(zhì)量是對中藥有效性和安全性的反映和表征，劉昌孝等［13］于2016年提出中藥質(zhì)量標志物這一新概念，它是指存在于中藥材和中藥產(chǎn)品中固有的或加工制備過程中形成的、與中藥的功能屬性密切相關的化學物質(zhì)。2010年版《中國藥典》 中僅以羥基紅花黃色素A 和山柰素為指標用于紅花藥材的質(zhì)量控制，不能反映其多成分多靶點的特點，難以全面反映藥材質(zhì)量［14］。故本研究以黃酮類為主要研究對象，以羥基紅花花色素A、蘆丁、木犀草素和槲皮素為質(zhì)量標志物，采用HPLC 法同時測定不同品種紅花中4種黃酮類的含有量，以期為紅花優(yōu)良品種的選育及紅花藥材內(nèi)在質(zhì)量的控制提供科學依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1260LC 高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm，美國安捷倫公司）；KQ-100E 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；AL-204分析天平（美國梅特勒-托利多公司）；電熱恒溫鼓風干燥箱（黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司）；JK-WB400水浴鍋（上海精密科學儀器有限公司）；溶劑過濾器、0.45 μm 微孔過濾膜、一次性針頭過濾器等（天津市津騰實驗設備有限公司）。

1.2 材料 以62份不同品種紅花為材料，種子由中國農(nóng)業(yè)科學院油料作物研究所提供，信息見表1。取材于中南民族大學紅花種植基地，并于實驗室內(nèi)用鑷子取下花瓣，50 ℃烘箱內(nèi)烘干至恒定質(zhì)量，粉碎，過50目篩，備用。羥基紅花黃色素A（批 號 R25A9F59977 ）、槲皮素（批 號C09S8Y43412）、蘆丁（批號Y16M9S61523）、木犀草素（批號C24M8Q36543）對照品均購于上海源葉生物科技有限公司；甲醇、乙腈均為色譜純購于西格瑪奧德里奇上海貿(mào)易有限公司；其他生化試劑均購于國藥集團化學試劑有限公司。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-0.5%乙酸溶液（B），梯度洗脫（0～15 min，10%～40% A；15～20 min，40%～70% A；20～30 min，70%～10% A）；檢測波長300 nm；柱溫25 ℃；體積流量0.5 mL／min；進樣量10 μL。色譜圖見圖1。

2.2 混合對照品溶液制備 分別精密稱取羥基紅花黃色素A、蘆丁、槲皮素、木犀草素對照品2.5 mg，甲醇溶解并定容至25 mL 棕色量瓶中，搖勻，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾，即為0.1 mg／mL對照品貯備液。準確吸取各對照品貯備液適量于10 mL 棕色量瓶中，用甲醇稀釋并定容，搖勻，過濾，取續(xù)濾液經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.3 供試品溶液制備 稱取烘干的紅花樣品粉末（過50目篩）0.3 g 于100 mL 圓底燒瓶中，加入12 mL 60%甲醇溶液，稱定質(zhì)量，于80 ℃加熱回流40 min，放冷，用60% 甲醇補足減失質(zhì)量，搖勻，過濾，備用。精密移取2 mL 濾液于10 mL 棕色量瓶中，用60% 甲醇稀釋至刻度，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4 線性關系考察 精密吸取“2.2”項下混合對照品溶液適量，依次逐級稀釋，定容，搖勻，制得6個質(zhì)量溶度梯度的對照品混合溶液。在“2.1”項色譜條件下進樣，以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，結果見表2，表明各成分在各自范圍內(nèi)線性關系良好。

表2 各成分線性關系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度試驗 取“2.2”項下混合對照品溶液，在“2.1”項色譜條件下連續(xù)進樣6次，測得羥基紅花黃色素A、蘆丁、木犀草素、槲皮素峰面積 RSD 分別為 0.530%、0.608%、0.926%、0.930%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 精密稱取安徽紅花粉末（AH-1），按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件 下，分別于0、6、12、18、24 h 進樣，測得羥基紅花黃色素A、蘆丁、木犀草素、槲皮素峰面積RSD 分別為1.108%、0.486%、1.041%、0.721%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復性試驗 精密稱取安徽紅花粉末（AH-1），按“2.3”項下方法制備供試品溶液6份，在“2.1”項色譜條件下進樣，測得羥基紅花黃色素A、蘆丁、木犀草素、槲皮素峰面積RSD 分別為0.803%、1.835%、1.562%、0.678%，表明該方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗 稱取6份已知含有量的紅花粉末，分別精密加入一定質(zhì)量的羥基紅花黃色素A、蘆丁、木犀草素和槲皮素對照品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣，計算回收率，結果見表3。

表3 各成分加樣回收率試驗結果（n=6）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（n=6）

2.9 樣品含有量測定 取62份紅花供試品溶液，按“2.3”項下方法平行制備供試品溶液各3份，在“2.1”項色譜條件下進樣，計算4種黃酮類的含有量，結果見表4。同時，運用SPSS 21.0軟件對4種成分含有量四項指標的數(shù)據(jù)進行標準化處理，結果見表5。

表4 各成分含有量測定結果（， n=3）Tab.4 Results of content determination of various constituents（， n=3）

表4 各成分含有量測定結果（， n=3）Tab.4 Results of content determination of various constituents（， n=3）

表5 黃酮類成分含有量指標統(tǒng)計量分析（%）Tab.5 Index statistics analysis of flavonoids content（%）

3 討論

3.1 流動相選擇 黃酮類化合物易溶于甲醇、乙腈等有機溶劑。為了同時檢測紅花中4種黃酮類，同時保證有較好的分離效果，考察了甲醇-水、甲醇-0.4% 磷酸、甲醇-乙腈-0.7%磷酸、甲醇-0.5%乙酸及乙腈-0.5% 乙酸等流動相［15-18］。結果表明，使用前幾種流動相系統(tǒng)時，4種組分與其他成分分離度不高，分離所需時間也較長。在選擇乙腈-0.5%乙酸為流動相梯度洗脫時，4種黃酮類分離效果較好。

3.2 檢測波長選擇 通過對對照品溶液波長的掃描，得到各對照品分別在402、370、350、320 nm處有最大吸收，因此考察這4種波長的檢測靈敏度。結果發(fā)現(xiàn)300、350 nm 條件下檢測靈敏度較高，300 nm 作檢測波長較350 nm 的干擾峰小，效果最好。因而選擇300 nm 為最佳檢測波長。

3.3 供試品制備方法考察 采用加熱回流法，以總黃酮的提取率為考察指標，對提取溶劑（20%、40%、60%甲醇）、料液比（1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60）、提取溫度（60、70、80 ℃）和提取時間（60、80、100 min）進行正交試驗考察。結果表明，1.0 g 紅花粉末中加入40 mL 60%甲醇回流提取80 min 時總黃酮的提取得率較高。

3.4 指標成分分析 本研究以4種成分對紅花品質(zhì)進行多指標分析，由含有量測定結果可知各品種紅花的羥基紅花黃色素A 含有量平均值為0.937%～3.847%，其中僅有YN-14和IND-2的值低于1%，其余60份紅花的羥基紅花黃色素A 含有量均符合2010年版《中國藥典》 不少于1% 的要求。由統(tǒng)計量分析結果可知，羥基紅花黃色素A 含有量平均值為1.817%，最高含有量（3.847%）是最低含有量（0.937%）的4.10倍；蘆丁含有量平均值為0.350%，最高含有量（0.736%）是最低含有量（0.047%）的15.66倍；木犀草素含有量平均值為0.069%，最高含有量（0.142%）是最低含有量（0.016%）的8.875倍；槲皮素含有量平均值為0.788%，最高含有量（1.932%）是最低含有量（0.022%）的87.81倍；4種黃酮類含有量的平均變異系數(shù)為42.092%，表明紅花植物種內(nèi)不同品種之間黃酮含有量存在較大差異，分化明顯，該結果與郭美麗等［19］對紅花種質(zhì)資源的品質(zhì)評價的研究結果相似，這為高品質(zhì)紅花品種的遺傳選育提供了依據(jù)。印度紅花（IND-1）、山東紅花（SD-2）、德國紅花（DEU-1）和敘利亞紅花（SYR-1）的羥基紅花黃色素A 含有量最高，分別為3.847%、3.369%、3.202%、2.869%，均高于劉雅新等［20］測得的含有量；而且蘆丁和槲皮素含有量也較高，表明這些地區(qū)的紅花資源質(zhì)量較優(yōu)，適宜作為紅花育種的候選材料。木犀草素主要存在于植物的葉、莖和枝干中，已在菊花中測得，但在紅花中尚未有相關報道［21］。本研究從花中測得木犀草素，發(fā)現(xiàn)其含有量平均值為0.069%，遠遠低于其他黃酮類成分含有量，但是該值與韓煒等［22］在紅花地上部分測得的木犀草素的平均含有量0.0549%相近，表明木犀草素含有量低可能是因為其本就在紅花中含有量相對較少，而與所選取的植物部位無關。由于長期的自然和人工選擇，紅花品種中化學成分和藥理活性在種內(nèi)發(fā)生了變異。一些來源相同的紅花品種其黃酮含有量表現(xiàn)出較大的差異，如源自云南的YN-14，其各項黃酮類成分含有量均低于其他云南紅花。同時，有一些來自不同地區(qū)的紅花其黃酮成分含有量表現(xiàn)出相似性，如以色列紅花（ISR-1）與阿根廷紅花（ARG-1），這可能是因為這些紅花資源種植在同一環(huán)境條件下時，其在性狀上表現(xiàn)出相似的生態(tài)適應性。以上結果表明，不同品種紅花黃酮含有量可能存在顯著性差異，也可能存在相似性，故對紅花中多種黃酮類進行同步測定以更加全面的反映其內(nèi)在質(zhì)量。

據(jù)現(xiàn)有報道［23-24］，紅花有不同的花色，不同品種紅花在不同的開花時期其花色會發(fā)生改變，不同花色的紅花其黃酮類成分含有量和藥效也存在一定的差異，但是相關作用機制的研究報道甚少，亦有待研。