郭 靜，王浩然，沈周媛，張 彤，袁秀榮，丁 越?

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海201203；2.徐州市夏橋社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，江蘇 徐州221011）

我國竹類資源豐富，是世界上最主要的產(chǎn)竹國，目前已收載了原產(chǎn)及少數(shù)引進(jìn)的竹亞科植物43屬707種、52變種及98變型［1］，其中《中國中藥資源志要》 上列出了30余種藥用竹種，包括常見的禾本科淡竹葉屬植物淡竹葉Lophatherum gracileBrongn.、大明竹屬植物苦竹Pleioblastus amarus（Keng）keng f.、剛竹屬植物淡竹（又名毛金竹）Phyllostachys nigra（Lodd.）Munro var.henonis（Mitf.）Stapf ex Rendle 等［2-3］，其中淡竹葉的莖葉稱淡竹葉，苦竹的葉稱苦竹葉，而淡竹等的葉則被統(tǒng)稱為竹葉，在我國擁有極其悠久的藥用和食用歷史。淡竹葉主要分布于長江以南各省區(qū)，有清熱瀉火、除煩利尿的功效，經(jīng)炮制干燥后使用，主治熱病煩渴、口瘡尿赤、熱淋澀痛等癥。其小塊根亦作藥用?？嘀袢~分布于江蘇、安徽、浙江、江西、福建、湖北、湖南、四川等地，具有清心解毒、利尿明目之功效，以嫩葉入藥，常用于熱病煩渴、失眠、小便短赤、口瘡、目痛、失音、燙火傷。竹葉主要分布于山東、河南及長江流域以南各地，具有清熱除煩、生津利尿之功效，隨時采鮮品入藥，多用于治療熱病煩渴、小兒驚癇、咳逆吐衄、小便短赤、口糜舌瘡。其筍可供食用，中藥之“竹茹”“竹瀝”一般取自本種。

近年來，由于竹葉保健作用明顯、安全性高，常被開發(fā)成色、香、味俱佳的保健產(chǎn)品，如竹葉酒、竹葉茶等，具有提高機(jī)體免疫力、抑菌殺菌、清除氧自由基等功效［4］。竹葉中含有大量的黃酮、酚酸、多糖、氨基酸及微量元素等，其中以黃酮和酚酸居多，是竹葉的主要活性物質(zhì)［5-7］。竹葉中黃酮類多屬于黃酮碳苷和黃酮氧苷，主要有苜蓿素、日當(dāng)藥黃素、木犀草素、木犀草苷、異葒草苷、葒草苷等；酚酸類主要包括香豆酸、香草酸、綠原酸、咖啡酸、阿魏酸等［8-13］?，F(xiàn)代藥理研究證明，竹葉具有抗氧化、抑菌、抗炎、抗腫瘤、降血脂等作用［14-21］，其中黃酮、酚酸類表現(xiàn)出較強(qiáng)的藥理活性，具有顯著的抗氧化活性。目前以竹葉黃酮、內(nèi)酯和酚酸類為主的竹葉抗氧化劑（AOB）已列入國標(biāo)GB-2760，被衛(wèi)生部批準(zhǔn)作為天然食品抗氧化劑使用，在北美和亞洲等地區(qū)已安全應(yīng)用于食品、保健品、醫(yī)藥、化妝品的開發(fā)［22-24］，具有廣闊發(fā)展前景。

竹葉具有顯著的抗氧化活性，市場應(yīng)用極為廣泛。但是，由于竹葉品種繁多、性狀相近、功效相似、成分復(fù)雜，目前尚無系統(tǒng)有效的鑒別方法，即便是納入《中國藥典》 的淡竹葉也缺少成分含有量測定的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)［25-26］，更缺乏對其抗氧化活性的物質(zhì)基礎(chǔ)研究。本研究采用DPPH 法、ABTS 法及FRAP 法對其活性成分進(jìn)行抗氧化活性研究，根據(jù)其適用性、穩(wěn)定性與可重復(fù)性優(yōu)選出DPPH 法用于3種竹葉提取物的抗氧化活性評價，再通過指標(biāo)成分含有量與提取物抗氧化活性的相關(guān)與回歸分析，初步探討3種竹葉中的抗氧化活性物質(zhì)基礎(chǔ)，以期為竹葉資源的合理利用和健康產(chǎn)品的有效開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1260 series 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；JA31002電子分析天平（上海精天電子儀器有限公司）；DHG-9053A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；XS105DU 電子天平（梅特勒-托利多中國）；JP-300B 高速多功能粉碎機(jī)（浙江永廉市久品工貿(mào)有限公司）；SB5200D 超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；微孔板分光光度計（美國Bio Tek 公司）。

1.2 藥物和試劑 1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）（美國Sigma 公司）；L-抗壞血酸（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；維生素E 類似物（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；綠原酸、異葒草苷、葒草苷、異牡荊素、木犀草苷、木犀草素、芹菜素對照品（上海源葉生物科技有限公司）。FRAP 法總抗氧化能力檢測試劑盒、ABTS 快速法總抗氧化能力檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。乙腈、甲醇（色譜純，安徽時聯(lián)特種溶劑股份有限公司）。

實(shí)驗(yàn)中所用3種竹葉經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)宋龍博士鑒定為禾本科植物淡竹葉Lophatherum gracileBrongn.的干燥葉及根莖、禾本科植物苦竹Pleioblastus amarus（Keng）keng f.的干燥葉、禾本科植物淡 竹Phyllostachys nigra（Lodd.）Munro var.henonis（Mitf.）Stapf ex Rendle 等的干燥葉。

2 方法

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液 分別取綠原酸、木犀草苷、木犀草素、芹菜素對照品約5 mg，精密稱定，甲醇溶解并定容至10 mL 量瓶中，得到約0.5 g／L 的對照品溶液，同法配制約1 g／L 的異葒草苷、葒草苷、異牡荊素對照品溶液。分別精密量取綠原酸1 mL、異葒草苷2.5 mL、葒草苷2 mL、異牡荊素2 mL、木犀草苷0.2 mL、木犀草素0.2 mL、芹菜素0.1 mL，混合后加50%甲醇定容至10 mL，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.1.2 HPLC 待測樣品 取各竹葉粉末（過65目篩）約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別加入甲醇25 mL，室溫超聲提取30 min，冷卻至室溫，10 000 r／min 離 心10 min，取上清液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.1.3 抗氧化活性待測樣品 待測提取液的前處理方法同HPLC 待測樣品的制備，所得提取液還需經(jīng)適當(dāng)濃縮或稀釋配制成系列質(zhì)量濃度待測液。另取綠原酸、異葒草苷、葒草苷、異牡荊素、木犀草苷、木犀草素、芹菜素對照品及L-抗壞血酸、維生素E 類似物陽性抗氧化物各約1 mg，精密稱定，分別加適量DMSO 溶解，配制成20 mmol／L 的對照品溶液，再分別加50%甲醇稀釋成系列濃度的成分待測液。

2.2 7種成分含有量測定 按2015年版《中國藥典》 中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究制定要求，結(jié)合預(yù)試驗(yàn)中成分含有量、分離度、專屬性等考察結(jié)果，最終確定以綠原酸、異葒草苷、葒草苷、異牡荊素、木犀草苷、木犀草素、芹菜素作為竹葉測定指標(biāo)，并建立了一種可用于3種竹葉中7種成分含有量測定方法。色譜條件，Diamonsil Plus C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫30 ℃；流動相0.1% 甲酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～2 min，10% B；2～30 min，10%～30% B；30～45 min，30%～70%B；45～55 min，70% B；55～60 min，70%～10%B）；體積流量1.0 mL／min；檢測波長350 nm；進(jìn)樣量10 μL。每個樣品平行測定3次。

2.3 抗氧化活性測定

2.3.1 各成分對DPPH 自由基的清除活性 新鮮配制6.5×10-5mol／L 的DPPH 甲醇溶液，在96孔板中分別加入DPPH 甲醇溶液100 μL，再取不同濃度的成分待測液10 μL 加入，搖勻后加入甲醇140 μL，于室溫避光反應(yīng)1 h，在517 nm 處測定吸光度為A樣品；未加待測液的的空白DPPH 溶液（10 μL 甲醇）的吸光度為A空白。每份樣品各平行測定3次，取平均值。樣品對DPPH 的清除率可表示為

采用SPSS v21.0軟件，以成分濃度和相應(yīng)的清除率計算其IC50，單位mmol／L。

2.3.2 各成分對ABTS 自由基的清除活性 根據(jù)ABTS 試劑盒說明書配制ABTS 工作液，稀釋過氧化氫和過氧化物酶溶液，以維生素E 類似物為標(biāo)準(zhǔn)品配制系列濃度溶液，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。96孔板中先加入20 μL 過氧化物酶工作液，再加入10 μL各成分待測液和ABTS 工作液170 μL 輕輕混勻，室溫孵育6 min 后測定414 nm 處吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算待測成分的抗氧化值。

2.3.3 各成分對鐵離子的還原能力 按照FRAP試劑盒說明書配制適量的FRAP 工作液，并以FeSO4·7H2O 為標(biāo)準(zhǔn)品配制系列濃度溶液，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。96孔板中先加入180 μL FRAP 工作液，再加入5 μL 各成分待測液混勻，37 ℃孵育3～5 min后測定593 nm 處吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算其抗氧化值。

2.3.4 各竹葉提取物對DPPH 自由基的清除活性 新鮮配制濃度為6.5×10-5mol／L 的DPPH 甲醇溶液，在96孔板中分別加入DPPH 甲醇溶液100 μL，再取不同濃度的待測提取液10 μL 加入，搖勻后加入甲醇140 μL 于室溫避光反應(yīng)1 h，在517 nm 處測定吸光度并按上述公式計算待測提取液對DPPH自由基的清除率，并采用SPSS 21.0軟件計算其IC50，單位mg／mL。

3 結(jié)果

3.1 不同竹葉中7種成分的含有量測定及抗氧化活性測定

3.1.1 線性關(guān)系考察 取“2.1.1”項(xiàng)下混合對照品溶液加50% 甲醇逐次稀釋2倍，注入HPLC 測定，以色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸。結(jié)果見表1。7種成分及其在不同竹葉樣品中的高效液相色譜圖見圖1。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various components

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various components

3.1.2 不同竹葉中7種成分的含有量及其抗氧化活性 分別測定了7批淡竹葉、10批苦竹葉和9批竹葉提取物及7種成分的抗氧化活性，結(jié)果見表2～3，結(jié)果均表示為（）。不同竹葉提取物清除DPPH 自由基的IC50均值比較結(jié)果如圖2。其結(jié)果表明竹葉提取物的抗氧化活性最強(qiáng)，苦竹葉次之，淡竹葉最弱，竹葉和苦竹葉清除DPPH 自由基的能力約為淡竹葉的2～3倍，且淡竹葉的抗氧化活性與竹葉、苦竹葉比較均具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。

圖2 3種竹葉提取物清除DPPH 自由基的能力Fig.2 DPPH free radical scavenging activities of the extracts from three kinds of bamboo leaves

3.2 雙變量相關(guān)性分析

3.2.1 雙變量相關(guān)性分析 采用雙變量相關(guān)性分析分別對3個品種竹葉中7種成分的含有量與對應(yīng)品種提取物的抗氧化活性的相關(guān)性進(jìn)行了分析，分析結(jié)果見表2所示。其結(jié)果表明，芹菜素含有量與淡竹葉提取物抗氧化活性呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），綠原酸、異葒草苷含有量與苦竹葉提取物抗氧化活性呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；葒草苷含有量與竹葉提取物抗氧化活性呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），即綠原酸、異葒草苷、葒草苷和芹菜素含有量與3種竹葉提取物抗氧化活性具有顯著的相關(guān)性（P＜0.05）。但由于提取物活性通常是各成分總體作用的結(jié)果，僅通過相關(guān)性不能直觀的根據(jù)各成分的含有量預(yù)測樣品的抗氧化活性，還需進(jìn)一步回歸分析。

表2 各成分的抗氧化活性及相關(guān)性分析結(jié)果Tab.2 Results of antioxidant activities of various components and correlation analysis

3.2.2 逐步回歸分析 利用SPSS v21.0統(tǒng)計軟件對成分含有量數(shù)據(jù)及提取物清除DPPH 自由基的抗氧化活性進(jìn)行逐步回歸分析（“Entry”=“0.15”，“Removal”=“0.20”）［27-28］，結(jié)果顯示，淡竹葉中葒草苷、芹菜素含有量與其提取物清除DPPH 自由基的能力呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；苦竹葉中異葒草苷含有量與其提取物清除DPPH 自由基的能力呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；竹葉中葒草苷含有量與其提取物清除DPPH 自由基的能力呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。綜合前述回歸分析與相關(guān)性分析結(jié)果，初步確定淡竹葉、苦竹葉、竹葉提取物中的主要抗氧化活性成分，其中淡竹葉抗氧化活性主要與芹菜素相關(guān)；苦竹葉抗氧化活性主要與異葒草苷相關(guān)；而竹葉抗氧化活性主要與葒草苷相關(guān)。此外，本研究還對各指標(biāo)成分含有量、含有量之和共8個自變量與因變量提取物抗氧化值（IC50）進(jìn)行了回歸分析，初步得到了不同品種竹葉抗氧化活性與各成分含有量的回歸方程，見表4，其中A表示提取物清除DPPH 自由基活性，Cn表示相應(yīng)成分的含有量。將各成分含有量數(shù)據(jù)代入表中的回歸方程進(jìn)行抗氧化活性的預(yù)測和模擬，見圖3。結(jié)果表明，所觀測的抗氧化活性值與實(shí)測的抗氧化活性值趨勢基本一致，均呈正相關(guān)，且淡竹葉回歸方程預(yù)測效果最好（R=0.984），有望經(jīng)過后續(xù)進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證，應(yīng)用于淡竹葉抗氧化活性的快速推測。

表3 各成分含有量測定結(jié)果及其抗氧化活性（， n=3）Tab.3 Results of content determination of various components and their antioxidant activities（， n=3）

表3 各成分含有量測定結(jié)果及其抗氧化活性（， n=3）Tab.3 Results of content determination of various components and their antioxidant activities（， n=3）

注：-表示未檢測出。IC50表示清除50%DPPH 自由基時所對應(yīng)的提取物濃度

表4 成分含有量與提取物抗氧化IC50值的逐步回歸結(jié)果Tab.4 Results of stepwise regression analysis between content of components and antioxidant IC50values of extracts

圖3 回歸方程模擬結(jié)果Fig.3 The simulation results of regression equations

4 討論

研究中常用的抗氧化活性評價方法為DPPH自由基清除法，ABTS 自由基清除法，鐵離子還原能力（FRAP）法及羥自由基清除法等［29-31］。本研究分別以ABTS 法、DPPH 法和FRAP 法考察了3種竹葉7種成分的抗氧化活性，其中ABTS 法測定結(jié)果表明綠原酸抗氧化能力最強(qiáng)，而芹菜素最弱；DPPH 法結(jié)果表明異葒草苷抗氧化活性最強(qiáng)而芹菜素最弱；FRAP 法結(jié)果表明木犀草素抗氧化活性最強(qiáng)而芹菜素最弱。3種方法測定結(jié)果均表明7種成分中以芹菜素抗氧化活性最弱，但對其中成分較強(qiáng)的化合物的抗氧化活性測定結(jié)果不盡相同，可能與3種測定方法的工作機(jī)理、測試環(huán)境、待測物在測試溶劑中的溶化性等相關(guān)。經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究及結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)RAP 法中以FeSO4·7H2O 為對照品，其反應(yīng)體系主要為水，而黃酮類難溶于水，在水環(huán)境下會析出沉淀，影響實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果，故FRAP 法不適用于竹葉提取液中黃酮類的抗氧化活性測定；ABTS 法測定過程中需要使用過氧化物酶，而過氧化物酶屬蛋白質(zhì)類，易受到有機(jī)試劑的影響而失活。本研究在預(yù)試驗(yàn)中采用ABTS 法測定提取物的抗氧化活性時，結(jié)果較不穩(wěn)定，重復(fù)性差，故ABTS 法不適合作為本實(shí)驗(yàn)中提取物的抗氧化活性評價方法；而DPPH 法中的DPPH 本身是種很穩(wěn)定的氮中心的自由基，易溶于甲醇、乙醇，其體系彈性更大，能更好的使竹葉中的主要成分充分發(fā)揮清除自由基的作用，且DPPH 法穩(wěn)定性好，可重復(fù)性強(qiáng)，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確、可靠。因此，本研究最終選用了DPPH 法。

近年來，學(xué)者們提出了中藥譜效學(xué)的研究思路，并在采用數(shù)據(jù)分析技術(shù)預(yù)測成分藥效、闡明各成分對藥效貢獻(xiàn)率、尋找主要活性成分方面取得了一定的進(jìn)展［32］。本研究采用雙變量相關(guān)分析與多元回歸分析2種常用方法將樣品中7種成分含有量與3種竹葉提取物抗氧化活性相關(guān)聯(lián)，找出其中與活性密切相關(guān)的變量，初步闡明了其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，并通過回歸方程對樣品的抗氧化活性進(jìn)行了模擬，基本與實(shí)測結(jié)果趨勢保持一致，有望通過該方程的進(jìn)一步驗(yàn)證，快速推測竹葉樣品的抗氧化活性，為3種竹葉原藥材的快速篩選與健康產(chǎn)品的合理開發(fā)提供參考。