劉 密，歐陽 輝，賈 佳，黃文平，郭 颯，何明珍，馮育林，楊世林

（江西中醫(yī)藥大學，創(chuàng)新藥物與高效節(jié)能降耗制藥設備國家重點實驗室，江西 南昌330006）

補體系統(tǒng)是人體重要的免疫防御系統(tǒng)之一，參與機體的特異性和非特異性免疫機制，表現(xiàn)為抗微生物防御反應，免疫調節(jié)及介導免疫病理的損傷反應。在消滅外來微生物、維持機體的平衡等生理過程中起著重要的作用。研究表明補體的過度激活會引發(fā)免疫系統(tǒng)相關疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕關節(jié)炎、急性呼吸窘迫綜合征等［1］?，F(xiàn)有非天然產物類補體抑制劑面臨副作用強、治療費用高以及適應癥選擇難等問題限制了其臨床使用［2］，急需尋找高效低毒的補體抑制劑。而天然藥物中存在廣泛的抗補體活性成分，且大多數(shù)活性成分可以被機體消化吸收，因此從天然產物中開發(fā)高效、低毒的補體抑制劑具有良好的前景。

平臥菊三七Gynura procumbens（Lour.）Merr.為菊科菊三七屬多年生草本藥食兩用植物，分布于越南、泰國、印度尼西亞和非洲以及中國等地［3］。據(jù)《中國中草藥匯編》 下冊記載，其具有通經活絡、消炎止咳、散瘀消腫、活血生肌之功效?，F(xiàn)代藥理學研究表明平臥菊三七具有良好的止血、抗炎、降血糖、抗腫瘤、抗氧化等作用，主要用于跌打損傷、風濕關節(jié)痛和痛風［4-6］。平臥菊三七主要化學成分為酚酸類、黃酮類、萜類、生物堿、香豆素類等［7］。據(jù)報道黃酮類、酚酸類及香豆素類具有良好的抗補體活性［2，8］。至今，平臥菊三七抗補體藥理活性尚未見報道。因此，本研究采用經典的體外抗補體活性測定方法對平臥菊三七抗補體活性進行測定，同時采用UPLC-Q-TOF-MS 法對其活性部位進行分析，以期為其抗補體活性作用機制及作用靶點提供基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器 超高效液相色譜儀（日本島津公司產品）；Triple-TOF 5600高分辨質譜儀（配備ESI 離子源及Analyst 1.6數(shù)據(jù)處理軟件、PeakView1.2數(shù)據(jù)處理軟件，美國AB Sciex 公司）；HC-3018R 型高速冷凍離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；SpectraMax? i3型酶標儀（美國Molecular devices 公司）；KQ-250DB 型數(shù)控超聲波清洗器（鞏義市予華儀器有限責任公司）。

1.2 試劑和材料 甲酸（色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；甲醇、乙腈（色譜純，美國Fisher 公司）；超純水（屈臣氏集團產品）；肝素鈉和綿羊血（北京索萊寶科技有限公司）；溶血素（上海延慕有限公司）。

Hartley 豚鼠（SPF 級），雌性，體質量200～250 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號：SCK（京）2016-0011。

平臥菊三七于2015年8月采自江西省靖安縣，由南昌市食品藥品檢驗所吳蓓副主任藥師鑒定為平臥菊三七Gynura procumbens（Lour.）Merr 全草。

2 方法與結果

2.1 藥材提取 稱取平臥菊三七藥材450 g，用8倍量70%乙醇回流提取，提取2次，1.5 h／次，合并提取液。減壓回收至無醇味，用適量水分散后，用乙酸乙酯萃取，萃取液減壓濃縮，即得乙酸乙酯萃取部位。水溶液減壓濃縮，即得平臥菊三七水提部位。

2.2 抗補體活性測定

2.2.1 溶液配制

2.2.1.1 巴比妥緩沖液 取巴比妥緩沖液（pH 7.4）和三蒸水1 ∶3混合，即得。

2.2.1.2 2%羊紅細胞 取綿羊血適量，加巴比妥緩沖液溶液洗滌后，于離心機中（3 000 r／min），5 min，重復洗滌3次。再取適量上述洗滌好的綿羊血于紅細胞壓積管中離心、壓積，加適量巴比妥緩沖溶液配成2%羊紅細胞溶液。

2.2.1.3 溶血素溶液 取溶血素適量，加入“2.2.1.1”項下巴比妥緩沖溶液，配制成1 ∶3 000溶血素溶液。

2.2.1.4 供試品溶液 稱取平臥菊三七乙酸乙酯萃取部位及水提部位各適量（約2 mg），加入30 μL DMSO 將上述樣品溶解，再加入770 μL 巴比妥緩沖溶液超聲溶解后，繼續(xù)加巴比妥緩沖溶液對倍稀釋成8個濃度的供試品溶液，即1 ∶2、1 ∶4、1 ∶8、1 ∶16、1 ∶32、1 ∶64、1 ∶128、1 ∶256。

2.2.2 補體制備及效價測定 取豚鼠腹腔主動脈血約10 mL，4 ℃放置1 h 凝固，于離心機中（3 000 r／min）5 min，取上清液于-70 ℃冷凍保存，備用。

補體經典溶血系統(tǒng)的建立［9］，取豚鼠血清100 μL，加入巴比妥緩沖溶液配成1 ∶2的溶液，再對倍稀釋成1 ∶4、1 ∶8、1 ∶16、1 ∶32、1 ∶64、1 ∶128、1 ∶256各濃度的溶液。取100 μL 溶血素、100 μL 上述各濃度補體、100 μL 2%羊紅細胞溶液、300 μL 巴比妥緩沖溶液混勻，于37 ℃的水浴中30 min，置離心機中（3 000 r／min）5 min。分別在每管中吸取200 μL 于96孔板中，405 nm下測定吸光度。以100 μL 2% 羊紅細胞溶液加500 μL三蒸水作為全溶血組，并將其吸光度作為全溶血標準，計算溶血率。選擇達到相似高溶血率的最低補體濃度作為確保體系能正常溶血所需的臨界補體濃度。最終得到最低補體濃度為1 ∶64。溶血率抑制率%=1-（A中藥測定組-A中藥對照組）／A補體組。

2.2.3 藥物經典途徑抗補體活性測定 參照文獻方法［9-11］，取“2.2.2”項下補體，及各個濃度的供試品溶液、溶血素、2%羊紅細胞溶液按表1體積依次加入、混勻，37 ℃水浴中孵育30 min，于離心機中（3 000 r／min）5 min，取上清液200 μL至96孔板中，用酶標儀于405 nm 下測定吸光度。溶血實驗中所加各成分的體積見表1，溶血抑制率的測定結果見表2～4。

表1 溶血實驗中所加各成分的體積（μL）Tab.1 Volume of various constituents for hemolysis assay on the classic pathway（μL）

表2 樣品乙酸乙酯萃取部位溶血抑制率Tab.2 The hemolysis inhibition rate of ethyl acetate fraction of samples

表3 樣品水部位溶血抑制率Tab.3 The hemolysis inhibition rate of aqueous fraction of samples

表4 肝素鈉溶血抑制率Tab.4 The hemolysis inhibition rate of aqueous fraction of heparin sodium

經GraphPad Prism 5軟件分析，其陽性藥肝素鈉CH50為（0.025 8±0.002 1）mg／mL，平臥菊三七乙酸乙酯萃取部位CH50為（0.003 5±0.000 3）mg／mL，平臥菊三七水部位CH50為（0.118 2±0.010 0）mg／mL。其lnc-溶血抑制率曲線見圖1。

圖1 各樣品lnc-溶血抑制率曲線Fig.1 The curve lnc-hemolysis inhibition rate of various samples

結果表明，平臥菊三七乙酸乙酯萃取部位具有較強的抗補體活性，優(yōu)于陽性藥。因此采用UPLCQ-TOF-MS 技術分析平臥菊三七乙酸乙酯萃取部位的活性成分。

2.3 活性部位UPLC-Q-TOF-MS 分析

2.3.1 供試品溶液制備 取平臥菊三七乙酸乙酯萃取部位10 mg，精密稱定，置10 mL 量瓶中，加甲醇溶解，定容。于離心機中（14 000 r／min）10 min，取上清液，即得。

2.3.2 色譜條件 Welch Ultimate UHPLC XB-C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相乙腈（B）-0.1% 甲酸水（A），梯度洗脫（0～3 min，2%～10% B；3～12 min，10%～17.5% B；12～20 min，17.5%～18% B；20～27 min，18%～30%B；27～34 min，30%～60%B；34～39 min，60%～95% B；39～42 min，95% B；42～42.01 min，95%～2% B）；體積流量0.3 mL／min；柱溫45 ℃；進樣量3 μL。

2.3.3 質譜條件 采用ESI 離子源，在負離子模式下采集數(shù)據(jù)；噴霧電壓-4 500 V，離子源溫度（TEM）500 ℃；氣簾氣（CUR N2）172.375 kPa，霧化氣（GSI N2）和輔助氣（GS2 N2）均為344.75 kPa；質量掃描范圍為m／z：50～1 250；去簇電壓-100 eV，碰撞電壓-30 eV，碰撞電壓差10 eV；開啟動態(tài)背景扣除。

2.3.4 數(shù)據(jù)處理 采用AB Sciex 公司Analyst 1.6軟件進行數(shù)據(jù)采集、運用PeakView 軟件進行數(shù)據(jù)處理分析。結合文獻及通過Chemspider、Scifinder等數(shù)據(jù)庫對平臥菊三七乙酸乙酯萃取部位進行分析，推測其主要成分，結果見圖5、表5。

圖2 槲皮素裂解途徑及二級質譜圖Fig.2 The fragmentation pathway and the TOF-MS／MS spectra of quercetin

2.3.5 結構鑒定 槲皮素，分子式C15H10O7，負離子模式下，準分子離子峰［M-H］-m／z301.035 2，誤差為-2.2。在二級質譜中，存在一系列的二級碎片離子（273.033 2、178.997 0、151.003 1、149.025 3、107.015 5），其中碎片離子m／z273.041 0比母離子少28 Da，為槲皮素母核C 環(huán)上失去CO 的碎片；碎片離子m／z257.044 3比母離子少44 Da，為槲皮素母核C 環(huán)上失去CO 的碎片，碎片離子m／z151.003 6和m／z149.025 3為槲皮素RDA 裂解生成的碎片；槲皮素烯醇式互變異構為酮式結構，失去C7H6O2生成碎片離子m／z178.998 0。其裂解途徑圖見圖2。

黃酮苷元類化合物在質譜裂解過程中，母核C環(huán)中易失去羰基CO（28 Da）和CO2（44 Da）；存在鄰位羥基易失去H2O（18 Da）；母核C 環(huán)中易發(fā)生RDA 裂解生成m／z151.003 0（A 環(huán)有2個酚羥基）。其裂解途徑圖見圖2。

4，5-二咖啡?？鼘幩幔肿邮紺25H24O12，負離子模式下，準分子離子峰［M-H］-m／z515.119 5，誤差為0.4。在二級質譜中，存在一系列的二級碎片離子（353.087 5、335.075 9、191.055 7、179.034 7、135.045 0），其中碎片離子m／z353.087 5為4，5-二咖啡?？鼘幩?位酯鍵斷裂產生的，而m／z335.075 9進一步脫水所得。同時檢測到碎片離子m／z179.034 7和m／z191.055 6分別為咖啡酸和奎寧酸失去1個H（1 Da）產生的；碎片離子m／z173.045 2為m／z191.055 6失去H2O（18 Da）產 生的，m／z135.045 2為m／z179.034 2失去CO2（44 Da）產生的。其裂解途徑見圖3。

表5 乙酸乙酯部位UPLC-Q-TOF-MS 分析Tab.5 UPLC-Q-TOF-MS analysis of ethyl fraction

對香豆酸，分子式為C9H8O3，負離子模式下，準分子離子峰 ［M-H］-m／z163.040 1，誤差為1.8。在二級質譜中，存在一系列的二級碎片離子（163.035 4、119.050 1、117.033 3、93.034 8、91.055 4），其中碎片離子m／z163.035 4為m／z119.050 4失去CO2（44 Da）產生的，碎片離子m／z93.035 0為m／z119.050 4失去碳碳三鍵產生的。其裂解途徑見圖4。

3 討論

本實驗對平臥菊三七的提取方法，提取時間進行了考察，結果表明70% 乙醇回流提取2次，1.5 h／次最優(yōu)。同時對流動相、體積流量、柱溫、洗脫梯度、進樣量等進行了考察，最終確定檢測條件為流動相乙腈-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫；進樣量3 μL；體積流量0.3 mL／min。另對質譜掃描模式考察發(fā)現(xiàn)，負離子模式下分離度較好，基線平穩(wěn)，適合平臥菊三七化學成分的測定。

本實驗首次對平臥菊三七的抗補體活性進行研究，結果顯示平臥菊三七乙酸乙酯萃取部位的抗補體活性優(yōu)于陽性藥肝素鈉。為了進一步探討其藥效物質基礎，本實驗采用UPLC-Q-TOF-MS 技術對其活性成分進行分析。經分析推測出22個化合物，主要為酚酸類、黃酮類及香豆素類。以期為確定平臥菊三七抗補體活性的作用機制及作用靶點奠定物質基礎，為中藥藥效物質基礎研究工作提供新思路。

圖3 4，5-二咖啡酰奎寧酸裂解途徑及二級質譜圖Fig.3 The fragmentation pathway and the TOF-MS／MS spectra of quercetin isochlorogenic acid C

圖4 對香豆酸裂解途徑及二級質譜圖Fig.4 The fragmentation pathway and the TOF-MS／MS spectra of 4-hydroxycinnamic acid

圖5 乙酸乙酯部位總離子流圖Fig.5 The total ion chromatogram of ethyl acetate fraction