宋 舸，韋建華，陳 瑾，張妍妍，王慧敏，馮 旭

（廣西中醫(yī)藥大學，廣西南寧530001）

兩粵黃檀Dalbergia benthamiiPrain.為蝶形花亞科黃檀屬植物，藤本，有時為灌木。枝長，干時黑色，具有通經(jīng)活血的作用，常用于治療跌打損傷、筋骨疼痛等［1］。張禮行等［2］通過GC-MS 技術(shù)發(fā)現(xiàn)其中含有丁香酚甲醚、異丁香酚甲醚、欖香素等10種成分。韋建華等［3］通過柱色譜、重結(jié)晶等方法分離獲得14個化合物?；酐惸莸龋?］對比95%乙醇、丙酮、乙酸乙酯提取物發(fā)現(xiàn)，乙酸乙酯部位有相對優(yōu)異的抗氧化能力，并通過與阿卡波糖的對比，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯部位對α-葡萄糖苷酶有一定的抑制作用。陳思思等［5］用二倍稀釋法考察發(fā)現(xiàn)兩粵黃檀粗提物具有一定的抗菌作用，通過二甲苯、雞蛋清致模型腫脹發(fā)現(xiàn)其具有一定的抗炎作用。鑒于兩粵黃檀中相關(guān)活性成分復雜，單一含有量測定難以達到質(zhì)量控制的要求。因此，本研究建立了兩粵黃檀中6種成分含有量同時測定的方法，以期為其質(zhì)量控制提供更加全面、科學的依據(jù)。

1 材料

TGL-16B 高速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；TM-D 24UV 超純水儀（德國Millipore 公司）；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；KQ5200B 型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；安捷倫1260高效液相色譜儀（VWD 檢測器，四元高壓梯度泵，美國安捷倫公司）；SQP 電子天平［德國賽多利斯科學儀器（北京）有限公司）。

甘草酸對照品（批號G-003-191220）、甘草次酸對照品（批號G202002）購自合肥博美生物科技有限公司；土甘草A 對照品、4′-羥基-6-羥甲基-5，7-二甲氧基異黃酮對照品、大魚藤樹素甲醚對照品［3，6］、大魚藤樹酸甲酯對照品［3，7］（自制，歸一化法含有量在98%以上）。氯仿（分析純，西隴化工股份有限公司）；水為超純水；乙腈（德國默克公司）、甲醇（Fisher）、磷酸（西隴化工股份有限公司）均為色譜純。兩粵黃檀，信息見表1，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學壯醫(yī)藥學院韋松基教授鑒定為豆科植物黃檀屬兩粵黃檀Dalbergia benthamiiPrain.植物的莖。打粉過40目篩。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Waters-symmetry C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-甲醇（B）-0.2%磷酸（C），梯度洗脫，程序見表2；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長256 nm；進樣量10 μL。色譜圖見圖1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

表2 梯度洗脫程序Tab.2 Gradient elution programs

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.2 溶液配制

2.2.1 對照品溶液 精密稱取各對照品適量，加甲醇定容。配制各對照品質(zhì)量濃度分別為甘草酸1.25 mg／mL、土甘草A 0.573 mg／mL、4′-羥基-6-羥甲基-5，7-二甲氧基異黃酮0.276 mg／mL、大魚藤樹素甲醚 0.124 mg／mL、大魚藤樹酸甲酯0.120 mg／mL、甘草次酸0.180 mg／mL。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取藥材粉末1.0 g，精密加20 mL 氯仿，超聲（200 W、40 kHz）60 min，冷卻后用氯仿補足減失質(zhì)量，濾過，精密量取2 mL 濾液揮干后用甲醇定容至2 mL，微孔濾膜過濾。

2.3 線性關(guān)系考察 配制不同質(zhì)量濃度的對照品溶液，在“2.1”項條件下連續(xù)進樣，以質(zhì)量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸。結(jié)果見表3。表明各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好［8］。

表3 各成分線性關(guān)系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.4 精密度試驗 精密吸取“2.2.1”項下對照品溶液，在“2.1”項條件下連續(xù)進樣6次，甘草酸、土甘草A、4′-羥基-6-羥甲基-5，7-二甲氧基異黃酮、大魚藤樹素甲醚、大魚藤樹酸甲酯、甘草次酸峰面積RSD 分別為0.54%、0.34%、0.45%、1.3%、0.45%、0.53%。表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液（批號S7），在“2.1”項條件下，分別于2、4、6、8、10、12 h 進樣，甘草酸、土甘草A、4′-羥基-6-羥甲基-5，7-二甲氧基異黃酮、大魚藤樹素甲醚、大魚藤樹酸甲酯、甘草次酸RSD 分別為0.82%、0.51%、0.68%、0.60%、0.52%、1.4%。表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 重復性試驗 取6份兩粵黃檀藥材（批號S7）平行3次，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項條件下進樣，甘草酸、土甘草A、4′-羥基-6-羥甲基-5，7-二甲氧基異黃酮、大魚藤樹素甲醚、大魚藤樹酸甲酯、甘草次酸含有量RSD 分別為 0.78%、0.81%、0.85%、1.7%、0.84%、0.80%，表明該方法重復性良好。

2.7 加樣回收率試驗 精密稱取9份（批號S7，每份約0.50 g），分別按照藥材含有量的50%、100%、150%加入混合對照品溶液（質(zhì)量濃度分別為0.591 6、0.263 4、0.130 8、0.058 6、0.056 8、0.085 3 mg／mL）5.00、10.00、15.00 mL［6］。精密加入甲醇至20 mL，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項條件下進樣。結(jié)果見表4。

2.8 樣品含有量測定 取不同產(chǎn)地的兩粵黃檀藥材樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項條件下進樣，計算各產(chǎn)地6種成分的含有量，結(jié)果見表5。

3 討論

3.1 指標成分選擇 前期本實驗對兩粵黃檀氯仿部位進行液相分離制備獲得7種成分，對4種未知成分分別鑒定為甘草酸、大魚藤樹素甲醚、大魚藤樹酸甲酯、甘草次酸。3種已知成分為土甘草A、4′-羥基-6-羥甲基-5，7-二甲氧基異黃酮、異甘草素［3］，其中異甘草素于6 min 出峰不能與其他雜質(zhì)峰完全分離且含有量較少，無法達到分析要求。而甘草酸、土甘草A、4′-羥基-6-羥甲基-5，7-二甲氧基異黃酮、大魚藤樹素甲醚、大魚藤樹酸甲酯、甘草次酸，各成分在各產(chǎn)地含有量均符合分析要求，故將該種成分作為分析指標。

3.2 供試品制備方法

3.2.1 提取溶劑 分別采用水、甲醇、丙酮、乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、氯仿，7種溶劑進行考察。分別計算6種成分的含有量。其中，氯仿提取效果較好。

3.2.2 提取條件 分別采用超聲、回流、冷浸3種方法，相同體積氯仿提取進行考察。計算6種成分的含有量。其中超聲提取和回流提取效果較好，但超聲提取效果略好于回流提取。

3.2.3 提取時間 分別用氯仿進行30、60、90、120 min 超聲提取，計算6種成分的含有量。其中超聲60 min 和120 min 提取效果較好且接近，綜合其他因素考慮選用60 min 提取較為合理。

表4 各成分加樣回收率試驗結(jié)果（n=9）Tab.4 Results of recovery tests for various constituents（n=9）

表5 各成分含有量測定結(jié)果（mg／g， n=3）Tab.5 Results of content determination of various constituents（mg／g， n=3）

3.2.4 料液比 分別考察了1 ∶ 10、1 ∶ 20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50不同料液比。計算6種成分的含有量。其中1 ∶20的含有量均明顯高于其他比例。

3.3 測定條件選擇

3.3.1 色譜柱 本實驗分別采用依利特、Waters、熱電、Inerstil 等不同廠家色譜柱，其中Waters 分離效果最好，重復性好，故采用該色譜柱。

3.3.2 流動相 由于各成分極性差異較大，等度洗脫難以達到分離要求，所以采用梯度洗脫，其中甲醇和0.2%磷酸梯度洗脫雖然達到分析要求，但保留時間過長，所以采用乙腈、甲醇、0.2% 磷酸3相梯度洗脫。

3.3.3 測定波長 將供試品溶液進行全波長掃描，根據(jù)6種成分各最大吸收波長（甘草酸251 nm；土甘草A 260 nm；4′-羥基-6-羥甲基-5，7-二甲氧基異黃酮256 nm；大魚藤樹素甲醚270 nm；大魚藤樹酸甲酯270 nm；甘草次酸264 nm）及各產(chǎn)地6種成分含有量差異、各峰峰形等，確定檢測波長為256 nm［9］。

4 結(jié)論

中藥成分復雜多樣，研究單一成分難以對其定性定量分析，不能全面的對中藥材進行系統(tǒng)的質(zhì)量控制，所以本實驗采用多成分定量分析［10］。其中采用HPLC 定量測定干擾較少、靈敏度高、結(jié)果準確、重復性好。本實驗首次對兩粵黃檀藥材當中的6種成分進行同時測定。結(jié)果表明，各產(chǎn)地成分差異較為明顯，其中4′-羥基-6-羥甲基-5，7-二甲氧基異黃酮含有量差異非常明顯；藥材中所含的新黃酮類化合物為大魚藤樹素甲醚、大魚藤樹酸甲酯等，目前研究發(fā)現(xiàn)具有新黃酮類母核的化合物具有較強的藥理活性［11-12］。后續(xù)將結(jié)合藥效學進行研究，以期為兩粵黃檀質(zhì)量控制方法的建立，提供一定的科學依據(jù)。