萬茜淋 任雨賀呂瑞娜李 玉陳長寶?劉淑瑩

（1.長春中醫(yī)藥大學吉林省人參科學研究院，吉林 長春130117；2.吉林農(nóng)業(yè)大學食藥用菌教育部工程研究中心，吉林 長春130118；3.中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究院，吉林 長春130112；4.中國科學院長春應(yīng)用化學研究所，吉林 長春130022）

香菇Lentinus edodes是香菇屬的一個種，隸屬于真菌界，擔子菌門，蘑菇綱，多孔菌目，多孔菌科。香菇素有山珍之王之稱，亦是著名的藥食同源菌種，味甘、性平，在我國傳統(tǒng)醫(yī)學中用于治療食欲減退、少氣乏力等癥［1］。香菇多糖（Lentinan，LNT）是從香菇中提取分離得到的結(jié)構(gòu)以β-（1→3）-D-葡聚糖殘基為主鏈的成分，也是香菇的主要活性成分。早在1969年，日本學者Chihara 等就研究發(fā)現(xiàn)香菇多糖的抗腫瘤活性，從研究到臨床應(yīng)用已近50年時間，香菇多糖一直是香菇中被學者們重點關(guān)注的活性成分［2］。

2017年2月，國家癌癥中心發(fā)布了中國最新癌癥數(shù)據(jù)，全國每天約1萬人確診癌癥，每分鐘約7人確診患癌。神經(jīng)膠質(zhì)瘤，簡稱膠質(zhì)瘤，也稱為膠質(zhì)細胞瘤，是最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，是一種遺傳易感性和環(huán)境致癌因素極高的腦部惡性腫瘤，約占所有顱內(nèi)原發(fā)腫瘤的一半［3］。目前，膠質(zhì)瘤的首選治療手段為手術(shù)切除，但是由于其與正常腦組織無明顯界限，難以達到細胞學上的徹底切除，術(shù)后復(fù)發(fā)快、復(fù)發(fā)率高、生存期短［4］。因此，針對神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展，從根本上進行新型抗腫瘤藥物的研發(fā)刻不容緩。

已有研究發(fā)現(xiàn)，香菇多糖具有抗腫瘤［5］、抗氧化［6］、抗抑郁［7］、抗衰老［8］、抗病毒［9］、抗輻射［10］以及免疫功能調(diào)節(jié)［11］等多種生物活性，并已經(jīng)作為免疫增強劑部分應(yīng)用于臨床治療，可見香菇多糖在學術(shù)及臨床水平上，受到各國廣泛的關(guān)注和認可。本實驗以人神經(jīng)膠質(zhì)瘤SHG-44細胞為研究對象，考察香菇多糖對細胞增殖、周期、凋亡以及遷移的影響，為進一步研究香菇多糖抗腫瘤的作用機制及作用靶點提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 細胞株 人神經(jīng)膠質(zhì)瘤SHG-44細胞系，購于中國科學院上海細胞生物學研究所，由本實驗室傳代凍存。

1.2 試藥 香菇多糖，購于上海源葉生物科技有限公司，批號C17S9Y69375，含有量＞98%，褐色粉末。DMEM 高糖培養(yǎng)基（美國Sigma 公司，批號11965-084）；超級新生牛血清（NBS）（杭州四季青生物工程材料有限公司，批號22011-8615）；胰蛋白酶（上海生工生物工程有限公司，批號A100260-0010）；Annexin V-FITC／PI 細胞凋亡檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)有限公司，批號KGA108-1）；DAPI 染色液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號C1005）；細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號C1052）；Cell Counting Kit-8試劑盒（CCK-8 Kit）（Med Chem Express USA，批號HY-K0301）；青鏈霉素雙抗（上海生工生物工程有限公司，批號E607011-0100）。

1.3 儀器 倒置熒光顯微鏡（日本Nikon Ri2公司）；酶標儀（瑞士TECAN）；二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo BB150）；四度醫(yī)用冷藏箱（海爾SC-242D）；雙人單面超凈工作臺（蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司SW-CJ-1C）；全自動立式高壓滅菌鍋（致 微 GR60DA）；臺式離心機（美 國ThermoST8R）；電熱恒溫水浴鍋（精宏DK-S26）；-20度冷凍冰柜（揚子BD／BC-148）；加熱鼓風干燥箱（精宏DHG-9240A）；流式細胞儀（美國BD CantoⅡ）。

2 方法

2.1 神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系SHG-44傳代培養(yǎng) 人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系SHG-44，培養(yǎng)于含10% NBS 的DMEM 培養(yǎng)基，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，5% CO2培養(yǎng)，待細胞密度達到90%時，繼續(xù)傳代。

2.2 細胞增殖檢測實驗 采用CCK-8法檢測香菇多糖對SHG-44細胞增殖的影響［12］。取對數(shù)生長期的SHG-44細胞，每孔接種6 000個細胞于96孔板，培養(yǎng)24 h。棄舊培養(yǎng)基，每孔加入100 μL 含藥培養(yǎng)基，使藥物濃度分別為0、0.25、0.50、1、2、4 mg／mL［13-14］，同一質(zhì)量濃度設(shè)5個復(fù)孔。繼續(xù)分別培養(yǎng)24、48、72 h，每孔加入10 μL 的CCK-8溶液繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標儀測定吸光值A(chǔ)（450 nm 波長）。根據(jù)以下公式計算，活性抑制率=［（A0加藥組-A加藥組）／（A0加藥組-A空白組）］×100%，lgIC50=lg 最大劑量-lg（最大劑量／相臨劑量）［陽性反應(yīng)率之和-（3-最大陽性反應(yīng)率-最小陽性反應(yīng)率）／4］。

2.3 細胞周期檢測實驗 選用細胞周期檢測試劑盒檢測SHG-44細胞周期。取對數(shù)生長期的細胞，每孔4×105個接種于6孔板，培養(yǎng)24 h。棄去舊培養(yǎng)基，每孔加入2 mL 含香菇多糖的新鮮培養(yǎng)基，使藥物濃度分別為0、2、4 mg／mL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細胞，按照試劑盒操作步驟進行實驗。

2.4 顯微鏡觀察細胞形態(tài) 取對數(shù)生長期的SHG-44細胞，鋪板及培養(yǎng)條件同2.3項下。香菇多糖加藥濃度分別為0.00、2.295 mg／mL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并拍照。

2.5 細胞凋亡檢測實驗 利用Annexin V-FITC／PI雙染試劑盒檢測SHG-44細胞凋亡。取對數(shù)生長期的SHG-44細胞，鋪板及培養(yǎng)條件同2.3項下，按照試劑盒操作步驟進行實驗，用流式細胞儀檢測分析。

2.6 細胞遷移檢測實驗 采用細胞劃傷愈合實驗［15］檢測細胞遷移。取對數(shù)生長期的SHG-44細胞，接種于6孔板中，待細胞密度增殖至80%，用移液器吸頭將細胞以井字劃傷，PBS 洗滌，加藥濃度分別為0、2.295 mg／mL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，置于顯微鏡下觀察并拍照。

2.7 統(tǒng)計學分析 統(tǒng)計學分析取3次重復(fù)實驗結(jié)果，上述實驗所得數(shù)據(jù)均使用Microsoft Excel 2010和SPSS 7.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行統(tǒng)計，數(shù)據(jù)均以（）表示，采用單因素方差分析、t檢驗，P＜0.05差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 香菇多糖對SHG-44細胞增殖的影響 由表1可見，香菇多糖對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞SHG-44的增殖抑制作用呈濃度依賴性增加。香菇多糖處理SHG-44細胞48 h，抑制率IC50值為2.295 mg／mL，處理72 h抑制率IC50值為2.804 mg／mL。由于24 h 的最大抑制率未達到50%，因此IC50值僅作為參考，故選用48 h 的IC50值2.295 mg／mL 進行后續(xù)實驗。

表1 香菇多糖對SHG-44細胞增殖的影響（， n=3）Tab.1 Effects of LNT on cellular proliferation of SHG-44（， n=3）

表1 香菇多糖對SHG-44細胞增殖的影響（， n=3）Tab.1 Effects of LNT on cellular proliferation of SHG-44（， n=3）

注：與0 mg／mL 香菇多糖組比較，??P＜0.01

3.2 香菇多糖對SHG-44細胞周期的影響 如表2所示，香菇多糖作用SHG-44細胞48 h 后，與0 mg／mL香菇多糖組比較，4 mg／mL 香菇多糖組細胞G1期比例顯著升高（P＜0.05）；2、4 mg／mL 香菇多糖組細胞S 期比例顯著減少（P＜0.05，P＜0.01），而G2期無明顯變化。香菇多糖能夠抑制細胞從G1期向S 期轉(zhuǎn)變，將細胞周期阻滯于G0／G1期，從而抑制SHG-44細胞的增殖。

表2 香菇多糖對SHG-44細胞周期的影響（%，， n=3）Tab.2 Effects of LNT on cell cycle of SHG-44（%，，n=3）

表2 香菇多糖對SHG-44細胞周期的影響（%，， n=3）Tab.2 Effects of LNT on cell cycle of SHG-44（%，，n=3）

注：與0 mg／mL 香菇多糖組比較，?P＜0.05，??P＜0.01

3.3 香菇多糖對SHG-44細胞形態(tài)學的影響 如圖1所示，香菇多糖處理48 h 后，顯微鏡常光觀察，0 mg／mL 香菇多糖組細胞生長狀態(tài)良好，形態(tài)完整，細胞數(shù)量相對較多，大小均一，細胞密集且鋪展生長，連接緊密；2.295 mg／mL 香菇多糖組細胞數(shù)量顯著減少，密度降低，且懸浮細胞逐漸增多，細胞形態(tài)皺縮，呈圓珠狀，細胞核凸顯，形態(tài)發(fā)生變異。

圖1 香菇多糖對SHG-44細胞形態(tài)學的影響Fig.1 Effects of LNT on morphology of SHG-44 cells

3.4 香菇多糖對SHG-44細胞凋亡的影響 圖2為流式細胞儀檢測的凋亡散點圖，Q1、Q2、Q3、Q4 4個象限分別代表死細胞、晚期凋亡細胞、活細胞、早期凋亡細胞。如表3所示，可進一步看出香菇多糖作用SHG-44細胞48 h 后，細胞的晚期凋亡及總凋亡比例有升高，但統(tǒng)計結(jié)果并未出現(xiàn)顯著性差異。

圖2 香菇多糖對SHG-44細胞凋亡的影響Fig.2 Effects of LNT on apoptosis of SHG-44 cells

表3 香菇多糖對SHG-44細胞凋亡的影響（%，，n=3）Tab.3 Effects of LNT on apoptosis of SHG-44 cells（%，，n=3）

表3 香菇多糖對SHG-44細胞凋亡的影響（%，，n=3）Tab.3 Effects of LNT on apoptosis of SHG-44 cells（%，，n=3）

3.5 香菇多糖對SHG-44細胞遷移能力的影響如表4、圖3所示，當SHG-44細胞處理48 h 后，0 mg／mL香菇多糖組細胞向劃傷處遷移生長，2.295 mg／mL 香菇多糖組細胞向內(nèi)生長較少，并且劃傷處寬度略有增加；與0 mg／mL 香菇多糖組比較，2.295 mg／mL 香菇多糖組細胞劃傷處面積顯著縮?。≒＜0.01）。

圖3 香菇多糖對SHG-44細胞遷移能力的影響Fig.3 Effects of LNT on migration ability of SHG-44 cells

表4 香菇多糖對SHG-44細胞遷移能力的影響（，n=3）Tab.4 Effects of LNT on migration ability of SHG-44 Cells（， n=3）

表4 香菇多糖對SHG-44細胞遷移能力的影響（，n=3）Tab.4 Effects of LNT on migration ability of SHG-44 Cells（， n=3）

注：與0 mg／mL 香菇多糖組比較，??P＜0.01

4 討論

香菇，作為與人類生活密切相關(guān)的大型真菌，是應(yīng)用最為廣泛的食藥用菌資源。中國是人工栽培香菇的發(fā)源地和世界香菇第一生產(chǎn)大國，目前，我國香菇年產(chǎn)量約為10萬噸，占世界總產(chǎn)量的90%以上［16］。近年來，隨著中藥受到越來越多的關(guān)注，醫(yī)學界逐漸采用中藥輔助治療多種疾病，中藥制劑也作為放化療之后改善機體免疫力、降低藥物不良反應(yīng)的功能性藥物［17-20］。對于香菇多糖的藥理活性研究，世界各國均在不同程度的開展。有研究發(fā)現(xiàn)，香菇多糖對小鼠肝癌細胞H22、小鼠肛門纖維肉瘤細胞S180、人肝癌細胞HepG2、人口腔上皮癌細胞株KB-3-1、人宮頸癌細胞株HeLa 等都有不同程度的抑制作用，并且可作為輔助劑與抗癌藥物聯(lián)用，發(fā)揮腫瘤抑制作用［21-23］。同時，在腫瘤免疫學方向，香菇多糖能夠選擇性地抑制黑色素瘤的炎癥激活［24］。結(jié)合香菇多糖在提高免疫功能的作用機制研究，很可能是通過激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和NF-κB 2個信號途徑調(diào)節(jié)免疫功能［25］。綜合近幾年研究成果，真菌提取物能夠抑制多種腫瘤細胞的增殖，并誘導(dǎo)其凋亡，其機制與Wnt、NK-κB、MAPK、線粒體凋亡等多種信號通路相關(guān)，靶點包括了p38、Bcl-2、c-jun、IκB、βcatenin、Akt、ROS 等多種與細胞生物活動密切相關(guān)的蛋白［26-27］。

本研究采用CCK-8法檢測香菇多糖對人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤SHG-44細胞增殖能力的作用。CCK-8方法原理與MTT 相同，但操作方便，不用中途吸取細胞上層液體，避免細胞流失造成的細胞增殖數(shù)量誤差，所得數(shù)據(jù)更加精確可靠。實驗結(jié)果表明，香菇多糖能夠顯著抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤SHG-44細胞的增殖活性，并且呈劑量依賴；同一濃度分別培養(yǎng)24、48、72 h，與0 mg／mL 香菇多糖組比較，香菇多糖組的抑制作用顯著（P＜0.05，P＜0.001），說明給藥后細胞活性受到明顯抑制，增殖能力受到顯著影響。因此，后續(xù)實驗中我們選取48 h 作為時間點，在不同濃度設(shè)置下，進一步探究香菇多糖的抗腫瘤作用機制。

隨后，研究香菇多糖對SHG-44細胞周期的影響。研究發(fā)現(xiàn)，香菇多糖組細胞周期有顯著的變化，G0／G1期顯著增加，S 期明顯降低（P＜0.01），說明香菇多糖可通過調(diào)控細胞周期來抑制腫瘤細胞的增殖能力。因此，進一步檢測處理48 h時，2.295 mg／mL 香菇多糖對細胞凋亡的影響。

利用顯微鏡常光下觀察到藥物對SHG-44細胞形態(tài)有很大影響，細胞呈串珠狀，濃度明顯低于對照組。通過DAPI 染色，在熒光顯微鏡下觀察細胞核中有凋亡小體出現(xiàn)。進一步用Annexin V-FITC／PI 雙染檢測細胞凋亡情況，經(jīng)分析得出香菇多糖能夠誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡，但并未表現(xiàn)出顯著性差異。

最后，通過劃傷愈合實驗和顯微鏡分析觀察藥物對細胞遷移能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0 mg／mL 香菇多糖組細胞明顯向劃傷處遷移生長；而2.295 mg／mL香菇多糖組細胞密度稀疏，不但不向劃傷處生長，反而劃傷區(qū)域面積顯著增加（P＜0.01）?？赡芡ㄟ^抑制SHG-44細胞的遷移作用來控制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。

綜上所述，本實驗對香菇多糖對神經(jīng)膠質(zhì)瘤SHG-44細胞的抗腫瘤作用進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其抗腫瘤作用明顯，機制是可能通過對SHG-44細胞G0／G1期阻滯，影響細胞活力，抑制細胞增殖，并一定程度的誘導(dǎo)腫瘤細胞進行程序性凋亡；另一方面，還能抑制腫瘤細胞的遷移，達到減緩腫瘤細胞向外擴散的作用。同時，依據(jù)近年來研究成果，香菇多糖很有可能參與機體免疫系統(tǒng)的調(diào)控［28］。因此，香菇多糖抗腫瘤作用機制的相關(guān)研究值得更深入探索，對以香菇多糖為主要成分的保健食品、新型抗腫瘤藥物及相關(guān)特殊疾病臨床輔助用藥的研發(fā)具有重要的理論指導(dǎo)意義。