李穎霞， 姜利彬， 徐海燕， 樊周沛， 何益信， 溫洪濤

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科， 河南 鄭州 450000)

果糖(fructose)是與葡萄糖同分異構(gòu)的單糖；近幾十年來，基于果糖具有血糖生成指數(shù)較低及高甜度等優(yōu)點，居民以蔗糖和高果糖玉米糖漿這2種方式攝取的果糖的量正在逐年增加[1-2]。在人體中，果糖主要在肝臟中代謝為果糖-1-磷酸，隨后以磷酸二羥丙酮和磷酸甘油醛的形式進(jìn)入糖酵解、脂質(zhì)合成和糖異生等循環(huán)過程[3]。越來越多的實驗研究證明，攝入過多的果糖能顯著增加體重，促進(jìn)內(nèi)臟肥胖、血脂異常和胰島素抵抗等代謝綜合征的發(fā)生風(fēng)險[4-6]。然而，高果糖攝入是如何引起病理改變的分子機(jī)制尚不清楚。

肥胖是許多疾病，如糖尿病的明確危險因素。當(dāng)前體脂肪細(xì)胞增殖和分化異常增多時，會引起體內(nèi)脂肪組織過多的積累和內(nèi)分泌紊亂，繼而引發(fā)糖尿病和高血壓等疾病[7-9]。由此可見，研究前體脂肪細(xì)胞的增殖和分化過程有助于我們了解疾病的分子機(jī)制，同時，在臨床上適度抑制前體脂肪細(xì)胞分化可以達(dá)到預(yù)防及改善疾病的效果，對于研究預(yù)防和治療肥胖及代謝性疾病具有重大的意義。

過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)[10-11]和CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(CCAAT/enhancer binding proteins，C/EBPs)是目前已知的調(diào)節(jié)前體脂肪細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄因子[12]，它們能夠促進(jìn)下游脂質(zhì)積累及脂質(zhì)代謝相關(guān)的酶，如脂肪酸結(jié)合蛋白4(fatty acid binding protein 4，F(xiàn)ABP4;又稱脂肪細(xì)胞蛋白2，adipocyte protein 2, aP2)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthesis，F(xiàn)AS)和脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase，LPL)等的表達(dá)[13]，對于調(diào)控前體脂肪細(xì)胞的分化是十分重要的。Zubiría等[14]在正常成年雄性大鼠的飲水中加入含有10% (W/V)果糖的食物(fructose-rich diet，F(xiàn)RD)，并評估內(nèi)臟脂肪組織(visceral adipose tissue，VAT)墊體積變化及分離的基質(zhì)-血管段(stromal-vascular fraction，SVF)前體脂肪分化及增殖情況，在流式細(xì)胞學(xué)方法證實VAT前體細(xì)胞群數(shù)量在各組之間沒有差異的情況下，連續(xù)喂養(yǎng)3周后發(fā)現(xiàn)，給予果糖喂養(yǎng)的大鼠血漿中胰島素、甘油三酯和瘦素的水平顯著增加，同時來源于腹膜后脂肪組織(retroperitoneal adipose tissue，RPAT)脂肪前體細(xì)胞(adipocyte precursor cells，APCs)中Zpf423和PPARγ2的表達(dá)水平顯著增加；飼養(yǎng)8周后，RPAT質(zhì)量增加和APCs體積增大[15]，表明果糖對前體脂肪細(xì)胞的增殖和分化具有直接影響。

研究表明胰島素誘導(dǎo)的Akt信號通路是脂肪分化過程中的核心信號通路[16-17]。鑒于果糖和肥胖之間的潛在聯(lián)系，且果糖在體外如何調(diào)控前體脂肪細(xì)胞分化尚不清楚，我們對3T3-L1細(xì)胞模型進(jìn)行果糖誘導(dǎo)，通過油紅O染色、RT-qPCR和Western blot實驗檢測前體脂肪細(xì)胞分化期間相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)變化，進(jìn)一步闡明果糖對3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化過程的影響及具體作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1細(xì)胞株 3T3-L1細(xì)胞系購自ATCC細(xì)胞庫(ATCC?CL-173TM)。

1.2試劑 果糖(Sigma-Aldrich，CAS：108311-21-3)；胰蛋白酶、DMEM高糖培養(yǎng)基(葡萄糖4.5 g/L)及優(yōu)質(zhì)胎牛血清(Gibco)；蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)和II 抗(上海碧云天)；抗PPARγ(# 2435)、aP2(# K1708)、p-Akt(# 4060P)和Akt(# 9272)抗體(Cell Signaling Technology)；3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX)、油紅O、抗β-肌動蛋白抗體、地塞米松、Akt特異性阻斷劑LY294002(# L9908)及胰島素(Sigma)；實時熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa)；TRIzol試劑(Life Technology)。

2 方法

2.13T3-L1細(xì)胞的培養(yǎng)并誘導(dǎo)分化 在37 ℃、飽和濕度、5% CO2條件下培養(yǎng)3T3-L1細(xì)胞，并將細(xì)胞分成空白對照(control)組、誘導(dǎo)分化(differentiation medium，DM)組以及誘導(dǎo)分化+果糖處理組(DM+fructose組)，處理組果糖的終濃度是1 g/L。細(xì)胞以1×109/L密度接種于6孔板上，待細(xì)胞100%融合并接觸抑制2 d，利用經(jīng)典雞尾酒方法[18]進(jìn)行誘導(dǎo)分化：含有0.5 mmol/L IBMX、1.0 μmol/L地塞米松、1 mg/L胰島素和10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞2 d，隨后換成含1 mg/L胰島素和10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每2 d換培養(yǎng)液1次，直到分化成熟。

2.2油紅O染色及定量 PBS洗滌細(xì)胞3次后，在室溫條件下用4%多聚甲醛固定30 min，再次用PBS洗滌3次并干燥。加入油紅O工作液室溫孵育30 min，雙蒸水沖洗2次后用顯微鏡觀察。為了量化細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量，用等量的100%異丙醇進(jìn)行油紅O萃取，最后在波長510 nm處測量吸光度(A)值。

2.3RT-qPCR 根據(jù)TRIzol試劑提取誘導(dǎo)分化的細(xì)胞總RNA。具體操作方法基于TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說明。使用小鼠GAPDH作為內(nèi)參照，并使用cDNA的第1鏈為作為模板，通過real-time PCR檢測基因表達(dá)。引物序列見表1。大致反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性5 s、64 ℃退火延伸30 s，共40個循環(huán)。

2.4Western blot 實驗 當(dāng)接種后的3T3-L1細(xì)胞培

表1 RT-qPCR實驗的引物序列

Plin2: perilipin-2.

養(yǎng)至80%覆蓋時，通過上訴方法誘導(dǎo)分化。加入裂解緩沖液，4 ℃靜置30 min, 超聲破碎30 s，12 000×g離心20 min，取上清。通過SDS-PAGE分離總蛋白并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用5%的脫脂牛奶(用含0.1% Tween-20的PBST稀釋)封閉1.5 h，加入抗PPARγ、aP2、p-Akt和Akt抗體，在4 ℃過夜后，PBST沖洗3次，加入第 II 抗體，在室溫下孵育1 h，再用PBST漂洗3次。用顯影劑將PVDF膜著色并曝光到X射線膠片上，用ImageJ 1.48軟件進(jìn)行灰度分析。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)處理。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)的形式呈現(xiàn)，多組間比較采用單因素方差分析，各組均數(shù)間的兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 果糖促進(jìn)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化

為探究果糖對3T3-L1細(xì)胞脂肪分化過程的調(diào)控作用，在誘導(dǎo)分化的3T3-L1細(xì)胞中加入1 g/L果糖進(jìn)行干預(yù)，收獲自誘導(dǎo)分化開始后3 d的細(xì)胞。Western blot分析3T3-L1細(xì)胞中分化標(biāo)志蛋白PPARγ和aP2的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與DM組比較，DM+fructose組細(xì)胞內(nèi)的PPARγ和aP2蛋白表達(dá)水平在第3天顯著上調(diào)(P<0.01),見圖1A。

油紅O染色結(jié)果顯示，DM+fructose組中脂肪細(xì)胞的體積增加，脂滴在胞質(zhì)內(nèi)的積累量也明顯增加;定量發(fā)現(xiàn)DM+fructose組中脂質(zhì)的積累量顯著增加(P<0.01)，見圖1B。同時，RT-qPCR結(jié)果顯示，DM+fructose組中，細(xì)胞內(nèi)Plin2的mRNA表達(dá)水平上調(diào)32%(P<0.01)，C/EBPα的mRNA表達(dá)水平上調(diào)15%(P<0.01)，C/EBPβ的mRNA表達(dá)水平上調(diào)23%(P<0.05)，見圖1C。以上實驗結(jié)果提示果糖對3T3-L1細(xì)胞的脂肪分化具有促進(jìn)作用。

2 果糖激活3T3-L1前脂肪細(xì)胞的Akt信號通路

許多研究已經(jīng)證實，Akt信號通路在脂肪分化中起著重要作用[19]。我們預(yù)先利用果糖處理細(xì)胞30 min，Western blot檢測p-Akt和Akt的蛋白水平變化，觀察果糖對細(xì)胞Akt信號通路的影響。結(jié)果顯示,實驗(DM+fructose)組的細(xì)胞中p-Akt水平比對照組顯著增加(P<0.01)，而使用Akt的特異性阻斷劑LY294002(10 μmol/L)預(yù)先處理1 h后，Akt的磷酸化被抑制，恢復(fù)至本底水平(P<0.01),見圖2。這提示果糖能快速激活3T3-L1細(xì)胞的Akt信號通路。

3 果糖通過Akt信號通路促進(jìn)3T3-L1脂肪分化

分析以上結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，果糖可激活脂肪細(xì)胞中的Akt信號通路，但具體調(diào)控細(xì)節(jié)尚不可知。因此，我們加入Akt的特異性阻斷劑 LY294002，來觀察果糖是如何影響 3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化。利用 LY294002(10 μmol/L)預(yù)先處理細(xì)胞 1 h，再將DM組和DM+Fructose組中的3T3-L1細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化。結(jié)果顯示，使用 LY294002 阻斷Akt通路后，脂肪分化的細(xì)胞標(biāo)志物PPARγ和aP2的誘導(dǎo)表達(dá)恢復(fù)至本底水平(P<0.01)，見圖3A;同時，油紅O染色結(jié)果顯示，誘導(dǎo)細(xì)胞(DM+fructose組)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)脂質(zhì)積累和形成脂肪滴，而實驗組(DM+fructose+LY294002組)幾乎沒有脂肪細(xì)胞形成，見圖3B，證實Akt 信號通路在脂肪分化中起主導(dǎo)作用。該結(jié)果提示，果糖對Akt信號通路的活化與其對3T3-L1脂肪分化的促進(jìn)作用可能直接相關(guān)，并呈正性調(diào)控作用。

討 論

盡管已有臨床數(shù)據(jù)證實，果糖較葡萄糖更能促進(jìn)肥胖并且降低肥胖患者體內(nèi)的胰島素敏感性[20]。在同等高濃度1～4.5 g/L狀態(tài)下，果糖的運輸量遠(yuǎn)高于葡萄糖。而在低濃度0.1 g/L時，果糖可以比葡萄糖更加有效地被吸收，與低濃度果糖依賴葡萄糖轉(zhuǎn)運體5(glucose transporter type 5，GLUT5)的刺激作用有關(guān)[21]。但是果糖對于脂肪分化形成及脂質(zhì)代謝的作用機(jī)制尚未明確。攝入的果糖中約50%～60%在肝臟代謝，20%在腎臟中代謝，其余部分到達(dá)外周組織，如脂肪中[22]。由于果糖的代謝不受果糖-1,6-二磷酸酶的限制，因此肝臟中只有一小部分果糖轉(zhuǎn)化為糖原或者乳酸，大部分果糖都會進(jìn)入脂質(zhì)新生的代謝途徑中[23]，進(jìn)而再次循環(huán)代謝產(chǎn)生大量的甘油三酯和膽固醇。

Figure 1.Fructose promoted adipose differentiation of 3T3-L1 preadipocytes. A: the protein expression of PPARγ and aP2 in the 3T3-L1 cells after treated with fructose at 1 g/L for 3 d; B: the differentiation process of the 3T3-L1 cells after adding 1 g/L fructose for 14 d (oil red O staining, the scale bar=100 μm; isopropanol was used to extract oil red O and the absorbance of 510 nm was detected); C: RT-qPCR was used to detect the relative mRNA expression levels of Plin2, C/EBPα and C/EBPβ in the 3T3-L1 cells after adding fructose at 1 g/L for 3 d to induce adipose differentiation. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group or DM group.

圖1 果糖促進(jìn)3T3-L1細(xì)胞的脂肪分化

Figure 2.Fructose activated Akt signaling pathway in the 3T3-L1 preadipocytes. The 3T3-L1 cells were treated with 1 g/L fructose or 1 g/L fructose+10 μmol/L LY294002 for 30 min, and the protein level of p-Akt was determined by Western blot. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group or DM group;##P<0.01vsDM+fructose group.

圖2 果糖激活3T3-L1細(xì)胞中的Akt信號通路

Figure 3.Fructose promoted adipose differentiation of 3T3-L1 cells through Akt signaling pathway. A: the protein levels of PPARγ and aP2 were determined by Western blot; B: the differentiation process of the 3T3-L1 cells (oil red O staining, the scale bar=100 μm; isopropanol was used to extract oil red O and the absorbance of 510 nm was detected). Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group or DM group;##P<0.01vsDM+fructose group.

圖3 果糖通過激活A(yù)kt信號途徑促進(jìn)3T3-L1細(xì)胞的脂肪分化

脂肪前體細(xì)胞可在促脂肪生成信號刺激下向脂肪細(xì)胞分化，獲得對胰島素的敏感性，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的積累。本研究中，我們研究了果糖對3T3-L1細(xì)胞脂肪分化的影響及Akt信號通路在3T3-L1前體脂肪細(xì)胞分化中發(fā)揮重要作用。我們發(fā)現(xiàn)果糖促進(jìn)3T3-L1前體脂肪細(xì)胞分化，這種作用可能是通正性調(diào)節(jié)Akt信號通路來實現(xiàn)，提示果糖可能是治療疾病的新靶點，對于肥胖發(fā)病機(jī)制的探究也具有一定的理論意義。但本實驗基于體外環(huán)境的細(xì)胞實驗，較高的果糖濃度在正常生理條件下是不存在的。因此，未來需要借助更加完善和深入的臨床實驗來佐證當(dāng)前研究結(jié)果。

3T3-L1細(xì)胞可高效利用果糖。在本研究中，我們對誘導(dǎo)分化的脂肪細(xì)胞進(jìn)行油紅O染色及定量研究，發(fā)現(xiàn)DM+fructose組中細(xì)胞內(nèi)脂滴明顯多于空白對照組和DM組。CEBPs和PPARγ是調(diào)控如ACC、FAS、aP2和GLUT4等靶基因的重要轉(zhuǎn)錄因子[24]。為了進(jìn)一步探討果糖促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化的可能機(jī)制，本實驗對分化的早期標(biāo)志物C/EBPα、C/EBPβ和Plin2的mRNA進(jìn)行RT-qPCR驗證及PPARγ和aP2的蛋白表達(dá)量改變進(jìn)行檢測。實驗證明給予1 g/L的果糖干預(yù)可以顯著上調(diào)脂肪細(xì)胞C/EBPα、C/EBPβ和Plin2的mRNA與PPARγ和aP2蛋白的表達(dá)。

Akt信號途徑在胰島素的靶組織中發(fā)揮傳導(dǎo)信號、促進(jìn)組織對糖的攝取，維持正常的糖代謝和脂肪組織形成中起重要作用[25]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)Akt是參與調(diào)控脂肪定向分化的信號通路，果糖能快速激活3T3-L1細(xì)胞的Akt信號通路。在以往研究中，Yang等[26]發(fā)現(xiàn)當(dāng)PI3K-Akt信號通路被抑制之后，間充質(zhì)干細(xì)胞會出現(xiàn)胰島素耐受和脂肪分化會受到影響。胰島素和其信號通路下游分子IRS-1、PI3K-Akt以及CREB都是脂肪分化的關(guān)鍵調(diào)控因子[27-28]，進(jìn)一步佐證了本實驗的研究結(jié)果。

總之，本研究在體外環(huán)境中證實果糖正性調(diào)控3T3-L1脂肪細(xì)胞的分化，并可能是通過激活A(yù)kt信號通路發(fā)揮促進(jìn)作用。這為闡明特定病理生理條件下果糖的生物學(xué)效應(yīng)和作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，也為由肥胖及相關(guān)并發(fā)癥的臨床治療提供一定的理論依據(jù)。此外，本研究所使用的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基目的是激活和誘導(dǎo)3T3-L1的脂肪分化，研究中使用的果糖同樣也具有該功能，因此果糖和DM之間是否會存在一定的聯(lián)合作用或者協(xié)同作用，將會在今后的研究中深入探究。