薛 璟， 鮑紅光， 鄭立紅， 何 蘭， 代云峰， 趙大龍， 潘洪明△， 李國鋒△

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 1醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院, 2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 黑龍江 齊齊哈爾 161006)

缺氧是腫瘤微環(huán)境的一個重要特征，現(xiàn)已被證實在肺癌、乳腺癌和肝癌等諸多實體瘤腫瘤細胞的增殖、浸潤與轉(zhuǎn)移等多種惡性生物學(xué)行為的發(fā)生過程中發(fā)揮著重要作用，缺氧越嚴(yán)重，腫瘤的預(yù)后越差[1-3]。因此，針對缺氧微環(huán)境的深入研究，有助于進一步了解腫瘤的生長特性，對腫瘤的診療具有重大意義。

胚胎軟骨發(fā)育基因1(differentiated embryonic chondrocyte gene 1, DEC1)屬于堿性螺旋-環(huán)-螺旋(basic Helix-Loop-Helix, bHLH)類轉(zhuǎn)錄因子家族成員，其通過調(diào)控下游靶基因的表達，在細胞分化、晝夜節(jié)律和應(yīng)激反應(yīng)等多種機體生理功能中發(fā)揮重要作用[4-5]。研究顯示，DEC1在肺癌、食管癌、胃癌和肝癌等諸多實體瘤中異常表達，調(diào)節(jié)腫瘤細胞周期，促進腫瘤細胞的惡性增殖[6-8]。此外，多項研究證實DEC1與缺氧誘導(dǎo)因子低氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)關(guān)系密切[6,9]，可能是腫瘤缺氧的直接標(biāo)志，然而在缺氧狀態(tài)下，DEC1在乳腺癌細胞中的表達變化及其對腫瘤細胞增殖、侵襲及遷移能力的影響尚不清楚，為此，本研究通過建立體外缺氧細胞模型，觀察缺氧狀態(tài)下DEC1的表達變化，進一步沉默DEC1表達分析其對乳腺癌MDA-MB-231細胞的活力、侵襲及遷移能力的影響并探討其可能的機制，為尋找乳腺癌有效的診療及預(yù)后靶點提供實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

抗DEC1抗體購自Abcam；抗Smad3和p-Smad3抗體均購自CST；蛋白提取試劑盒、CCK-8試劑、抗GAPDH抗體與ECL發(fā)光試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Lipofectamine RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen；Transwell小室購自Millipore；Matrigel人工基底膜購自BD；DMEM高糖培養(yǎng)液購自HyClone；DEC1-siRNA序列(5’-GAAGCAUGUGAAAGCACUATT-3’)由上海吉瑪公司合成。人乳腺癌細胞MDA-MB-231細胞株購自上海中科院細胞庫。

2 主要方法

2.1細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 人乳腺癌MDA-MB-231細胞經(jīng)復(fù)蘇后培養(yǎng)于含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，放入37 ℃、5% CO2孵箱中常規(guī)培養(yǎng)，2～3 d傳代。缺氧培養(yǎng)條件：在三通氣低氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，調(diào)節(jié)O2濃度為1%、CO2濃度為5%、N2濃度為94%。 將MDA-MB-231細胞以每孔1×105個接種于 6 孔培養(yǎng)板中連續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)細胞達70%～80% 融合時，按照Lipofectamine RNAiMAX產(chǎn)品說明書，分別將DEC1-siRNA和陰性對照siRNA (negative control siRNA, NC-siRNA)轉(zhuǎn)染至6孔培養(yǎng)板中分別記作DEC1-siRNA組和NC組，6 h 后更換新鮮培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后提取總 RNA，72 h后提取總蛋白。

2.2RT-qPCR 待細胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組細胞提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，用于擴增DEC1目的片段的上游引物序列為5’-ACTTACCTTGAAGCATGTGAAAGCA-3’,下游引物序列為5’-CATGTCTGGAAACCTGAGCAGAA-3’；以GAPDH為內(nèi)參照，GAPDH上游引物序列為5’-ATGTCGTGGAGTCTACTGGC-3’,下游引物序列為5’-TGACCTTGCCCACAGCCTTG-3’；反應(yīng)條件為94 ℃ 2 min; 94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s (30個循環(huán)) ;同一實驗重復(fù)3次，實驗數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCt法計算。

2.3Western blot實驗 待細胞轉(zhuǎn)染72 h后，收集各組細胞提取總蛋白，BCA法測定濃度后加入適量上樣緩沖液(1∶4)于100 ℃煮沸5 min變性; 每孔上樣 40 μg蛋白，采用80 V恒壓SDS-PAGE(10%分離膠)分離后將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入Ⅰ抗(DEC1 1∶1 000、Smad3 1∶1 000、p-Smad3 1∶500)4 ℃ 孵育過夜，次日 TBST 漂洗3次，每次10 min,加入 HRP 標(biāo)記的Ⅱ抗(1∶3 000)室溫孵育1 h，TBST 漂洗3次，每次10 min,ECL化學(xué)發(fā)光顯影，采用 Quantity One 軟件分析、統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

2.4劃痕實驗 待MDA-MB-231細胞轉(zhuǎn)染24 h后，去除培養(yǎng)液，使用無菌的200 μL槍頭劃痕，PBS清洗去除細胞殘骸，加入無血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后于鏡下觀察劃痕愈合程度，拍照并計算細胞遷移率。

2.5Transwell 侵襲實驗 待MDA-MB-231細胞轉(zhuǎn)染24 h后，消化、收集接種入提前一天鋪好60 μL Matrigel膠(Matrigel 與無血清 DMEM 培養(yǎng)液按體積稀釋比1∶9稀釋)的Transwell小室上室中，下室加入含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，連續(xù)培養(yǎng)24 h，擦去上室細胞，甲醇固定30 min，結(jié)晶紫染色10 min，光鏡下隨機取3個視野，拍照并計數(shù)。

2.6CCK-8實驗 待MDA-MB-231細胞轉(zhuǎn)染24 h后，消化收集，按每孔3×103個接種入96孔板中連續(xù)培養(yǎng)3 d，待細胞貼壁時記為0 h，分別于24 h、48 h及72 h加入10 μL CCK-8試劑，在培養(yǎng)箱中靜置4 h后，采用酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光度(A)值，統(tǒng)計數(shù)據(jù)并分析。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，以P<0. 05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 在常氧與缺氧狀態(tài)下乳腺癌細胞MDA-MB-231中DEC1的表達檢測

RT-qPCR和Western blot 結(jié)果顯示，缺氧條件下人乳腺癌細胞MDA-MB-231中DEC1 mRNA及蛋白表達水平顯著高于常氧條件培養(yǎng)的MDA-MB-231細胞(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.The mRNA (A) and protein (B) expression of DEC1 in breast cancer MDA-MB-231 cells under hypoxia. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsnormoxia group.

圖1 在缺氧條件下乳腺癌MDA-MB-231細胞中DEC1表達變化

2 在缺氧狀態(tài)下，MDA-MB-231細胞中DEC1干擾效果的檢測

RT-qPCR和Western blot 結(jié)果顯示，siRNA-DEC1組中DEC1基因的相對表達量顯著低于NC組和空白對照組(P<0.01)，見圖2。

Figure 2.The mRNA (A) and protein (B) expression level of DEC1 in transfected MDA-MB-231 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsblank group.

圖2 轉(zhuǎn)染siRNA-DEC1后細胞中 DEC1表達水平的變化

3 在缺氧狀態(tài)下，沉默DEC1表達對乳腺癌MDA-MB-231細胞活力的影響

CCK-8實驗結(jié)果顯示，在缺氧條件下，與空白對照組和NC組相比，siRNA-DEC1組中MDA-MB-231細胞活力下降(P<0.05)，見圖3。

4 在缺氧狀態(tài)下，沉默DEC1表達對乳腺癌MDA-MB-231細胞侵襲能力的影響

Transwell實驗結(jié)果顯示，在缺氧條件下，與空白對照組和NC組相比，siRNA-DEC1組中細胞穿過基底膜的數(shù)量顯著減少(P<0.01)，見圖4。

5 在缺氧狀態(tài)下，沉默DEC1表達對乳腺癌MDA-MB-231細胞遷移能力的影響

劃痕實驗結(jié)果顯示，在缺氧條件下，與空白對照組和NC組相比，siRNA-DEC1組中MDA-MB-231細胞遷移能力顯著減弱(P<0.01)，見圖5。

Figure 3.The effect ofDEC1silencing on the viability of MDA-MB-231 cells was detected by CCK-8 assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group.

圖3 CCK-8實驗檢測沉默DEC1表達對乳腺癌細胞MDA-MB-231活力的影響

Figure 4.The effect ofDEC1silencing on the invasion ability of MDA-MB-231 cells was detected by Transwell assay. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsblank group.

圖4 Transwell 實驗檢測沉默DEC1表達對乳腺癌細胞MDA-MB-231侵襲能力的影響

Figure 5.The effect ofDEC1silencing on the migration ability of MDA-MB-231 cells was detected by Wound healing assay. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsblank group.

圖5 劃痕實驗檢測沉默DEC1表達對乳腺癌細胞MDA-MB-231遷移能力的影響

6 缺氧狀態(tài)下，沉默DEC1表達對TGF-β/Smad3信號通路關(guān)鍵分子表達的影響

Western blot 結(jié)果顯示，siRNA-DEC1組中p-Smad3蛋白表達水平顯著低于NC組和空白對照組(P<0.05)，而Smad3蛋白表達無顯著差異，見圖6。

Figure 6.The effect ofDEC1silencing on the protein levels of Smad3 and p-Smad3 in the MDA-MB-231 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group.

圖6 沉默DEC1表達對MDA-MB-231細胞中Smad3和p-Smad3蛋白水平的影響

討 論

乳腺癌是嚴(yán)重危害女性健康的惡性腫瘤之一，在我國城鄉(xiāng)乳腺癌的發(fā)病率逐年上升且呈年輕化趨勢[10]。近年來，雖然靶向治療轉(zhuǎn)化性研究的開展，在針對乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移病灶的靶點治療上取得了很大進展，但由于乳腺癌存在廣泛的遺傳異質(zhì)性，患者的5年生存率仍不容樂觀[11]。因此，探索與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的基因，對揭示乳腺癌的發(fā)病機制，提高乳腺癌的診療水平具有重要意義。

在本研究中，通過體外構(gòu)建腫瘤缺氧模型以分析缺氧對DEC1表達的影響，結(jié)果顯示在缺氧條件下，乳腺癌MDA-MB-231細胞中DEC1 mRNA和蛋白表達水平均顯著增高，表明缺氧環(huán)境可引起MDA-MB-231細胞內(nèi)DEC1表達的變化。為了明確在缺氧條件下DEC1表達增高對MDA-MB-231細胞的生物學(xué)功能的影響，研究進一步采用RNA干擾技術(shù)，觀察沉默DEC1基因后，MDA-MB-231細胞活力、侵襲及遷移能力的變化。結(jié)果顯示，在缺氧條件下沉默DEC1表達，可導(dǎo)致MDA-MB-231細胞活力、侵襲及遷移能力顯著下降，由此提示DEC1作為一種低氧調(diào)控基因，在缺氧條件下DEC1高表達對乳腺癌細胞耐受缺氧環(huán)境具有重要作用。此外，越來越多的證據(jù)表明，缺氧是決定乳腺癌預(yù)后的重要因素[12]，因此，DEC1可能作為乳腺癌新的診療靶點，對改善乳腺癌患者預(yù)后具有重要意義。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展涉及諸多信號通路的異?；罨渲蠺GF-β/Smad3信號的異?；罨谀[瘤的發(fā)生、浸潤過程中起著重要的調(diào)控作用，活化的II型TGF-β受體引起Smad3磷酸化，轉(zhuǎn)位進入細胞核繼而調(diào)節(jié)下游靶基因轉(zhuǎn)錄[13-14]。研究報道，活化的TGF-β/activin信號可通過快速誘導(dǎo)DEC1基因轉(zhuǎn)錄重置哺乳動物的生物鐘，而這一過程需要依賴于Smad3分子的磷酸化[15]。在鱗癌細胞中，Smad3可通過正調(diào)控DEC1表達參與調(diào)節(jié)細胞的增殖與遷移能力的變化[16]。此外，在TGF-β存在的情況下，靶向沉默DEC1可下調(diào)胰腺癌細胞中p-Smad3、轉(zhuǎn)錄因子Snail以及N-cadherin的表達，繼而在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進程中發(fā)揮重要作用[17]。而在本研究中，在缺氧條件下沉默DEC1表達后，Smad3表達無顯著變化，p-Smad3表達顯著下降，提示TGF-β/Smad3信號通路被阻斷，DEC1可能依賴TGF-β/Smad3 信號通路發(fā)揮其促腫瘤侵襲作用，同時我們猜測在缺氧條件下，DEC1可能對Smad3的磷酸化水平存在負反饋調(diào)節(jié)作用，然而其具體機制仍有待我們進一步研究，而本實驗結(jié)果為明確p-Smad3與DEC1之間的相互關(guān)系提供了新的證據(jù)。

綜上所述，在缺氧條件下，DEC1可能通過調(diào)控TGF-β/Smad3信號通路參與乳腺癌MDA-MB-231細胞的侵襲轉(zhuǎn)移進程，而其與缺氧彼此之間的關(guān)系將為乳腺癌靶向治療提供一個潛在的研究方向。