馮明輝， 賀松其， 董曉飛， 趙曉慶， 林 錚， 王嘉吉， 龐 杰△

(1廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院腫瘤科, 廣東 廣州 510000； 2南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院， 廣東 廣州 510515)

根據(jù)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)的一項(xiàng)全球性腫瘤研究，肝癌目前已成為全球第6大最常見(jiàn)的腫瘤[1]，其中，肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)作為肝癌的最主要和常見(jiàn)的形式，其預(yù)后極差，死亡率高。腫瘤誘因具有多種假說(shuō)，其中炎癥誘發(fā)癌基因表達(dá)的假說(shuō)得到了當(dāng)今醫(yī)學(xué)界的認(rèn)可[2]。近年來(lái)，由于HCC發(fā)病率不斷上升，且具有預(yù)后不良和潛在發(fā)展性的特點(diǎn)，因此，如何有效地防治HCC已經(jīng)成為一個(gè)具有挑戰(zhàn)性和現(xiàn)實(shí)性的問(wèn)題。

萊菔硫烷(sulforaphane，SFN)是硫代葡萄糖苷的水解產(chǎn)物，通常存在于十字花科蔬菜中， SFN在過(guò)往的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭斜憩F(xiàn)出抗腫瘤的特性[3]。氧化應(yīng)激是腫瘤發(fā)生的其中一個(gè)可能的環(huán)節(jié)，機(jī)體的抗氧化酶系統(tǒng)主要包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)系統(tǒng)，其中核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)通路被證明與抗氧化蛋白SOD和GPx等有關(guān)[4-5]，而研究也表明，SFN能促進(jìn)Nrf2的核轉(zhuǎn)錄從而加強(qiáng)抗氧化酶的表達(dá)，抑制氧化應(yīng)激。同時(shí)，SFN具有上調(diào)Nrf2的功能[6]。同時(shí)，Thimmulappa等[7]曾報(bào)道SFN具有有效的抗炎作用，其機(jī)制是通過(guò)抑制DNA與NF-κB的結(jié)合，減少炎癥和腫瘤信號(hào)因子誘導(dǎo)物細(xì)菌脂多糖的生成，并使機(jī)體刺激產(chǎn)生的氧化應(yīng)激物質(zhì)在原巨噬細(xì)胞中的表達(dá)下調(diào)。此外，Heiss等[8]的研究顯示，SFN可通過(guò)激活Fas/FasL途徑來(lái)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡。

基于萊菔硫烷所具有的抗炎和抗腫瘤作用，我們?cè)噲D探究SFN是否在HCC發(fā)生中起到一定的預(yù)防作用，并初步探索SFN發(fā)揮作用的可能機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 7周齡雄性SD大鼠50只，體重200～230 g，購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物的生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(粵)2019-0011，動(dòng)物的使用許可證號(hào)為SYXK(粵)2019-0022。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在標(biāo)準(zhǔn)清潔級(jí)環(huán)境下喂養(yǎng)，食物和水自由攝取。本實(shí)驗(yàn)遵循3R原則，所有的大鼠均放置在適當(dāng)?shù)耐L(fēng)條件下，溫度為(21±2) ℃，濕度為(60±5)%，維持12 h的暗光循環(huán)。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑 HE染色試劑盒、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、總膽紅素(total bilirubin，TBIL)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)、IL-10和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor β, TGF-β)的ELISA試劑盒(上海魯紋生物)；Masson 染色試劑盒(Biosis)； SOD、GPx、CAT和丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒(南京金斯瑞生物)。

2 方法

2.1動(dòng)物分組與處理 隨機(jī)將50只SD大鼠分為5組： 對(duì)照(control,Con)組、DEN造模(DEN)組、DEN+SFN低劑量干預(yù)(DEN+SFN-L)組、DEN+SFN中劑量干預(yù)(DEN+SFN-M)組和DEN+SFN高劑量干預(yù)(DEN+SFN-H)組，每組10只大鼠。各組大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，進(jìn)行動(dòng)物造模處理。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行DEN造模處理。預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示，每周注射一次50 mg/kg的DEN，反復(fù)注射12周時(shí)出現(xiàn)肝硬化或纖維化但無(wú)癌變結(jié)節(jié)，而反復(fù)注射18周時(shí)出現(xiàn)大量癌變結(jié)節(jié)。故本實(shí)驗(yàn)選擇每周注射一次50 mg/kg DEN，持續(xù)18周進(jìn)行造模；而SFN干預(yù)時(shí)間是從第12周起，SFN干預(yù)劑量根據(jù)文獻(xiàn)[9]劑量并稍作修改。具體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法為：對(duì)照組大鼠在18周內(nèi)，每周腹腔注射1次0.2 mL生理鹽水，并在第12～18周，同時(shí)每天灌胃0.2 mL PBS；DEN造模組大鼠在18周內(nèi)，每周腹腔注射一次0.2 mL生理鹽水配制的DEN溶液(劑量為50 mg/kg大鼠體重)，并在第12～18周，同時(shí)每天灌胃0.2 mL PBS；SFN干預(yù)組大鼠在18周內(nèi)，每周腹腔注射一次0.2 mL生理鹽水配制的DEN溶液(劑量為50 mg/kg大鼠體重)，并在第12～18周，同時(shí)每天灌胃0.2 mL PBS配制的SFN溶液，其中DEN+SFN-L組為低劑量 0.19 mg/kg，DEN+SFN-M組為中等劑量0.38 mg/kg，DEN+SFN-H組為高劑量 0.57 mg/kg。在第18周結(jié)束時(shí)，麻醉大鼠，取出肝臟，觀察并記錄肝臟的大小、重量、顏色和形態(tài)，并一部分固定在福爾馬林中進(jìn)行組織學(xué)檢查，另外一部分冰凍在-80 ℃。

2.2HE染色和Masson染色 將肝臟組織在4%甲醛溶液中浸泡過(guò)夜進(jìn)行固定，而后將其包埋在石蠟中，切成5 μm厚的切片，根據(jù)HE染色試劑盒說(shuō)明書(shū)標(biāo)準(zhǔn)流程步驟進(jìn)行HE染色。Masson染色石蠟切片制作法與HE染色相同，切片制作后根據(jù)Masson染色試劑盒說(shuō)明書(shū)標(biāo)準(zhǔn)流程步驟進(jìn)行Masson染色。染色后，中性樹(shù)膠封閉切片，在顯微鏡下觀察，并隨機(jī)采集6個(gè)視野的圖像。

2.3ELISA法檢測(cè)酶含量和炎癥因子的含量 將冰凍的肝臟組織切塊，在4 ℃下使用勻漿機(jī)將肝臟組織與Tris-HCl緩沖液混合并制成10%的組織勻漿，用等量的乙醇提取上清液，在2 500 r/min的設(shè)定下離心10 min，取上清液后用生理鹽水5倍進(jìn)行稀釋?zhuān)笕?0 μL作為實(shí)驗(yàn)樣本，用pH 9.6的碳酸鹽包被緩沖液溶解抗原，之后根據(jù)ELISA實(shí)驗(yàn)說(shuō)明書(shū)標(biāo)準(zhǔn)流程步驟，經(jīng)加樣、孵育、洗板、顯色、讀板等步驟測(cè)量肝組織中ALT、AST、ALP、TBIL、IL-10、TGF-β、IL-1α、 IL-1β、IL-6和TNF-α的水平。

2.4分光光度法測(cè)定氧化應(yīng)激指標(biāo) 將冰凍的肝臟組織切塊，在4 ℃下使用勻漿機(jī)將肝臟組織與Tris-HCl緩沖液混合并制成10%的組織勻漿，用等量的乙醇提取上清液，在2 500 r/min的設(shè)定下離心10 min，取上清液后用生理鹽水5倍進(jìn)行稀釋?zhuān)笕?0 μL作為實(shí)驗(yàn)樣本，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)標(biāo)準(zhǔn)流程步驟，用分光光度法分別測(cè)定SOD、GPx和CAT活性以及MDA含量，用U/g或者μmol/g表示。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行后續(xù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組定量資料的比較采用單因素方差分析方法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 萊菔硫烷抑制DEN誘導(dǎo)的大鼠肝癌發(fā)生

對(duì)照組的肝臟呈紅褐色，質(zhì)地柔軟，表面光滑無(wú)結(jié)節(jié)。給予DEN誘導(dǎo)HCC模型后，DEN造模組肝臟的顏色為黃褐色，表面暗淡無(wú)光澤，呈現(xiàn)大小不一的癌變結(jié)節(jié)，且結(jié)節(jié)數(shù)目多。經(jīng)過(guò)不同給藥劑量的SFN干預(yù)處理后，宏觀觀察下肝臟癌變結(jié)節(jié)化的程度隨SFN劑量的增高而降低，提示萊菔硫烷具有一定抑制DEN誘導(dǎo)的肝癌發(fā)生的作用，見(jiàn)圖1。

Figure 1.Sulforaphane (SFN) inhibited DEN-induced hepatocarcinogenesis in the rats. Representative images of the livers were showed.

圖1 萊菔硫烷抑制DEN誘導(dǎo)的肝癌發(fā)生

2 萊菔硫烷對(duì)DEN處理后大鼠肝臟組織病理學(xué)改變的影響

對(duì)照組的肝臟組織內(nèi)肝葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核清晰；DEN造模組的肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，表現(xiàn)為含有大量假小葉的無(wú)序結(jié)構(gòu)，小葉內(nèi)可見(jiàn)局灶性細(xì)胞壞死和大量纖維化，伴有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)、異型細(xì)胞較多且細(xì)胞具有不規(guī)則形狀的細(xì)胞核(非典型性癌細(xì)胞灶)；DEN+SFN-L干預(yù)組的肝組織形態(tài)與DEN造模組類(lèi)似，含有大量假小葉的無(wú)序結(jié)構(gòu)，小葉內(nèi)可見(jiàn)局灶性細(xì)胞壞死和纖維化，伴有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)和非典型性癌細(xì)胞灶；DEN+SFN-M干預(yù)組的肝細(xì)胞損傷程度較高，部分發(fā)生纖維化，且可見(jiàn)假小葉形成和部分非典型性癌細(xì)胞，多見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)；DEN+SFN-H干預(yù)組的肝組織結(jié)構(gòu)趨向于正常，肝組織纖維化程度較低，未見(jiàn)明顯的假小葉形成，癌變細(xì)胞較少，炎細(xì)胞浸潤(rùn)較少，見(jiàn)圖2。這提示SEN可減少炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，減輕肝組織纖維化，一定程度上抑制癌變發(fā)生。

Figure 2.Sulforaphane (SFN) attenuated DEN-induced inflammatory cell infiltration, hepatic fibrosis and cell carcinogenesis in the liver tissues of the rats. A: the liver tissues in each group were stained with hematoxylin and eosin (HE); B: the liver tissues in each group were stained with Masson’s trichrome. The scale bar=250 μm.

圖2 萊菔硫烷能減輕DEN誘導(dǎo)的大鼠肝組織炎細(xì)胞浸潤(rùn)、肝纖維化和細(xì)胞癌變

3 萊菔硫烷減輕DEN誘導(dǎo)的肝臟損傷

對(duì)照組肝臟的ALT、AST、ALP和TBIL含量較低；DEN組肝組織中ALT、AST、ALP和TBIL的含量均顯著增加；SFN干預(yù)組肝組織的ALT、AST、ALP和TBIL含量有所下降，且高劑量SFN干預(yù)組相比于DEN組明顯下降(P<0.01)，甚至接近于正常肝臟的水平，見(jiàn)圖3。這些生化指標(biāo)的改變表明萊菔硫烷可以使肝細(xì)胞壞死減少，減輕肝損傷，維持肝臟的正常功能。

Figure 3.The effects of sulforaphane (SFN) on the liver function in the rats after DEN exposure. Mean±SD.n=10.*P<0.05，**P<0.01vsDEN group;##P<0.01vscontrol group.

圖3 萊菔硫烷對(duì)DEN處理后大鼠肝功能的影響。

4 萊菔硫烷減輕DEN引起的肝組織炎癥應(yīng)答

對(duì)照組的組織正性調(diào)控因子IL-1α、 IL-1β、 IL-6和TNF-α含量較低，負(fù)性調(diào)控因子IL-10和TGF-β的含量較高；DEN組的正性調(diào)控因子IL-1α、IL-1β、IL-6和TNF-α含量顯著升高，而負(fù)性調(diào)控因子IL-10和TGF-β的含量顯著降低；SFN干預(yù)組的肝組織正性調(diào)控因子IL-1α、IL-1β、IL-6和TNF-α含量有所降低，而負(fù)性調(diào)控因子IL-10和TGF-β的含量有所升高，且高劑量SFN干預(yù)組與DEN組相比差異最明顯，甚至接近于正常肝臟水平，見(jiàn)圖4。這提示萊菔硫烷可使DEN所致的炎癥正性調(diào)控因子升高和負(fù)性調(diào)控因子降低的現(xiàn)象得到改善，從而調(diào)控肝組織的炎癥反應(yīng)，減少炎癥對(duì)肝細(xì)胞的損傷。

Figure 4.The effect of sulforaphane (SFN) on hepatocyte inflammation in the rats after DEN exposure. Mean±SD.n=10.*P<0.05，**P<0.01vsDEN group;##P<0.01vscontrol group.

圖4 萊菔硫烷對(duì)DEN處理后大鼠肝細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響

5 萊菔硫烷減輕DEN對(duì)肝組織的過(guò)氧化應(yīng)激反應(yīng)

對(duì)照組肝組織的SOD、CAT和GPx活性較高， MDA含量較低；DEN組肝組織的SOD、CAT和GPx酶活性顯著降低，而MDA含量顯著增高；SFN干預(yù)的組肝組織的抗氧化酶SOD、CAT和GPx活性有所升高，且MDA濃度有所回落，抗氧化酶和過(guò)氧化物的改變程度與SFN劑量呈正相關(guān)(P<0.01)，見(jiàn)圖5。這提示萊菔硫烷可升高肝組織SOD、CAT和GPx酶活性，減少M(fèi)DA的產(chǎn)生，保護(hù)肝細(xì)胞不受氧化應(yīng)激的損傷，提高肝臟抗氧化能力，一定程度上可減少DEN誘導(dǎo)的大鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

討 論

HCC是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，并且由于其惡性程度高、發(fā)生率高而成為肝癌的主要形式[10]。HCC被認(rèn)為是一種由多基因參與和經(jīng)多步驟演進(jìn)的疾病過(guò)程，可能涉及各種致病因素，如肝炎病毒感染、致癌毒性物質(zhì)損害和乙醇攝入[11]。目前對(duì)HCC的治療策略仍然選擇有限，而有效的化學(xué)預(yù)防策略是遏制全球迅速增加的肝癌死亡率最可行的手段之一。

Figure 5.The effects of sulforaphane (SFN) on oxidative stress in the liver tissues of the rats induced by DEN. Mean±SD.n=10.*P<0.05，**P<0.01vsDEN group;##P<0.01vscontrol group.

圖5 萊菔硫烷對(duì)DEN處理的大鼠肝組織氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響

DEN誘導(dǎo)的HCC模型與人體HCC相似，是研究肝癌發(fā)生和篩選潛在防治HCC藥物最廣泛使用的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭籟12]，因此本研究采用DEN誘導(dǎo)HCC模型。通過(guò)DEN反復(fù)刺激18周后，宏觀觀察發(fā)現(xiàn)DEN組大鼠肝臟具有明顯的癌性結(jié)節(jié)性改變，提示HCC發(fā)生。進(jìn)一步，經(jīng)組織學(xué)分析可見(jiàn)，DEN組大鼠的肝組織中可觀察到許多病理性異常，肝臟組織結(jié)構(gòu)紊亂，遍布包含有大量假小葉的無(wú)序結(jié)構(gòu)，炎癥細(xì)胞大量浸潤(rùn)，肝組織結(jié)構(gòu)內(nèi)充滿具有不規(guī)則形狀細(xì)胞核的異型細(xì)胞(癌細(xì)胞病灶)，所有這些信息都表明我們的DEN誘導(dǎo)的HCC模型是成功的。

萊菔硫烷是目前研究界認(rèn)為的蔬菜中具有防癌、抗癌效果的天然活性物質(zhì)之一[13]。流行病學(xué)和活體試驗(yàn)表明，萊菔硫烷能夠有效降低肺癌和胃癌等腫瘤的發(fā)生[14]。萊菔硫烷通過(guò)在DNA修復(fù)、消除炎癥、造成腫瘤細(xì)胞的凋亡等方面發(fā)來(lái)發(fā)揮其抗癌活性[15-16]。作為一種較易獲得的物質(zhì)，萊菔硫烷在防治腫瘤藥物的開(kāi)發(fā)方面具有極大的科研價(jià)值。在我們的研究中，經(jīng)SFN干預(yù)后，DEN誘導(dǎo)的肝組織的癌變結(jié)節(jié)數(shù)目顯著降低，癌變情況改善，提示SFN具有一定的抑制肝癌發(fā)生的作用。既往的研究認(rèn)為，體內(nèi)反復(fù)炎癥反應(yīng)的過(guò)度激活和持續(xù)反復(fù)的損傷可誘導(dǎo)癌基因的激活，從而導(dǎo)致細(xì)胞的癌變[17-19]。為初步探討SFN改善HCC大鼠癌變情況的機(jī)制，我們接著對(duì)肝損傷、炎癥反應(yīng)指標(biāo)進(jìn)行了檢測(cè)。AST、ALT、ALP和TBIL水平通?？煞从掣螕p傷的程度，其增加水平是肝功能損傷的重要指標(biāo)[18]。我們的研究結(jié)果顯示，DEN誘導(dǎo)的HCC模型中肝組織中TBIL、ALT、AST和ALP水平顯著高于對(duì)照組，即DEN可誘導(dǎo)肝細(xì)胞的損傷和肝功能的損害；而SFN組能抑制DEN誘導(dǎo)的肝細(xì)胞的損傷和肝功能的損害。

炎癥因子可影響細(xì)胞的微環(huán)境，與炎癥及腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系，IL-10和TGF-β為負(fù)性調(diào)控因子，IL-1α、IL-1β、IL-6和TNF-α為正性調(diào)控因子。我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)DEN誘導(dǎo)的HCC大鼠肝組織具有促炎效應(yīng)的正性調(diào)控因子IL-1α、IL-6、IL-1β和TNF-α表達(dá)增加，具有抗炎效應(yīng)的負(fù)性調(diào)控因子IL-10和TGF-β表達(dá)下降，說(shuō)明DEN可加強(qiáng)HCC大鼠肝組織的炎癥反應(yīng)；而給予不同劑量的SFN后，肝組織促炎因子含量下降，抗炎因子含量上升，一定程度說(shuō)明了SFN具有抗炎作用，可降低DEN誘導(dǎo)的肝組織炎癥反應(yīng)。

以往的研究結(jié)果表明，氧化應(yīng)激在肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展中都具有重要作用[20]，SOD、CAT和GPx是機(jī)體重要的抗氧化酶，有減緩氧化速度、清除機(jī)體有害物質(zhì)的能力；MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化物，可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化程度。為探討SFN減輕HCC是否與氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，我們使用分光光度法檢測(cè)肝組織SOD、CAT和GPx的活性以及MDA的含量。結(jié)果顯示，SFN能減少DEN所致肝組織內(nèi)脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA含量，提升抗氧化酶SOD、CAT和GPx的活性，由此可推測(cè)，SFN在DEN誘導(dǎo)的肝組織內(nèi)發(fā)揮有抗氧化作用，可在一定程度上保護(hù)肝臟免受氧化損傷。

綜上所述，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步表明，萊菔硫烷具有抑制DEN誘導(dǎo)的HCC發(fā)生的作用，這種作用可能與SFN減輕DEN誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和肝損傷，同時(shí)增強(qiáng)肝組織的抗氧化能力有關(guān)。因此萊菔硫烷可作為HCC潛在的防癌藥物。本文采取動(dòng)物模型的方法，通過(guò)SFN干預(yù)方式探究其對(duì)DEN誘導(dǎo)的肝組織的保護(hù)作用及初步機(jī)制，考慮的機(jī)制包含炎癥和氧化應(yīng)激，但由于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與人體環(huán)境具有一定的差異，未來(lái)仍需更多的實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。