馮明輝， 賀松其， 董曉飛， 趙曉慶， 林 錚， 王嘉吉， 龐 杰△

(1廣州中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院腫瘤科, 廣東 廣州 510000； 2南方醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院， 廣東 廣州 510515)

根據(jù)國際癌癥研究機構的一項全球性腫瘤研究，肝癌目前已成為全球第6大最常見的腫瘤[1]，其中，肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)作為肝癌的最主要和常見的形式，其預后極差，死亡率高。腫瘤誘因具有多種假說，其中炎癥誘發(fā)癌基因表達的假說得到了當今醫(yī)學界的認可[2]。近年來，由于HCC發(fā)病率不斷上升，且具有預后不良和潛在發(fā)展性的特點，因此，如何有效地防治HCC已經(jīng)成為一個具有挑戰(zhàn)性和現(xiàn)實性的問題。

萊菔硫烷(sulforaphane，SFN)是硫代葡萄糖苷的水解產(chǎn)物，通常存在于十字花科蔬菜中， SFN在過往的實驗模型中表現(xiàn)出抗腫瘤的特性[3]。氧化應激是腫瘤發(fā)生的其中一個可能的環(huán)節(jié)，機體的抗氧化酶系統(tǒng)主要包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)系統(tǒng)，其中核因子E2相關因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)通路被證明與抗氧化蛋白SOD和GPx等有關[4-5]，而研究也表明，SFN能促進Nrf2的核轉錄從而加強抗氧化酶的表達，抑制氧化應激。同時，SFN具有上調(diào)Nrf2的功能[6]。同時，Thimmulappa等[7]曾報道SFN具有有效的抗炎作用，其機制是通過抑制DNA與NF-κB的結合，減少炎癥和腫瘤信號因子誘導物細菌脂多糖的生成，并使機體刺激產(chǎn)生的氧化應激物質在原巨噬細胞中的表達下調(diào)。此外，Heiss等[8]的研究顯示，SFN可通過激活Fas/FasL途徑來誘導HepG2細胞凋亡。

基于萊菔硫烷所具有的抗炎和抗腫瘤作用，我們試圖探究SFN是否在HCC發(fā)生中起到一定的預防作用，并初步探索SFN發(fā)揮作用的可能機制。

材 料 和 方 法

1 實驗材料

1.1實驗動物 7周齡雄性SD大鼠50只，體重200～230 g，購自南方醫(yī)科大學動物實驗中心，動物的生產(chǎn)許可證號為SCXK(粵)2019-0011，動物的使用許可證號為SYXK(粵)2019-0022。實驗動物在標準清潔級環(huán)境下喂養(yǎng)，食物和水自由攝取。本實驗遵循3R原則，所有的大鼠均放置在適當?shù)耐L條件下，溫度為(21±2) ℃，濕度為(60±5)%，維持12 h的暗光循環(huán)。

1.2實驗試劑 HE染色試劑盒、天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)、丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)、總膽紅素(total bilirubin，TBIL)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、白細胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)、IL-10和轉化生長因子β(transforming growth factor β, TGF-β)的ELISA試劑盒(上海魯紋生物)；Masson 染色試劑盒(Biosis)； SOD、GPx、CAT和丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒(南京金斯瑞生物)。

2 方法

2.1動物分組與處理 隨機將50只SD大鼠分為5組： 對照(control,Con)組、DEN造模(DEN)組、DEN+SFN低劑量干預(DEN+SFN-L)組、DEN+SFN中劑量干預(DEN+SFN-M)組和DEN+SFN高劑量干預(DEN+SFN-H)組，每組10只大鼠。各組大鼠適應性飼養(yǎng)3 d后，進行動物造模處理。根據(jù)預實驗結果進行DEN造模處理。預實驗顯示，每周注射一次50 mg/kg的DEN，反復注射12周時出現(xiàn)肝硬化或纖維化但無癌變結節(jié)，而反復注射18周時出現(xiàn)大量癌變結節(jié)。故本實驗選擇每周注射一次50 mg/kg DEN，持續(xù)18周進行造模；而SFN干預時間是從第12周起，SFN干預劑量根據(jù)文獻[9]劑量并稍作修改。具體動物實驗方法為：對照組大鼠在18周內(nèi)，每周腹腔注射1次0.2 mL生理鹽水，并在第12～18周，同時每天灌胃0.2 mL PBS；DEN造模組大鼠在18周內(nèi)，每周腹腔注射一次0.2 mL生理鹽水配制的DEN溶液(劑量為50 mg/kg大鼠體重)，并在第12～18周，同時每天灌胃0.2 mL PBS；SFN干預組大鼠在18周內(nèi)，每周腹腔注射一次0.2 mL生理鹽水配制的DEN溶液(劑量為50 mg/kg大鼠體重)，并在第12～18周，同時每天灌胃0.2 mL PBS配制的SFN溶液，其中DEN+SFN-L組為低劑量 0.19 mg/kg，DEN+SFN-M組為中等劑量0.38 mg/kg，DEN+SFN-H組為高劑量 0.57 mg/kg。在第18周結束時，麻醉大鼠，取出肝臟，觀察并記錄肝臟的大小、重量、顏色和形態(tài)，并一部分固定在福爾馬林中進行組織學檢查，另外一部分冰凍在-80 ℃。

2.2HE染色和Masson染色 將肝臟組織在4%甲醛溶液中浸泡過夜進行固定，而后將其包埋在石蠟中，切成5 μm厚的切片，根據(jù)HE染色試劑盒說明書標準流程步驟進行HE染色。Masson染色石蠟切片制作法與HE染色相同，切片制作后根據(jù)Masson染色試劑盒說明書標準流程步驟進行Masson染色。染色后，中性樹膠封閉切片，在顯微鏡下觀察，并隨機采集6個視野的圖像。

2.3ELISA法檢測酶含量和炎癥因子的含量 將冰凍的肝臟組織切塊，在4 ℃下使用勻漿機將肝臟組織與Tris-HCl緩沖液混合并制成10%的組織勻漿，用等量的乙醇提取上清液，在2 500 r/min的設定下離心10 min，取上清液后用生理鹽水5倍進行稀釋，而后取50 μL作為實驗樣本，用pH 9.6的碳酸鹽包被緩沖液溶解抗原，之后根據(jù)ELISA實驗說明書標準流程步驟，經(jīng)加樣、孵育、洗板、顯色、讀板等步驟測量肝組織中ALT、AST、ALP、TBIL、IL-10、TGF-β、IL-1α、 IL-1β、IL-6和TNF-α的水平。

2.4分光光度法測定氧化應激指標 將冰凍的肝臟組織切塊，在4 ℃下使用勻漿機將肝臟組織與Tris-HCl緩沖液混合并制成10%的組織勻漿，用等量的乙醇提取上清液，在2 500 r/min的設定下離心10 min，取上清液后用生理鹽水5倍進行稀釋，而后取50 μL作為實驗樣本，按照試劑盒說明書標準流程步驟，用分光光度法分別測定SOD、GPx和CAT活性以及MDA含量，用U/g或者μmol/g表示。

3 統(tǒng)計學處理

利用GraphPad Prism 7.0軟件進行后續(xù)統(tǒng)計學分析。實驗數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組定量資料的比較采用單因素方差分析方法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 萊菔硫烷抑制DEN誘導的大鼠肝癌發(fā)生

對照組的肝臟呈紅褐色，質地柔軟，表面光滑無結節(jié)。給予DEN誘導HCC模型后，DEN造模組肝臟的顏色為黃褐色，表面暗淡無光澤，呈現(xiàn)大小不一的癌變結節(jié)，且結節(jié)數(shù)目多。經(jīng)過不同給藥劑量的SFN干預處理后，宏觀觀察下肝臟癌變結節(jié)化的程度隨SFN劑量的增高而降低，提示萊菔硫烷具有一定抑制DEN誘導的肝癌發(fā)生的作用，見圖1。

Figure 1.Sulforaphane (SFN) inhibited DEN-induced hepatocarcinogenesis in the rats. Representative images of the livers were showed.

圖1 萊菔硫烷抑制DEN誘導的肝癌發(fā)生

2 萊菔硫烷對DEN處理后大鼠肝臟組織病理學改變的影響

對照組的肝臟組織內(nèi)肝葉結構完整，肝細胞排列整齊，細胞核清晰；DEN造模組的肝組織結構紊亂，表現(xiàn)為含有大量假小葉的無序結構，小葉內(nèi)可見局灶性細胞壞死和大量纖維化，伴有大量炎細胞浸潤、異型細胞較多且細胞具有不規(guī)則形狀的細胞核(非典型性癌細胞灶)；DEN+SFN-L干預組的肝組織形態(tài)與DEN造模組類似，含有大量假小葉的無序結構，小葉內(nèi)可見局灶性細胞壞死和纖維化，伴有大量炎細胞浸潤和非典型性癌細胞灶；DEN+SFN-M干預組的肝細胞損傷程度較高，部分發(fā)生纖維化，且可見假小葉形成和部分非典型性癌細胞，多見炎細胞浸潤；DEN+SFN-H干預組的肝組織結構趨向于正常，肝組織纖維化程度較低，未見明顯的假小葉形成，癌變細胞較少，炎細胞浸潤較少，見圖2。這提示SEN可減少炎癥細胞浸潤，減輕肝組織纖維化，一定程度上抑制癌變發(fā)生。

Figure 2.Sulforaphane (SFN) attenuated DEN-induced inflammatory cell infiltration, hepatic fibrosis and cell carcinogenesis in the liver tissues of the rats. A: the liver tissues in each group were stained with hematoxylin and eosin (HE); B: the liver tissues in each group were stained with Masson’s trichrome. The scale bar=250 μm.

圖2 萊菔硫烷能減輕DEN誘導的大鼠肝組織炎細胞浸潤、肝纖維化和細胞癌變

3 萊菔硫烷減輕DEN誘導的肝臟損傷

對照組肝臟的ALT、AST、ALP和TBIL含量較低；DEN組肝組織中ALT、AST、ALP和TBIL的含量均顯著增加；SFN干預組肝組織的ALT、AST、ALP和TBIL含量有所下降，且高劑量SFN干預組相比于DEN組明顯下降(P<0.01)，甚至接近于正常肝臟的水平，見圖3。這些生化指標的改變表明萊菔硫烷可以使肝細胞壞死減少，減輕肝損傷，維持肝臟的正常功能。

Figure 3.The effects of sulforaphane (SFN) on the liver function in the rats after DEN exposure. Mean±SD.n=10.*P<0.05，**P<0.01vsDEN group;##P<0.01vscontrol group.

圖3 萊菔硫烷對DEN處理后大鼠肝功能的影響。

4 萊菔硫烷減輕DEN引起的肝組織炎癥應答

對照組的組織正性調(diào)控因子IL-1α、 IL-1β、 IL-6和TNF-α含量較低，負性調(diào)控因子IL-10和TGF-β的含量較高；DEN組的正性調(diào)控因子IL-1α、IL-1β、IL-6和TNF-α含量顯著升高，而負性調(diào)控因子IL-10和TGF-β的含量顯著降低；SFN干預組的肝組織正性調(diào)控因子IL-1α、IL-1β、IL-6和TNF-α含量有所降低，而負性調(diào)控因子IL-10和TGF-β的含量有所升高，且高劑量SFN干預組與DEN組相比差異最明顯，甚至接近于正常肝臟水平，見圖4。這提示萊菔硫烷可使DEN所致的炎癥正性調(diào)控因子升高和負性調(diào)控因子降低的現(xiàn)象得到改善，從而調(diào)控肝組織的炎癥反應，減少炎癥對肝細胞的損傷。

Figure 4.The effect of sulforaphane (SFN) on hepatocyte inflammation in the rats after DEN exposure. Mean±SD.n=10.*P<0.05，**P<0.01vsDEN group;##P<0.01vscontrol group.

圖4 萊菔硫烷對DEN處理后大鼠肝細胞炎癥反應的影響

5 萊菔硫烷減輕DEN對肝組織的過氧化應激反應

對照組肝組織的SOD、CAT和GPx活性較高， MDA含量較低；DEN組肝組織的SOD、CAT和GPx酶活性顯著降低，而MDA含量顯著增高；SFN干預的組肝組織的抗氧化酶SOD、CAT和GPx活性有所升高，且MDA濃度有所回落，抗氧化酶和過氧化物的改變程度與SFN劑量呈正相關(P<0.01)，見圖5。這提示萊菔硫烷可升高肝組織SOD、CAT和GPx酶活性，減少MDA的產(chǎn)生，保護肝細胞不受氧化應激的損傷，提高肝臟抗氧化能力，一定程度上可減少DEN誘導的大鼠體內(nèi)的氧化應激反應。

討 論

HCC是世界上最常見的惡性腫瘤之一，并且由于其惡性程度高、發(fā)生率高而成為肝癌的主要形式[10]。HCC被認為是一種由多基因參與和經(jīng)多步驟演進的疾病過程，可能涉及各種致病因素，如肝炎病毒感染、致癌毒性物質損害和乙醇攝入[11]。目前對HCC的治療策略仍然選擇有限，而有效的化學預防策略是遏制全球迅速增加的肝癌死亡率最可行的手段之一。

Figure 5.The effects of sulforaphane (SFN) on oxidative stress in the liver tissues of the rats induced by DEN. Mean±SD.n=10.*P<0.05，**P<0.01vsDEN group;##P<0.01vscontrol group.

圖5 萊菔硫烷對DEN處理的大鼠肝組織氧化應激反應的影響

DEN誘導的HCC模型與人體HCC相似，是研究肝癌發(fā)生和篩選潛在防治HCC藥物最廣泛使用的實驗模型之一[12]，因此本研究采用DEN誘導HCC模型。通過DEN反復刺激18周后，宏觀觀察發(fā)現(xiàn)DEN組大鼠肝臟具有明顯的癌性結節(jié)性改變，提示HCC發(fā)生。進一步，經(jīng)組織學分析可見，DEN組大鼠的肝組織中可觀察到許多病理性異常，肝臟組織結構紊亂，遍布包含有大量假小葉的無序結構，炎癥細胞大量浸潤，肝組織結構內(nèi)充滿具有不規(guī)則形狀細胞核的異型細胞(癌細胞病灶)，所有這些信息都表明我們的DEN誘導的HCC模型是成功的。

萊菔硫烷是目前研究界認為的蔬菜中具有防癌、抗癌效果的天然活性物質之一[13]。流行病學和活體試驗表明，萊菔硫烷能夠有效降低肺癌和胃癌等腫瘤的發(fā)生[14]。萊菔硫烷通過在DNA修復、消除炎癥、造成腫瘤細胞的凋亡等方面發(fā)來發(fā)揮其抗癌活性[15-16]。作為一種較易獲得的物質，萊菔硫烷在防治腫瘤藥物的開發(fā)方面具有極大的科研價值。在我們的研究中，經(jīng)SFN干預后，DEN誘導的肝組織的癌變結節(jié)數(shù)目顯著降低，癌變情況改善，提示SFN具有一定的抑制肝癌發(fā)生的作用。既往的研究認為，體內(nèi)反復炎癥反應的過度激活和持續(xù)反復的損傷可誘導癌基因的激活，從而導致細胞的癌變[17-19]。為初步探討SFN改善HCC大鼠癌變情況的機制，我們接著對肝損傷、炎癥反應指標進行了檢測。AST、ALT、ALP和TBIL水平通?？煞从掣螕p傷的程度，其增加水平是肝功能損傷的重要指標[18]。我們的研究結果顯示，DEN誘導的HCC模型中肝組織中TBIL、ALT、AST和ALP水平顯著高于對照組，即DEN可誘導肝細胞的損傷和肝功能的損害；而SFN組能抑制DEN誘導的肝細胞的損傷和肝功能的損害。

炎癥因子可影響細胞的微環(huán)境，與炎癥及腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切的關系，IL-10和TGF-β為負性調(diào)控因子，IL-1α、IL-1β、IL-6和TNF-α為正性調(diào)控因子。我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)DEN誘導的HCC大鼠肝組織具有促炎效應的正性調(diào)控因子IL-1α、IL-6、IL-1β和TNF-α表達增加，具有抗炎效應的負性調(diào)控因子IL-10和TGF-β表達下降，說明DEN可加強HCC大鼠肝組織的炎癥反應；而給予不同劑量的SFN后，肝組織促炎因子含量下降，抗炎因子含量上升，一定程度說明了SFN具有抗炎作用，可降低DEN誘導的肝組織炎癥反應。

以往的研究結果表明，氧化應激在肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展中都具有重要作用[20]，SOD、CAT和GPx是機體重要的抗氧化酶，有減緩氧化速度、清除機體有害物質的能力；MDA是脂質過氧化物，可反映機體內(nèi)脂質過氧化程度。為探討SFN減輕HCC是否與氧化應激反應有關，我們使用分光光度法檢測肝組織SOD、CAT和GPx的活性以及MDA的含量。結果顯示，SFN能減少DEN所致肝組織內(nèi)脂質氧化產(chǎn)物MDA含量，提升抗氧化酶SOD、CAT和GPx的活性，由此可推測，SFN在DEN誘導的肝組織內(nèi)發(fā)揮有抗氧化作用，可在一定程度上保護肝臟免受氧化損傷。

綜上所述，我們的實驗結果初步表明，萊菔硫烷具有抑制DEN誘導的HCC發(fā)生的作用，這種作用可能與SFN減輕DEN誘導的炎癥反應和肝損傷，同時增強肝組織的抗氧化能力有關。因此萊菔硫烷可作為HCC潛在的防癌藥物。本文采取動物模型的方法，通過SFN干預方式探究其對DEN誘導的肝組織的保護作用及初步機制，考慮的機制包含炎癥和氧化應激，但由于動物實驗與人體環(huán)境具有一定的差異，未來仍需更多的實驗來驗證我們的實驗結果。