胡施煒， 樓恩哲， 王 瑜， 應(yīng)佳豪， 柯瑞君， 陳佳玉

(紹興文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院， 浙江 紹興 312000)

彌漫性大B細胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)為好發(fā)于中老年男性的非霍奇金淋巴腫瘤(non-Hodgkin lymphoma，NHL)亞型之一，約占NHL的30%～40%[1]。近年來我國DLBCL的發(fā)病率呈上升趨勢，在城市和農(nóng)村的腫瘤發(fā)病率中分別位居第8位和第10位。目前，經(jīng)典的一代CHOP和二代R-CHOP治療方案使DLBCL的治愈率可達60%，但仍有1/3的患者因藥物副作用等原因而未實現(xiàn)真正意義上的治療[2]。近期所研究的新型藥物的聯(lián)合靶向治療雖有一定療效，但預(yù)后不穩(wěn)定且易引發(fā)“細胞因子風(fēng)暴”，其中趨化因子介導(dǎo)的中性粒細胞更因分泌促腫瘤因子而參與了DLBCL的進展過程[3]。因此發(fā)現(xiàn)新的DLBCL輔助或替代藥物對實現(xiàn)DLBCL的完全治療十分重要。

大黃酸(1, 8-二羥基-3-羧基蒽醌，rhein)為來源于大黃的蒽醌類化合物[4]，它是保健品制備原料之一，在臨床上具有通便排毒、降脂減肥和延緩衰老的功效。研究顯示，大黃酸具有抗卵巢癌、肺癌和乳腺癌的作用[5-6]，且可與其它中藥成分聯(lián)合，通過影響核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信號通路在炎癥疾病中發(fā)揮作用[7-8]。 NF-κB的持續(xù)活化與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有一定的相關(guān)性[9]，而影響NF-κB信號通路的活化有可能影響DLBCL細胞生長。大黃酸對DLBCL細胞NF-κB信號通路的影響及其對DLBCL發(fā)生發(fā)展的具體作用目前尚未見詳細報道。 因此，本研究將大黃酸作用于DLBCL細胞株OCI-LY8和DLBCL荷瘤小鼠，并通過檢測細胞活力、細胞凋亡和周期分布的流式細胞術(shù)分析、qPCR、Hoechst染色、Western blot和抑瘤實驗等方法，探討了大黃酸對DLBCL細胞生長和凋亡的作用及其作用的相關(guān)分子機制，以期為臨床治療DLBCL新藥的發(fā)現(xiàn)提供實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 實驗材料

4～5周齡雄性BALB/c裸鼠購自浙江省實驗動物中心，動物合格證號為SCXK(滬)2013-0016。人源DLBCL細胞株OCI-LY8來源于DSMZ；EB病毒轉(zhuǎn)化的人B淋巴細胞CGM1購自ATCC。大黃酸購自北京索萊寶科技有限公司(用5%的碳酸氫鈉配制貯備液)；胰蛋白酶、胎牛血清、PBS和RPMI-1640細胞培養(yǎng)液購自Gibco；AnnexinV-FITC/PI試劑盒和脫脂奶粉購自BD；PCR引物由上海Sangon Biotech公司合成；DEPC水和TRIzol購自Invitrogen；Hoechst 33342染色液、RIPA裂解液(強)和BCA蛋白濃度測定試劑盒購自Beyotime；CellTiter 96?AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay購自Promega；ECL化學(xué)發(fā)光液購自Sigma；dNTP混合物、逆轉(zhuǎn)錄酶、I 抗和酶標(biāo) II 抗購自Boster Biotech；其它化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 主要方法

2.1MTS法檢測細胞活力 將DLBCL細胞OCI-LY8和EB病毒轉(zhuǎn)化的人B淋巴細胞CGM1分別置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，取細胞經(jīng)1 000 r/min離心5 min后去上清，分別用含有0、2、10、50和250 μg/L大黃酸的RPMI-1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度至1×109/L，并接種至96孔細胞培養(yǎng)板，每孔100 μL，設(shè)3復(fù)孔。將細胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于培養(yǎng)0、24、48和72 h取出培養(yǎng)板，分別加入MTS試劑10 μL，混勻后，將培養(yǎng)板繼續(xù)置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 min。取出培養(yǎng)板，并利用酶標(biāo)儀測量490 nm時各孔的吸光度(A)值，繪制細胞生長曲線，分析大黃酸對細胞活力的影響，并根據(jù)結(jié)果篩選后續(xù)實驗的最佳劑量。

2.2流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡水平 取分別經(jīng)0、10和50 μg/L大黃酸作用24 h的OCI-LY8和CGM1細胞各5×106個，1 000 r/min離心5 min，棄上清，用PBS洗滌細胞2次，每次均經(jīng)1 000 r/min離心5 min回收細胞。用100 μL 1× Binding Buffer重懸細胞，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，混勻后避光染色30 min，PBS洗2次，經(jīng)1 000 r/min離心5 min回收細胞。用200 μL PBS懸浮細胞，流式細胞術(shù)檢測檢細胞凋亡水平，分析大黃酸對OCI-LY8細胞凋亡的影響。

2.3Hoechst染色觀察細胞核型的變化 取處于對數(shù)生長期的OCI-LY8細胞，分別用含0、10和50 μg/L大黃酸的RPMI-1640完全培養(yǎng)液于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，1 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS清洗細胞2次，每次均經(jīng)1 000 r/min離心5min回收細胞。于細胞沉淀中加入10 μg/L的Hoechst 33342染色液100 μL，輕輕混勻，于4 ℃避光染色20 min。離心棄染液，用PBS洗細胞2次，1 000 r/min離心5 min回收細胞。于細胞沉淀中加入PBS 1滴，混勻細胞，并將細胞滴加到載玻片上，在熒光顯微鏡下觀察細胞的核型，并計數(shù)凋亡核型細胞所占的百分比。

2.4qPCR法分析細胞內(nèi)基因的mRNA水平 取處于對數(shù)生長期的OCI-LY8細胞，用分別含0 μg/L或50 μg/L大黃酸的RPMI-1640完全培養(yǎng)液于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，1 000 r/min離心細胞5 min，棄上清，PBS清洗細胞2次，每次均經(jīng)1 000 r/min離心5 min回收細胞。用TRIzol提取細胞RNA(試劑用量和方法按說明書)，Nano Drop定量后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。設(shè)計并合成Rip2、β-actin、Bcl-xL、NIK、NF-κB和caspase-3的引物(引物序列見表1)，qPCR法檢測各基因mRNA的Ct值，利用公式2-ΔΔCt計算各基因的mRNA相對含量，分析大黃酸對OCI-LY8細胞基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。

表1 qPCR引物序列

2.5Western blot分析細胞內(nèi)的蛋白水平 取分別經(jīng)含有終濃度為0、10和50 μg/L大黃酸的RPMI-1640培養(yǎng)24 h后的OCI-LY8細胞，離心棄上清，用PBS洗滌細胞2次，每次均于4 ℃、1 000 r/min條件下離心5 min以回收細胞，完全棄上清后，用RIPA裂解液(強)裂解各組細胞10 s，12 000 r/min離心20 min，回收上清。各上清中的細胞總蛋白用BCA蛋白濃度測定試劑盒定量后，以GAPDH為內(nèi)參照，進行Bcl-xL、NIK、p52、RIP2、IκBα、p65和caspase-3蛋白的Western blot檢測。用ImageJ軟件進行各蛋白條帶的灰度檢測。

2.6抑瘤實驗 取4周齡BALB/c小鼠，并將其隨機分為6小組，每組10只。待其適應(yīng)環(huán)境 1 周后，在每只BALB/c裸鼠腹肌溝皮下接種1×107的OCI-LY8細胞0.1 mL，于腫瘤細胞接種2 d 后，分別尾靜脈注射0、1、5、25和125 μg/kg大黃酸，其后每2 d 用藥1次，在用藥15 d 后處死小鼠，解剖剝離腫瘤組織，稱瘤重并記錄，分析大黃酸的抑瘤效果。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均經(jīng)SPSS 17.0軟件統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 細胞活力的檢測結(jié)果

MTS實驗的檢測結(jié)果表明，OCI-LY8細胞經(jīng)2、10、50和250 μg/L的大黃酸作用后，其活力均受到明顯的抑制(P<0.01)，且其受抑程度隨著大黃酸用藥濃度和作用時間的增加越顯著，見圖1A。B淋巴細胞CGM1的活力在大黃酸用藥濃度低于50 μg/L時未受影響，但當(dāng)藥物劑量達到250 μg/L時，CGM1細胞的活力亦受到顯著抑制(P<0.01)，見圖1B。因此后續(xù)實驗選擇10 μg/L和50 μg/L為藥物作用劑量來分析藥物作用的分子機制。

Figure 1.The results of cell viability by MTS assay. OCI-LY8 (A) and CGM1 (B) cells were treated with 0～250 μg/L rhein. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μg/L group.

圖1 MTS法檢測細胞活力

2 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡的結(jié)果

OCI-LY8細胞分別經(jīng)10 μg/L和50 μg/L大黃酸作用24 h后，流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)細胞凋亡率由0 μg/L組的0.13%±0.05%增加到16.72%±1.03%和28.24%±1.14%，其凋亡水平隨用藥劑量增加而增加(P<0.01);而CGM1細胞的凋亡水平未受明顯影響(P>0.05)，見圖2。

3 Hoechst 33342染色的結(jié)果觀察

Hoechst 33342染色結(jié)果顯示，在10 μg/L和50 μg/L大黃酸作用下，部分OCI-LY8細胞的核染色質(zhì)濃縮，核碎裂，出現(xiàn)凋亡小體，且發(fā)生凋亡核型改變的細胞隨用藥劑量的增加而增加(P<0.01)，見圖3。該結(jié)果與流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡的結(jié)果基本相符。

Figure 2.The results of apoptotic rate examined by flow cytometry. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 μg/L group.

圖2 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率的結(jié)果

4 qPCR檢測結(jié)果

qPCR檢測結(jié)果顯示，50 μg/L大黃酸作用OCI-LY8細胞24 h后，Rip2、Bcl-xL、NIK和NF-κB的mRNA水平均顯著下降(P<0.01)，而caspase-3的mRNA水平增長了近2倍(P<0.01)，見圖4。

5 Western blot檢測結(jié)果

Western blot檢測結(jié)果顯示，與0 μg/L對照組相比，10 μg/L和50 μg/L大黃酸用藥組OCI-LY8細胞內(nèi)RIP2、NIK、p52、Bcl-xL、p-p65和p-IκBα蛋白水平顯著降低，而cleaved caspase-3的蛋白水平顯著上升(P<0.01)，且蛋白含量的改變與用藥劑量相關(guān)，見圖5。

6 抑瘤實驗的結(jié)果

大黃酸顯著抑制了荷DLBCL小鼠腫瘤組織的生長(P<0.01)，且其抑制作用隨大黃酸濃度的增加而加強，見圖6。但當(dāng)用藥劑量達到125 μg/kg時，于用藥3 d 后，動物開始出現(xiàn)死亡，當(dāng)用藥15 d處死時，雖然腫瘤組織顯著減小，甚至有1只小鼠未發(fā)現(xiàn)瘤組織，但小鼠死亡量已達到7只。因此，該藥物25 μg/kg劑量以下低濃度長期給藥的方式適宜用于抗DLBCL治療。

Figure 3.The results of Hoechst 33342 μg/L staining (×200). Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 μg/L group.

圖3 Hoechst 33342染色結(jié)果

Figure 4.The results of qPCR. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 μg/L group.

圖4 qPCR檢測結(jié)果

討 論

蒽醌類化合物對多種腫瘤細胞的生長和增殖有抑制作用，而大黃酸作為醌類化合物重要成員，它可抑制惡性膠質(zhì)瘤細胞侵入正常腦組織，我們推測該藥物可能對DLBCL有一定的治療作用，而本研究中的MST實驗也證實了此點。當(dāng)DLBCL細胞株OCI-LY8經(jīng)2～50 μg/L大黃酸作用后，細胞活力明顯受抑制，且當(dāng)大黃酸濃度越大、作用時間越長，其抑制作用越明顯。同時Hoechst染色和流式細胞術(shù)檢測證實，大黃酸可誘導(dǎo)OCI-LY8細胞凋亡，而抑瘤實驗也表明大黃酸可在體內(nèi)抑制DLBCL腫瘤組織的生長，這些均與Blacher等[10]報道的大黃酸對多形性膠質(zhì)母細胞瘤抑制作用的研究結(jié)果相一致。此外，qPCR和Western blot檢測結(jié)果證實，OCI-LY8細胞經(jīng)大黃酸作用24 h后，細胞內(nèi)NF-κB通路相關(guān)蛋白及其通路下游的線粒體途徑相關(guān)分子NIK、Rip2、p52、p65和Bcl-xL的mRNA和蛋白水平顯著下調(diào)，IκBα蛋白磷酸化水平顯著降低，同時，凋亡的線粒體內(nèi)源途徑相關(guān)蛋白caspase-3水平增加，Bcl-xL下降，由此猜測大黃酸通過NF-κB信號通路發(fā)揮作用。

Figure 5.The results of Western blot. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 μg/L group.

圖5 Western blot檢測結(jié)果

Figure 6.The results of tumor inhibiting experiment. Mean±SD.n=10.**P<0.01vs0 μg/kg group.

圖6 荷瘤小鼠抑瘤實驗檢測結(jié)果

NF-κB為一個轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族，其成員包括p50(NF-κB1)、p52(NF-κB2)、p65(NF-κB3)、Rel(cRel)和RelB。在靜息細胞中，這些蛋白質(zhì)二聚化形成的NF-κB常常與細胞質(zhì)中的抑制因子(IκBα、IκBβ和IκBε)結(jié)合而失去活性。而IκB激酶復(fù)合體(IKK)及其激活劑NIK則可激活NF-κB，為腫瘤的增殖提供生長環(huán)境，對腫瘤的發(fā)生和發(fā)展起促進作用[11]。 當(dāng)細胞受到細胞外信號刺激后，IKK復(fù)合體活化，促使IκB磷酸化，使NF-κB暴露核定位位點。游離的NF-κB迅速移位到細胞核，與特異性κB序列結(jié)合，促進Bcl-xL和IL-1等基因的表達。Bcl-xL表達上調(diào)后將抑制促凋亡因子Bax移位插入線粒體外膜的功能。而Bax/Bcl-2為細胞凋亡信號的分子開關(guān)，其比值的下降將使線粒體膜的通透性降低，抑制了細胞色素C的釋放和caspase-3的活化[12]，細胞得以生存。而當(dāng)IL-1的表達水平增加后，IL-1將與細胞膜IL-1R結(jié)合，并將通過經(jīng)典途徑調(diào)控NF-κB，從而進一步抑制細胞凋亡的發(fā)生[13]。

在NF-κB信號通路中，RIP2是決定細胞生存或死亡的雙向功能適配器分子，為激發(fā)經(jīng)典NF-κB信號通路的重要成員，RIP2泛素化后可促進下游IKK復(fù)合體形成和NF-κB轉(zhuǎn)錄。因此，當(dāng)大黃酸誘使RIP2表達下調(diào)后，IKK復(fù)合體的形成和促IκBα磷酸化作用減弱，IκBα降解量減少，從而最終游離入核的p65/p52二聚體數(shù)量也相應(yīng)減少，最終OCI-LY8細胞凋亡水平增加[14]。NIK為非經(jīng)典NF-κB信號通路啟動分子，并被認為是套細胞淋巴瘤治療的新靶點[15]。當(dāng)大黃酸促使NIK表達下降后，p52前體(p100)被加工降解的比例也隨之降低，轉(zhuǎn)移到細胞核中的p52和p65異二聚也相應(yīng)減少[16]，進而下調(diào)了抗凋亡蛋白Bcl-xL和IL-1的水平，進一步誘導(dǎo)了OCI-LY8細胞凋亡。由此可以肯定，抑制NF-κB信號通路活化是大黃酸誘導(dǎo)DLBCL細胞OCI-LY8凋亡的重要機制。

綜上所述，適當(dāng)劑量的大黃酸可通過抑制OCI-LY8細胞NF-κB經(jīng)典和非經(jīng)典信號通路來抑制該細胞的增殖活性，并激活細胞線粒體相關(guān)的內(nèi)源凋亡通路，引起該細胞的凋亡。本實驗為DLBCL發(fā)病機制的探索、疾病的早期診斷和治療新藥的研發(fā)提供了實驗依據(jù)。