亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        大黃酸通過(guò)抑制NF-κB通路促進(jìn)DLBCL細(xì)胞OCI-LY8凋亡*

        2019-11-21 05:20:26胡施煒樓恩哲應(yīng)佳豪柯瑞君陳佳玉
        中國(guó)病理生理雜志 2019年11期
        關(guān)鍵詞:染色通路用藥

        胡施煒, 樓恩哲, 王 瑜, 應(yīng)佳豪, 柯瑞君, 陳佳玉

        (紹興文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院, 浙江 紹興 312000)

        彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)為好發(fā)于中老年男性的非霍奇金淋巴腫瘤(non-Hodgkin lymphoma,NHL)亞型之一,約占NHL的30%~40%[1]。近年來(lái)我國(guó)DLBCL的發(fā)病率呈上升趨勢(shì),在城市和農(nóng)村的腫瘤發(fā)病率中分別位居第8位和第10位。目前,經(jīng)典的一代CHOP和二代R-CHOP治療方案使DLBCL的治愈率可達(dá)60%,但仍有1/3的患者因藥物副作用等原因而未實(shí)現(xiàn)真正意義上的治療[2]。近期所研究的新型藥物的聯(lián)合靶向治療雖有一定療效,但預(yù)后不穩(wěn)定且易引發(fā)“細(xì)胞因子風(fēng)暴”,其中趨化因子介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞更因分泌促腫瘤因子而參與了DLBCL的進(jìn)展過(guò)程[3]。因此發(fā)現(xiàn)新的DLBCL輔助或替代藥物對(duì)實(shí)現(xiàn)DLBCL的完全治療十分重要。

        大黃酸(1, 8-二羥基-3-羧基蒽醌,rhein)為來(lái)源于大黃的蒽醌類化合物[4],它是保健品制備原料之一,在臨床上具有通便排毒、降脂減肥和延緩衰老的功效。研究顯示,大黃酸具有抗卵巢癌、肺癌和乳腺癌的作用[5-6],且可與其它中藥成分聯(lián)合,通過(guò)影響核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信號(hào)通路在炎癥疾病中發(fā)揮作用[7-8]。 NF-κB的持續(xù)活化與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有一定的相關(guān)性[9],而影響NF-κB信號(hào)通路的活化有可能影響DLBCL細(xì)胞生長(zhǎng)。大黃酸對(duì)DLBCL細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路的影響及其對(duì)DLBCL發(fā)生發(fā)展的具體作用目前尚未見詳細(xì)報(bào)道。 因此,本研究將大黃酸作用于DLBCL細(xì)胞株OCI-LY8和DLBCL荷瘤小鼠,并通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡和周期分布的流式細(xì)胞術(shù)分析、qPCR、Hoechst染色、Western blot和抑瘤實(shí)驗(yàn)等方法,探討了大黃酸對(duì)DLBCL細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡的作用及其作用的相關(guān)分子機(jī)制,以期為臨床治療DLBCL新藥的發(fā)現(xiàn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

        材 料 和 方 法

        1 實(shí)驗(yàn)材料

        4~5周齡雄性BALB/c裸鼠購(gòu)自浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK(滬)2013-0016。人源DLBCL細(xì)胞株OCI-LY8來(lái)源于DSMZ;EB病毒轉(zhuǎn)化的人B淋巴細(xì)胞CGM1購(gòu)自ATCC。大黃酸購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司(用5%的碳酸氫鈉配制貯備液);胰蛋白酶、胎牛血清、PBS和RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液購(gòu)自Gibco;AnnexinV-FITC/PI試劑盒和脫脂奶粉購(gòu)自BD;PCR引物由上海Sangon Biotech公司合成;DEPC水和TRIzol購(gòu)自Invitrogen;Hoechst 33342染色液、RIPA裂解液(強(qiáng))和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自Beyotime;CellTiter 96?AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay購(gòu)自Promega;ECL化學(xué)發(fā)光液購(gòu)自Sigma;dNTP混合物、逆轉(zhuǎn)錄酶、I 抗和酶標(biāo) II 抗購(gòu)自Boster Biotech;其它化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

        2 主要方法

        2.1MTS法檢測(cè)細(xì)胞活力 將DLBCL細(xì)胞OCI-LY8和EB病毒轉(zhuǎn)化的人B淋巴細(xì)胞CGM1分別置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中,在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,取細(xì)胞經(jīng)1 000 r/min離心5 min后去上清,分別用含有0、2、10、50和250 μg/L大黃酸的RPMI-1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至1×109/L,并接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔100 μL,設(shè)3復(fù)孔。將細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),于培養(yǎng)0、24、48和72 h取出培養(yǎng)板,分別加入MTS試劑10 μL,混勻后,將培養(yǎng)板繼續(xù)置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 min。取出培養(yǎng)板,并利用酶標(biāo)儀測(cè)量490 nm時(shí)各孔的吸光度(A)值,繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,分析大黃酸對(duì)細(xì)胞活力的影響,并根據(jù)結(jié)果篩選后續(xù)實(shí)驗(yàn)的最佳劑量。

        2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平 取分別經(jīng)0、10和50 μg/L大黃酸作用24 h的OCI-LY8和CGM1細(xì)胞各5×106個(gè),1 000 r/min離心5 min,棄上清,用PBS洗滌細(xì)胞2次,每次均經(jīng)1 000 r/min離心5 min回收細(xì)胞。用100 μL 1× Binding Buffer重懸細(xì)胞,加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI,混勻后避光染色30 min,PBS洗2次,經(jīng)1 000 r/min離心5 min回收細(xì)胞。用200 μL PBS懸浮細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)檢細(xì)胞凋亡水平,分析大黃酸對(duì)OCI-LY8細(xì)胞凋亡的影響。

        2.3Hoechst染色觀察細(xì)胞核型的變化 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的OCI-LY8細(xì)胞,分別用含0、10和50 μg/L大黃酸的RPMI-1640完全培養(yǎng)液于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h,1 000 r/min離心5 min,棄上清,PBS清洗細(xì)胞2次,每次均經(jīng)1 000 r/min離心5min回收細(xì)胞。于細(xì)胞沉淀中加入10 μg/L的Hoechst 33342染色液100 μL,輕輕混勻,于4 ℃避光染色20 min。離心棄染液,用PBS洗細(xì)胞2次,1 000 r/min離心5 min回收細(xì)胞。于細(xì)胞沉淀中加入PBS 1滴,混勻細(xì)胞,并將細(xì)胞滴加到載玻片上,在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的核型,并計(jì)數(shù)凋亡核型細(xì)胞所占的百分比。

        2.4qPCR法分析細(xì)胞內(nèi)基因的mRNA水平 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的OCI-LY8細(xì)胞,用分別含0 μg/L或50 μg/L大黃酸的RPMI-1640完全培養(yǎng)液于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h,1 000 r/min離心細(xì)胞5 min,棄上清,PBS清洗細(xì)胞2次,每次均經(jīng)1 000 r/min離心5 min回收細(xì)胞。用TRIzol提取細(xì)胞RNA(試劑用量和方法按說(shuō)明書),Nano Drop定量后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。設(shè)計(jì)并合成Rip2、β-actin、Bcl-xL、NIK、NF-κB和caspase-3的引物(引物序列見表1),qPCR法檢測(cè)各基因mRNA的Ct值,利用公式2-ΔΔCt計(jì)算各基因的mRNA相對(duì)含量,分析大黃酸對(duì)OCI-LY8細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。

        表1 qPCR引物序列

        2.5Western blot分析細(xì)胞內(nèi)的蛋白水平 取分別經(jīng)含有終濃度為0、10和50 μg/L大黃酸的RPMI-1640培養(yǎng)24 h后的OCI-LY8細(xì)胞,離心棄上清,用PBS洗滌細(xì)胞2次,每次均于4 ℃、1 000 r/min條件下離心5 min以回收細(xì)胞,完全棄上清后,用RIPA裂解液(強(qiáng))裂解各組細(xì)胞10 s,12 000 r/min離心20 min,回收上清。各上清中的細(xì)胞總蛋白用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒定量后,以GAPDH為內(nèi)參照,進(jìn)行Bcl-xL、NIK、p52、RIP2、IκBα、p65和caspase-3蛋白的Western blot檢測(cè)。用ImageJ軟件進(jìn)行各蛋白條帶的灰度檢測(cè)。

        2.6抑瘤實(shí)驗(yàn) 取4周齡BALB/c小鼠,并將其隨機(jī)分為6小組,每組10只。待其適應(yīng)環(huán)境 1 周后,在每只BALB/c裸鼠腹肌溝皮下接種1×107的OCI-LY8細(xì)胞0.1 mL,于腫瘤細(xì)胞接種2 d 后,分別尾靜脈注射0、1、5、25和125 μg/kg大黃酸,其后每2 d 用藥1次,在用藥15 d 后處死小鼠,解剖剝離腫瘤組織,稱瘤重并記錄,分析大黃酸的抑瘤效果。

        3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

        所有數(shù)據(jù)均經(jīng)SPSS 17.0軟件統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        結(jié) 果

        1 細(xì)胞活力的檢測(cè)結(jié)果

        MTS實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果表明,OCI-LY8細(xì)胞經(jīng)2、10、50和250 μg/L的大黃酸作用后,其活力均受到明顯的抑制(P<0.01),且其受抑程度隨著大黃酸用藥濃度和作用時(shí)間的增加越顯著,見圖1A。B淋巴細(xì)胞CGM1的活力在大黃酸用藥濃度低于50 μg/L時(shí)未受影響,但當(dāng)藥物劑量達(dá)到250 μg/L時(shí),CGM1細(xì)胞的活力亦受到顯著抑制(P<0.01),見圖1B。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇10 μg/L和50 μg/L為藥物作用劑量來(lái)分析藥物作用的分子機(jī)制。

        Figure 1.The results of cell viability by MTS assay. OCI-LY8 (A) and CGM1 (B) cells were treated with 0~250 μg/L rhein. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μg/L group.

        圖1 MTS法檢測(cè)細(xì)胞活力

        2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡的結(jié)果

        OCI-LY8細(xì)胞分別經(jīng)10 μg/L和50 μg/L大黃酸作用24 h后,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡率由0 μg/L組的0.13%±0.05%增加到16.72%±1.03%和28.24%±1.14%,其凋亡水平隨用藥劑量增加而增加(P<0.01);而CGM1細(xì)胞的凋亡水平未受明顯影響(P>0.05),見圖2。

        3 Hoechst 33342染色的結(jié)果觀察

        Hoechst 33342染色結(jié)果顯示,在10 μg/L和50 μg/L大黃酸作用下,部分OCI-LY8細(xì)胞的核染色質(zhì)濃縮,核碎裂,出現(xiàn)凋亡小體,且發(fā)生凋亡核型改變的細(xì)胞隨用藥劑量的增加而增加(P<0.01),見圖3。該結(jié)果與流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡的結(jié)果基本相符。

        Figure 2.The results of apoptotic rate examined by flow cytometry. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 μg/L group.

        圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率的結(jié)果

        4 qPCR檢測(cè)結(jié)果

        qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示,50 μg/L大黃酸作用OCI-LY8細(xì)胞24 h后,Rip2、Bcl-xL、NIK和NF-κB的mRNA水平均顯著下降(P<0.01),而caspase-3的mRNA水平增長(zhǎng)了近2倍(P<0.01),見圖4。

        5 Western blot檢測(cè)結(jié)果

        Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,與0 μg/L對(duì)照組相比,10 μg/L和50 μg/L大黃酸用藥組OCI-LY8細(xì)胞內(nèi)RIP2、NIK、p52、Bcl-xL、p-p65和p-IκBα蛋白水平顯著降低,而cleaved caspase-3的蛋白水平顯著上升(P<0.01),且蛋白含量的改變與用藥劑量相關(guān),見圖5。

        6 抑瘤實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

        大黃酸顯著抑制了荷DLBCL小鼠腫瘤組織的生長(zhǎng)(P<0.01),且其抑制作用隨大黃酸濃度的增加而加強(qiáng),見圖6。但當(dāng)用藥劑量達(dá)到125 μg/kg時(shí),于用藥3 d 后,動(dòng)物開始出現(xiàn)死亡,當(dāng)用藥15 d處死時(shí),雖然腫瘤組織顯著減小,甚至有1只小鼠未發(fā)現(xiàn)瘤組織,但小鼠死亡量已達(dá)到7只。因此,該藥物25 μg/kg劑量以下低濃度長(zhǎng)期給藥的方式適宜用于抗DLBCL治療。

        Figure 3.The results of Hoechst 33342 μg/L staining (×200). Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 μg/L group.

        圖3 Hoechst 33342染色結(jié)果

        Figure 4.The results of qPCR. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 μg/L group.

        圖4 qPCR檢測(cè)結(jié)果

        討 論

        蒽醌類化合物對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖有抑制作用,而大黃酸作為醌類化合物重要成員,它可抑制惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵入正常腦組織,我們推測(cè)該藥物可能對(duì)DLBCL有一定的治療作用,而本研究中的MST實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了此點(diǎn)。當(dāng)DLBCL細(xì)胞株OCI-LY8經(jīng)2~50 μg/L大黃酸作用后,細(xì)胞活力明顯受抑制,且當(dāng)大黃酸濃度越大、作用時(shí)間越長(zhǎng),其抑制作用越明顯。同時(shí)Hoechst染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)證實(shí),大黃酸可誘導(dǎo)OCI-LY8細(xì)胞凋亡,而抑瘤實(shí)驗(yàn)也表明大黃酸可在體內(nèi)抑制DLBCL腫瘤組織的生長(zhǎng),這些均與Blacher等[10]報(bào)道的大黃酸對(duì)多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤抑制作用的研究結(jié)果相一致。此外,qPCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果證實(shí),OCI-LY8細(xì)胞經(jīng)大黃酸作用24 h后,細(xì)胞內(nèi)NF-κB通路相關(guān)蛋白及其通路下游的線粒體途徑相關(guān)分子NIK、Rip2、p52、p65和Bcl-xL的mRNA和蛋白水平顯著下調(diào),IκBα蛋白磷酸化水平顯著降低,同時(shí),凋亡的線粒體內(nèi)源途徑相關(guān)蛋白caspase-3水平增加,Bcl-xL下降,由此猜測(cè)大黃酸通過(guò)NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮作用。

        Figure 5.The results of Western blot. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 μg/L group.

        圖5 Western blot檢測(cè)結(jié)果

        Figure 6.The results of tumor inhibiting experiment. Mean±SD.n=10.**P<0.01vs0 μg/kg group.

        圖6 荷瘤小鼠抑瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果

        NF-κB為一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族,其成員包括p50(NF-κB1)、p52(NF-κB2)、p65(NF-κB3)、Rel(cRel)和RelB。在靜息細(xì)胞中,這些蛋白質(zhì)二聚化形成的NF-κB常常與細(xì)胞質(zhì)中的抑制因子(IκBα、IκBβ和IκBε)結(jié)合而失去活性。而IκB激酶復(fù)合體(IKK)及其激活劑NIK則可激活NF-κB,為腫瘤的增殖提供生長(zhǎng)環(huán)境,對(duì)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展起促進(jìn)作用[11]。 當(dāng)細(xì)胞受到細(xì)胞外信號(hào)刺激后,IKK復(fù)合體活化,促使IκB磷酸化,使NF-κB暴露核定位位點(diǎn)。游離的NF-κB迅速移位到細(xì)胞核,與特異性κB序列結(jié)合,促進(jìn)Bcl-xL和IL-1等基因的表達(dá)。Bcl-xL表達(dá)上調(diào)后將抑制促凋亡因子Bax移位插入線粒體外膜的功能。而Bax/Bcl-2為細(xì)胞凋亡信號(hào)的分子開關(guān),其比值的下降將使線粒體膜的通透性降低,抑制了細(xì)胞色素C的釋放和caspase-3的活化[12],細(xì)胞得以生存。而當(dāng)IL-1的表達(dá)水平增加后,IL-1將與細(xì)胞膜IL-1R結(jié)合,并將通過(guò)經(jīng)典途徑調(diào)控NF-κB,從而進(jìn)一步抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生[13]。

        在NF-κB信號(hào)通路中,RIP2是決定細(xì)胞生存或死亡的雙向功能適配器分子,為激發(fā)經(jīng)典NF-κB信號(hào)通路的重要成員,RIP2泛素化后可促進(jìn)下游IKK復(fù)合體形成和NF-κB轉(zhuǎn)錄。因此,當(dāng)大黃酸誘使RIP2表達(dá)下調(diào)后,IKK復(fù)合體的形成和促IκBα磷酸化作用減弱,IκBα降解量減少,從而最終游離入核的p65/p52二聚體數(shù)量也相應(yīng)減少,最終OCI-LY8細(xì)胞凋亡水平增加[14]。NIK為非經(jīng)典NF-κB信號(hào)通路啟動(dòng)分子,并被認(rèn)為是套細(xì)胞淋巴瘤治療的新靶點(diǎn)[15]。當(dāng)大黃酸促使NIK表達(dá)下降后,p52前體(p100)被加工降解的比例也隨之降低,轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中的p52和p65異二聚也相應(yīng)減少[16],進(jìn)而下調(diào)了抗凋亡蛋白Bcl-xL和IL-1的水平,進(jìn)一步誘導(dǎo)了OCI-LY8細(xì)胞凋亡。由此可以肯定,抑制NF-κB信號(hào)通路活化是大黃酸誘導(dǎo)DLBCL細(xì)胞OCI-LY8凋亡的重要機(jī)制。

        綜上所述,適當(dāng)劑量的大黃酸可通過(guò)抑制OCI-LY8細(xì)胞NF-κB經(jīng)典和非經(jīng)典信號(hào)通路來(lái)抑制該細(xì)胞的增殖活性,并激活細(xì)胞線粒體相關(guān)的內(nèi)源凋亡通路,引起該細(xì)胞的凋亡。本實(shí)驗(yàn)為DLBCL發(fā)病機(jī)制的探索、疾病的早期診斷和治療新藥的研發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

        猜你喜歡
        染色通路用藥
        高血壓用藥小知識(shí)
        中老年保健(2021年5期)2021-08-24 07:07:16
        用藥不當(dāng) 反受其害
        治病·致病·致命——用藥需慎重
        用藥不如用樂——三擇音樂養(yǎng)生法
        平面圖的3-hued 染色
        簡(jiǎn)單圖mC4的點(diǎn)可區(qū)別V-全染色
        油紅O染色在斑馬魚體內(nèi)脂質(zhì)染色中的應(yīng)用
        Kisspeptin/GPR54信號(hào)通路促使性早熟形成的作用觀察
        proBDNF-p75NTR通路抑制C6細(xì)胞增殖
        通路快建林翰:對(duì)重模式應(yīng)有再認(rèn)識(shí)
        涩涩鲁精品亚洲一区二区 | av高清视频在线麻豆免费观看| 国产精品国产三级国产av18| 女局长白白嫩嫩大屁股| 亚洲爆乳无码专区| 国产成人精品一区二免费网站| 香港三级日本三韩级人妇久久| 欧美综合天天夜夜久久| 国产午夜视频在线观看| 超碰观看| 国产丝袜美腿在线播放| …日韩人妻无码精品一专区| 激情内射亚洲一区二区三区爱妻 | 欧美性受xxxx白人性爽| 国产高潮精品久久AV无码| 福利视频自拍偷拍视频| 国产亚洲精品一区二区无| 国产黄在线观看免费观看不卡| 无夜精品久久久久久| 国产激情在线观看视频网址| аⅴ天堂中文在线网| 亚洲av无码片在线观看| 亚洲综合久久1区2区3区| 中文字幕乱码亚洲三区| 丰满少妇呻吟高潮经历| 国产欧美乱夫不卡无乱码| 冲田杏梨av天堂一区二区三区| 亚洲女人毛茸茸粉红大阴户传播| 国产女人高潮视频在线观看| 久久九九青青国产精品| 91人妻一区二区三区蜜臀| 久爱www人成免费网站| 欧美日韩亚洲精品瑜伽裤| 国产精品女同一区二区久| 蜜桃精品人妻一区二区三区| 在线观看免费人成视频色9| 亚洲先锋影院一区二区| 少妇精品揄拍高潮少妇桃花岛| 中文字幕中文有码在线| 日韩精品中文字幕无码专区| 亚洲女同恋中文一区二区|