楊麗娟， 葛 賀， 安麗萍， 孫 新， 郭 鵬， 劉 杰， 林珈羽， 劉艷波△

(北華大學(xué) 1醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室， 2吉林省分子老年醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 3藥學(xué)院微生物與生化藥學(xué)教研室， 吉林 吉林 132013； 4北華大學(xué)附屬醫(yī)院腎病風(fēng)濕病科， 吉林 吉林 132011)

1941年美國(guó)芝加哥大學(xué)的Huggins和Hodges最先報(bào)道了切除雙側(cè)睪丸(去勢(shì)，castration)在轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者中的良好療效，奠定了內(nèi)分泌治療前列腺癌的基礎(chǔ)[1]。去勢(shì)主要降低雄激素的含量，但由于雄激素合成及代謝的復(fù)雜性，單純?nèi)?shì)治療不能完全阻斷體內(nèi)雄激素，這是因?yàn)槟I上腺網(wǎng)狀帶產(chǎn)生的雙氫睪酮(dihydrotestosterone，DHT)不會(huì)因去勢(shì)而消失[2]。DHT作用強(qiáng)大，其生物效應(yīng)是生殖組織的1.5～2.5倍；而且，DHT與雄激素受體(androgen receptor，AR)的結(jié)合能力要比睪酮(testosterone，T)大4～5倍。DHT與AR結(jié)合后，激活雄激素下游基因，進(jìn)而控制前列腺細(xì)胞增殖和分裂，使得激素依賴性前列腺癌(hormone-dependent prostate cancer，HDPC)最終發(fā)展成激素非依賴性前列腺癌(hormone-independent prostate cancer，HIPC)[3]。因此，延緩HIPC發(fā)生發(fā)展，延長(zhǎng)患者生存期，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

硒是人體必需的微量元素，具有明顯免疫增強(qiáng)效應(yīng)，對(duì)前列腺癌的預(yù)防及治療效果顯著。但無(wú)機(jī)硒化物在低濃度時(shí)即表現(xiàn)細(xì)胞脫壁、細(xì)胞內(nèi)空泡增多、細(xì)胞膜破裂、細(xì)胞壞死和急性溶解等毒性作用[4]；而有機(jī)硒具有防治前列腺癌的效應(yīng)，如每天補(bǔ)充200 μg的硒可使前列腺癌的發(fā)病危險(xiǎn)性降低50%；含硒化合物可抑制LNCaP、PC-3和DU145細(xì)胞的增殖[5-6]。Dong等[7]發(fā)現(xiàn)，甲基化硒酸(methyl-seleninic acid，MSA)可抑制AR與雄激素受體反應(yīng)原件(androgen receptor element，ARE)的結(jié)合，干擾雄激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)，從而降低前列腺癌的發(fā)病率或延遲HIPC的發(fā)生[8]。

因此，本文通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)觀察MSA對(duì) LNCaP抑制作用并探討相關(guān)機(jī)制，進(jìn)而通過(guò)裸鼠前列腺癌去勢(shì)后復(fù)發(fā)模型，探討甲基硒代半胱氨酸(methylselenocysteine，MSC)延緩HIPC的作用及相關(guān)機(jī)制，為前列腺癌靶向輔助治療奠定基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞株及動(dòng)物

HDPC細(xì)胞株LNCaP由吉林大學(xué)前列腺癌防治研究中心趙雪儉教授饋贈(zèng)；用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，0.25%胰酶消化傳代。10只BALB/c-nu/nu雄性裸鼠購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，4～6周齡，體重18～20 g，于恒定溫度(22～25 ℃)、恒定濕度(40%-50%)的SPF層流室中飼養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)飼料及水經(jīng)高壓滅菌后供動(dòng)物自由食用，該動(dòng)物研究符合國(guó)際公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)，并得到了北華大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

2 主要試劑

MSA和MSC由美國(guó)杜蘭大學(xué)張海濤博士惠贈(zèng)(Sigma)；DNA marker DL2000和DNA marker DL15000購(gòu)自TaKaRa；溴化乙錠、瓊脂糖、SDS、TEMED、丙烯酰胺、N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺、MTT、DTT、DMSO、PE-Texas Red和PMSF購(gòu)自Sigma；DEPC購(gòu)自Merck；高保真Taq DNA聚合酶、DAB、Triton X-100、dNTP和MMV逆轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自Promega；TRIzol購(gòu)自Invitrogen；胰酶、IMDM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自HyClone；其它常規(guī)化學(xué)試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。鼠抗人AR、前列腺特異性抗原(prostate-specific antigen，PSA)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)多克隆抗體及堿性磷酸酶與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔多克隆抗體購(gòu)自santa Cruz；PSA試劑盒購(gòu)自CanAG；兔抗人β-actin多克隆抗體和TUNEL原位雜交試劑盒購(gòu)于武漢博士德公司。

3 主要儀器

PCR擴(kuò)增儀(GeneAmp)；倒置相差顯微鏡和熒光顯微鏡(Olympus)；超凈工作臺(tái)(YZ-875蘇州凈化設(shè)備廠)；自動(dòng)CO2恒溫培養(yǎng)箱(SANYO)；電泳儀、蛋白質(zhì)電泳裝置及轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(Bio-Rad)；凝膠成像系統(tǒng)(Tanon)；紫外分光光度計(jì)及分析工作站(Shimadazi)。

4 主要方法

4.1LNCaP細(xì)胞的培養(yǎng)及生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn) 將LNCaP細(xì)胞分為4組：即對(duì)照(mock)組、MSA低劑量(1.25 μmol/L)組、MSA中劑量(2.50 μmol/L)組和MSA高劑量(5.00 μmol/L)組。當(dāng)培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞達(dá)到70%融合時(shí)，分組加藥，設(shè)立24 h、48 h和72 h 3個(gè)時(shí)點(diǎn)，預(yù)定時(shí)段每孔加入50 μL經(jīng)4 ℃預(yù)冷的500 mL/L三氯醋酸，使終濃度為100 mL/L，置4 ℃放置1 h，自來(lái)水充分漂洗，空氣干燥后，加4 g/L磺酰羅丹明B(sulforhodamine B, SRB)染色15～30 min，醋酸洗滌、干燥，加入10 mmol/L Tris液100 μL溶解，微振器上振蕩10 min，酶聯(lián)檢測(cè)儀上于波長(zhǎng)570 nm處測(cè)吸光度(A)值。抑制率(%)=(對(duì)照組A均值-實(shí)驗(yàn)組A均值)/對(duì)照組A均值×100%。

4.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡 將加藥處理后的細(xì)胞快速推入70%冷乙醇中，4 ℃固定12 h，用RNase消化后，加入1.5 mL PE-Texas Red (75 mg/L)對(duì)DNA進(jìn)行染色，細(xì)胞混勻后在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行單參數(shù)分析。

4.3RT-PCR法檢測(cè)AR、PSA和STAT3的mRNA表達(dá) 根據(jù)PCR引物設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)人源性AR、PSA、STAT3和β-actin的引物序列，見(jiàn)表1。采用RNeasy Mini試劑盒分離純化各組細(xì)胞的總RNA，分光光度法計(jì)算提取的總RNA含量及濃度。參照OneStep RT-PCR試劑盒實(shí)驗(yàn)操作說(shuō)明進(jìn)行RT-PCR，總反應(yīng)體積50.0 μL： 5× OneStep RT-PCR buffer 10.0 μL，dNTP Mix 2.0 μL，OneStep RT-PCR Enzyme Mix 2.0 μL，5× Q-Solution 10.0 μL，RNase inhibitor 10 U，RNA 1.0 μg，引物 0.6 μmol/L。擴(kuò)增條件為： 50 ℃ 逆轉(zhuǎn)錄30 min、95 °C初始化15 min；94 °C變性 1 min、55 ℃ ～57 ℃ 1 min、72 °C 1 min，28～30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。在2%瓊脂糖凝膠上電泳，70 V、 40 min，凝膠圖像成像系統(tǒng)拍攝保存實(shí)驗(yàn)結(jié)果，凝膠圖像分析系統(tǒng)(GelPro Analyzer 3.0)分析各目的基因與β-actin條帶吸光度值。

表1 RT-PCR的引物序列

4.4Western blot法檢測(cè)AR、PSA和STAT3蛋白的表達(dá) 取蛋白50 μg加入等體積2×上樣緩沖液，于100 ℃沸水中熱變性10 min，上樣。電泳結(jié)束后經(jīng)Bio-Rad半干式轉(zhuǎn)膜60 min，blocking buffer(5%脫脂奶粉)室溫封閉2 h。TBST洗膜，鼠抗人PSA(1 ∶300)和AR(1 ∶500) 抗體稀釋溶于TBST中，4 ℃與膜孵育過(guò)夜，TBST洗膜；加入1 ∶300稀釋的生物素標(biāo)記的羊抗小鼠IgG II 抗，室溫孵育60 min，TBST洗膜；再加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的III抗，室溫孵育60 min，TBST洗膜。加入DAB顯色，待特異性條帶信號(hào)清晰可見(jiàn)時(shí)用stop buffer終止染色。采用天能科技有限公司GIS凝膠圖像分析系統(tǒng)處理相關(guān)信號(hào)。

4.5免疫熒光染色 各組細(xì)胞于加藥48 h后用PBS清洗，新鮮配制的4%多聚甲醛固定細(xì)胞20 min，PBS充分洗滌，0.2% Triton X-100打孔10 min，PBS洗后1%BSA室溫孵育15 min，封閉非特異性位點(diǎn)；滴加STAT3多克隆抗體(1 ∶300)室溫孵育2 h，2.7% NaCl 洗滌后PBS清洗；滴加CY3標(biāo)記的熒光 II 抗(1 ∶20由1%PBS BSA配制)避光室溫孵育細(xì)胞1 h，熒光顯微鏡下觀察，拍照。

4.6免疫細(xì)胞化學(xué)染色 6孔培養(yǎng)板內(nèi)接種5×105細(xì)胞，37 ℃、5% CO2中培養(yǎng)，次日加藥，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，PBS清洗，迅速經(jīng)4%多聚甲醛的固定液中于 4 ℃固定過(guò)夜，0.2% Triton X-100處理10 min，并用封閉液封閉1 h。然后分別用抗STAT3抗體(1 ∶500)4 ℃孵育24 h。用PBS 洗3遍后，用Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG(1 ∶500)在室溫下進(jìn)行染色標(biāo)記、觀察。細(xì)胞圖像通過(guò)顯微鏡用 ×10或 ×20物鏡攝取。每組獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)都會(huì)采集超過(guò)30個(gè)區(qū)域的細(xì)胞。而且，在明視野下所采集的每幅圖像都盡量包含相同的細(xì)胞數(shù)目。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0專業(yè)圖像分析軟件分析各實(shí)驗(yàn)組的熒光圖片單個(gè)細(xì)胞的累積吸光度值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

4.7裸鼠移植瘤動(dòng)物模型的建立 將LNCaP 細(xì)胞用胰酶消化成細(xì)胞懸液，離心，將細(xì)胞團(tuán)塊混合于Matrgel(4 ℃)中，取LNCaP 細(xì)胞1×107個(gè)接種于裸鼠背部皮下。待移植瘤長(zhǎng)至直徑10 mm時(shí)將瘤無(wú)菌條件下取出，分成直徑約2 mm×2 mm的瘤塊，裸鼠腹腔注射100 mg/kg氯胺酮，強(qiáng)力碘消毒皮膚，將瘤塊植入10只裸鼠背部皮下，縫合。密切觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，待腫瘤長(zhǎng)到5 mm時(shí)，切除睪丸，進(jìn)行手術(shù)去勢(shì)。

4.8裸鼠前列腺癌去勢(shì)模型的建立 10只裸鼠重新麻醉，消毒下腹部，垂直腹中線在陰囊處打開(kāi)切口，切除睪丸，結(jié)扎睪丸動(dòng)脈，縫合皮膚。將裸鼠隨機(jī)分為2組，每組5只，去勢(shì)組即日起每天MSC灌胃，MSC的劑量為每天5 μg/g，對(duì)照組給予生理鹽水200 μL灌胃，連續(xù)給藥16周。

4.9一般指標(biāo)觀察 密切觀察裸鼠生活變化，每周測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑(L)和短徑(W)，根據(jù)公式 V=L×W2×0.52計(jì)算腫瘤體積，繪制腫瘤的生長(zhǎng)曲線。實(shí)驗(yàn)畢，全麻法處死小鼠，完整分離腫瘤，稱瘤重，游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤長(zhǎng)徑和短徑并計(jì)算體積，觀察是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等；腫瘤組織固定、石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡下觀察形態(tài)變化。同時(shí)分離血清進(jìn)行PSA含量測(cè)定。

4.10TUNEL法檢測(cè)腫瘤組織的細(xì)胞凋亡 腫瘤組織10%福爾馬林固定48 h，石蠟包埋。切片常規(guī)脫蠟入水。新鮮配制3% H2O2封閉10 min。切片滴加Proteinase K緩沖液37 ℃消化15 min。TdT和DIG-dUTP各1 μL加入18 μL標(biāo)記緩沖液中，混勻，與組織共孵育，37 ℃標(biāo)記2 h。TBS清洗后加封閉液，室溫孵育30 min。用封閉液1 ∶100稀釋生物素化抗地高辛抗體，每片50 μL。37 ℃反應(yīng)30 min。TBS清洗后滴加SABC，繼續(xù)反應(yīng)60 min。TBS清洗，DAB顯色。水洗，蘇木素輕度復(fù)染。脫水，透明，封片，顯微鏡觀察。細(xì)胞核染為棕黃色的即是凋亡細(xì)胞，每張切片觀察3個(gè)視野，每個(gè)視野連續(xù)數(shù)300個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞百分比即為凋亡指數(shù)(apoptotic index, AI)。AI(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

4.11ELISA測(cè)定血清PSA的含量 10只裸鼠于接種腫瘤前、去勢(shì)前、去勢(shì)后1周分別眼眶取血進(jìn)行血清PSA含量的測(cè)定。將PSA抗體包被的微孔固定到支架上；在微孔中加入25 μL對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品或血清試樣；加入100 μL酶結(jié)合物(空白組不加)；室溫下孵育30 min；去除溫育混合物，用配置好的清洗液清洗微孔；在每個(gè)微孔中依次加入100 μL顯色液A和顯色液B(包括顯色液空白組)。室溫孵育10 min；每個(gè)微孔中加入50 μL終止液；通過(guò)微孔反應(yīng)板酶標(biāo)儀，在波長(zhǎng)450 nm處讀取吸光度(A)值。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 MSA抑制LNCaP細(xì)胞生長(zhǎng)

在預(yù)定時(shí)點(diǎn)檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，以mock組的生長(zhǎng)抑制率為0%，給藥24 h、48 h和72 h后，1.25、2.50和5.00 μmol/L MSA組細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率隨藥物濃度的增加而增加，依培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而增加，表現(xiàn)出明顯的時(shí)間和劑量依賴關(guān)系(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 MSA對(duì)LNCaP細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

Table 2.Effect of MSA on the growth of LNCaP cells (Mean±SD.n=4)

GroupGrowth inhibitory rate (%)24 h48 h72 hMock0001.25 μmol/L 1.24±0.285.36±1.569.21±2.882.50 μmol/L 9.23±3.7221.62±9.21?39.42±4.87?#5.00 μmol/L 18.36±2.96?#30.67±7.73 ?#65.32±12.11?#

*P<0.05vsmock group;#P<0.05vs1.25 μmol/L group.

2 MSA對(duì)LNCaP細(xì)胞周期分布及凋亡的影響

LNCaP細(xì)胞經(jīng)1.25、2.50和5.00 μmol/L MSA處理48 h后，快速推入70%冷乙醇中，4 ℃固定，RNase消化后用PE-Texas Red溶液對(duì)DNA進(jìn)行染色，用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行單參數(shù)分析，結(jié)果顯示隨MSA濃度增大，細(xì)胞凋亡率隨著增加，且細(xì)胞主要停滯在G0/G1期,見(jiàn)圖1、表3。

Figure 1.Apoptosis and cell cycle of LNCaP cells treated with MSA at different doses.

圖1 MSA對(duì)LNCaP細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響

表3 MSA對(duì)LNCaP細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響

Table 3.Apoptosis and cell cycle analysis in the LNCaP cells treated with MSA (%. Mean±SD.n=3)

GroupApoptotic cellsG0/G1SMock 0.90±0.65 39.90±2.53 56.70±6.27 1.25 μmol/L MSA 14.70±1.45? 46.20±2.36 28.70±4.73? 2.50 μmol/L MSA 33.10±2.36? 53.30±3.19?44.90±5.38? 5.00 μmol/L MSA52.80±2.87??#68.80±3.64?# 24.30±4.56?

*P<0.05,**P<0.01vsmock group;#P<0.05vs1.25 μmol/L MSA group.

3 MSA對(duì)AR及PSA mRNA表達(dá)的影響

與mock組相比，不同濃度的MSA作用于LNCaP細(xì)胞48 h后PSA及AR的mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05)，以5.00 μmol/L MSA組最為明顯,見(jiàn)圖2。

Figure 2.The mRNA expression of AR and PSA in the LNCaP cells treated with MSA at different doses. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsmock group.

圖2 MSA對(duì)LNCaP細(xì)胞AR及PSA mRNA表達(dá)的影響

4 MSA對(duì)AR及PSA 蛋白表達(dá)的影響

與mock組相比，2.50 μmol/L和5.00 μmol/L濃度的MSA與LNCaP孵育48 h明顯降低LNCaP細(xì)胞內(nèi)AR及PSA 蛋白的表達(dá)(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

5 MSA對(duì)LNCaP細(xì)胞STAT3表達(dá)的影響

利用免疫熒光法檢測(cè)LNCaP細(xì)胞內(nèi)STAT3的表達(dá)與定位，結(jié)果顯示mock組STAT3陽(yáng)性的紅色熒光位于胞漿及胞核，5.00 μmol/L MSA處理后LNCaP細(xì)胞 STAT3陽(yáng)性的紅色熒光數(shù)量明顯減少，強(qiáng)度明顯降低,見(jiàn)圖4。

Figure 3.The protein expression of AR and PSA in the LNCaP cells treated with MSA at different doses. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsmock group.

圖3 MSA對(duì)LNCaP細(xì)胞AR及PSA蛋白表達(dá)的影響

免疫細(xì)胞化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，mock組細(xì)胞增殖旺盛，STAT3蛋白的陽(yáng)性表達(dá)顆粒主要位于胞漿，也有少部分位于胞核內(nèi)，而5.00 μmol/L MSA組STAT3蛋白表達(dá)明顯下降，見(jiàn)圖4。

Figure 4.STAT3 expression in the LNCaP cells treated with MSA observed by immunofluorescence (A) and immunocytochemical (B) methods (×200).

圖4 免疫熒光及免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)STAT3表達(dá)

6 MSC對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響

裸鼠接種瘤塊20 d后，10只裸鼠全部出瘤，瘤體積平均為(172.56±20.36) mm3，切除睪丸進(jìn)行去勢(shì)，mock組每天200 μL生理鹽水灌胃，治療組每天5 μg/g MSC灌胃，連續(xù)給藥16周，實(shí)驗(yàn)期間裸鼠腫瘤的生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖5，由該生長(zhǎng)曲線可知，去勢(shì)后2組動(dòng)物的腫瘤體積均明顯回縮，表現(xiàn)良好的治療效果。mock組動(dòng)物移植瘤從第8周開(kāi)始生長(zhǎng)加快，接近去勢(shì)之前水平。而MSC組第11周腫瘤體積達(dá)到去勢(shì)前水平，說(shuō)明MSC有延緩去勢(shì)后前列腺癌生長(zhǎng)的作用，從第13周開(kāi)始，兩組動(dòng)物移植瘤體積的差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖5。第16周時(shí)處死動(dòng)物，見(jiàn)圖 6，取移植瘤測(cè)量體積并稱重，與mock組相比，MSC治療組移植瘤重量明顯減輕(P<0.05)，體積明顯減小(P<0.05)，見(jiàn)圖7。

7 MSC對(duì)PSA分泌的影響

于接種腫瘤前、去勢(shì)前和去勢(shì)1周后眶內(nèi)用毛細(xì)管采血，治療16周后斷頭取血，分別進(jìn)行PSA含量測(cè)定。結(jié)果顯示，正常雄性裸鼠PSA含量低，接種LNCaP細(xì)胞后PSA分泌增加，去勢(shì)前PSA含量明顯高于接種細(xì)胞前，去勢(shì)1周后PSA水平迅速下降(P<0.05)，說(shuō)明去勢(shì)干擾PSA合成與分泌；MSC治療16周后PSA增加，但MSC組增加緩慢，與同期mock組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表4。

Figure 5.The tumor growth curve of the nude mice treated with MSC after castration. Mean±SD.n=5.*P<0.05vsmock group.

圖5 MSC對(duì)裸鼠皮下移植瘤去勢(shì)后生長(zhǎng)的影響

Figure 6.The LNCaP cell xenografts in the nude mice treated with MSC after castration.

圖6 去勢(shì)16周后裸鼠前列腺癌皮下移植瘤生長(zhǎng)情況

Figure 7.The weight and volume of the xenografts in the nude mice treated with MSC for 16 weeks after castration. Mean±SD.n=5.*P<0.05vsmock group.

圖7 MSC對(duì)裸鼠前列腺癌皮下移植瘤體積及重量的影響

表4 MSC治療前后裸鼠血清PSA水平的變化

*P<0.05vsbefore inoculation;#P<0.05vsbefore castration;▲P<0.05vsmock at killed time.

8 MSC對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響

TUNEL法檢測(cè)移植瘤組織細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示mock組的細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，細(xì)胞核大而深染，凋亡細(xì)胞少，而MSC治療組的腫瘤組織內(nèi)細(xì)胞數(shù)量明顯減少，結(jié)構(gòu)疏松，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)不夠旺盛，可見(jiàn)大量細(xì)胞核染為棕黃色的凋亡細(xì)胞，MSC組凋亡指數(shù)明顯高于mock組(P<0.05)，見(jiàn)圖8、表5。

Figure 8.The apoptosis in the xenografts of the mice treated with MSC for 16 weeks. A: mock group; B: MSC group (×400).

圖8 MSC對(duì)前列腺癌皮下移植瘤細(xì)胞凋亡的影響

表5 MSC對(duì)前列腺癌皮下移植瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及凋亡的影響

Table 5.The effects of MSC on viability index (VI) and apoptotic index (AI) of the xenografts in nude mice (Mean±SD.n=5)

Group AI (%)VI (%)Mock 4.93±1.6292.64±9.25MSC52.60±10.67??54.80±7.64?

*P<0.05,**P<0.01vsmock group.

9 MSC對(duì)相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

RT-PCR結(jié)果可見(jiàn)MSC可明顯抑制AR、PSA及STAT3的mRNA水平(P<0.05)，見(jiàn)圖9。

Figure 9.The relative mRNA levels of AR, PSA and STAT3 in the LNCaP cell xenografts after castration and treated with MSC.Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmock group.

圖9 MSC對(duì)前列腺癌移植瘤相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

10 MSC對(duì)相關(guān)蛋白水平的影響

提取腫瘤組織總蛋白及核蛋白進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果顯示,與mock組相比，MSC組的STAT3、PSA和AR蛋白水平明顯下調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)圖10。

Figure 10.The relative protein levels of AR, PSA and STAT3 in the LNCaP cell xenografts after castration of the mice treated with MSC. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmock group.

圖10 MSC對(duì)前列腺癌移植瘤相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

討 論

AR在全身各組織均存在，但主要位于前列腺上皮細(xì)胞及部分基質(zhì)細(xì)胞中[9]。AR的改變?cè)谇傲邢侔┌l(fā)生、發(fā)展中作用以及與內(nèi)分泌治療的關(guān)系受到研究者的廣泛關(guān)注。HDPC仍穩(wěn)定表達(dá)AR，其在HIPC進(jìn)展過(guò)程中不但沒(méi)有消失，通過(guò)抗雄激素治療后反而有基因擴(kuò)增現(xiàn)象。前列腺癌細(xì)胞通過(guò)AR異常增加來(lái)適應(yīng)較低水平的血清雄激素，使細(xì)胞對(duì)低濃度雄激素的敏感性增加，進(jìn)而發(fā)展成為HIPC，成為抗雄激素治療失敗的原因之一。

本研究發(fā)現(xiàn)，MSA體外具有抑制前列腺癌LNCaP細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，通過(guò)分子生物學(xué)手段證實(shí)，MSA抑制前列腺癌LNCaP細(xì)胞AR表達(dá)，使得雄激素與受體結(jié)合量減少，對(duì)前列腺癌生長(zhǎng)的支撐作用減弱，延緩癌細(xì)胞的生長(zhǎng)甚至造成前列腺癌細(xì)胞凋亡。

PSA是由前列腺上皮細(xì)胞分泌的單鏈糖蛋白，具有糜蛋白酶活性。PSA存在于正常和前列腺癌組織、前列腺液和精液中，而精液中的濃度很高，血清中的濃度很低。血清中的PSA呈結(jié)合與非結(jié)合兩種形式出現(xiàn)[10]，大多數(shù)血清PSA與蛋白酶拮抗劑如α1-抗糜蛋白酶或α2-巨球蛋白結(jié)合，血清結(jié)合的PSA占多數(shù)，游離的僅占10%～20%。當(dāng)腫瘤細(xì)胞破壞由內(nèi)皮層、基底細(xì)胞層和基底膜構(gòu)成的屏障時(shí)，腺泡內(nèi)容物即可進(jìn)入血循環(huán)，導(dǎo)致外周血PSA水平升高。PSA具有較高的組織特異性，PSA在血清中的含量與疾病的發(fā)展階段相關(guān)，可及時(shí)反映前列腺癌患者的治療情況[11]。Zhang等[12]將MSA加入LNCaP細(xì)胞培養(yǎng)液中，利用基因芯片發(fā)現(xiàn)，多種細(xì)胞周期調(diào)控基因的mRNA表達(dá)水平發(fā)生了劇烈變化，同時(shí)細(xì)胞增殖受抑，細(xì)胞大量積聚在G0/G1期，同時(shí)抑制雄激素受體的表達(dá)并降低PSA的分泌量。本研究體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MSA具有下調(diào)PSA表達(dá)的效應(yīng)，其機(jī)制與MSA下調(diào)AR表達(dá)，使得雄激素與AR的結(jié)合減少，短期內(nèi)減弱對(duì)下游基因的調(diào)節(jié)功能，使PSA的表達(dá)降低，癌細(xì)胞增殖作用減弱，生長(zhǎng)抑制效應(yīng)增強(qiáng)，并出現(xiàn)明顯細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，為含硒藥物治療前列腺癌的應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

為了證實(shí)含硒藥物對(duì)前列腺癌生長(zhǎng)的影響，本研究構(gòu)建了裸鼠前列腺癌皮下移植瘤去勢(shì)后復(fù)發(fā)模型。LNCaP細(xì)胞接種到裸鼠背部皮下可成瘤，說(shuō)明HDPC構(gòu)建成功。待腫瘤生長(zhǎng)至一定體積后進(jìn)行去勢(shì)，腫瘤生長(zhǎng)迅速回縮，證實(shí)移植瘤對(duì)雄激素剝奪治療的敏感性，此時(shí)動(dòng)物體內(nèi)PSA含量降低，進(jìn)一步證實(shí)去勢(shì)治療的有效性。待去勢(shì)發(fā)生后8周，腫瘤重新出現(xiàn)，說(shuō)明去勢(shì)治療前期有效，而后出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)，一般為HIPC。但MSC治療組腫瘤復(fù)發(fā)時(shí)間延后，腫瘤體積明顯小于相應(yīng)時(shí)段mock組體積，說(shuō)明MSC具有延緩HIPC發(fā)生發(fā)展作用。體外研究成果顯示，有機(jī)硒一方面干擾PSA的合成，一方面降解PSA，使血中PSA的水平降低，從而抑制前列腺癌的生長(zhǎng)。而利用LNCaP細(xì)胞復(fù)制前列腺癌裸鼠模型，每日給小鼠腹腔注射MSC，發(fā)現(xiàn)MSC處理后小鼠腫瘤明顯變小且腫瘤組織內(nèi)AR受體減少，血中PSA濃度降低，說(shuō)明含硒化物在體內(nèi)也可以發(fā)揮抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。本實(shí)驗(yàn)在預(yù)定時(shí)間處死動(dòng)物，兩組動(dòng)物血清中PSA含量均增加，但MSC可延緩血清中PSA的增加速度和水平，同時(shí)移植瘤的生長(zhǎng)速度緩慢；RT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MSC組動(dòng)物腫瘤組織PSA及AR的mRNA轉(zhuǎn)錄水平下降及蛋白表達(dá)均較mock組明顯降低，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果證實(shí)，去勢(shì)后mock組動(dòng)物腫瘤組織AR的表達(dá)量及強(qiáng)度均降低，說(shuō)明MSC可干擾AR表達(dá)的某些環(huán)節(jié)。根據(jù)前期的研究結(jié)論：硒既可干擾AR的轉(zhuǎn)錄，又干擾AR與ARE的結(jié)合，從而阻斷了AR的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致下游基因PSA等的轉(zhuǎn)錄及翻譯受到抑制，進(jìn)而預(yù)防前列腺癌的發(fā)生或延緩(抑制)AIPC的產(chǎn)生。

為了探討MSC延緩去勢(shì)后HIPC發(fā)生的機(jī)制，本研究利用RT-PCR、Western blot和組織學(xué)等技術(shù)檢測(cè)了MSC對(duì)STAT3表達(dá)影響，結(jié)果顯示MSC可下調(diào)STAT3 的mRNA及蛋白表達(dá)，與mock組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。STAT3是轉(zhuǎn)錄信號(hào)傳導(dǎo)子與激活子家族的重要成員，受IL-6、EGF、PDGF和CSF-I等調(diào)節(jié)，這些細(xì)胞因子與細(xì)胞膜表面受體相互作用激活JAK-STAT途徑發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)作用。在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中，STAT3作用獨(dú)特，它可通過(guò)替代機(jī)制激活A(yù)R，AR與配體T靶向結(jié)合，促進(jìn)HIPC的發(fā)生及進(jìn)展。如IL-6可作為HIPC自分泌/旁分泌因子，保護(hù)癌細(xì)胞逃逸抗腫瘤藥物的細(xì)胞毒性作用；IL-6與其受體結(jié)合后，激活JAK旁路，使STAT3磷酸化，進(jìn)而與凋亡及增殖相關(guān)基因啟動(dòng)子結(jié)合，誘導(dǎo)靶基因轉(zhuǎn)錄與過(guò)度表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞增殖與凋亡等[13-15]。此外，Kok等[16]發(fā)現(xiàn)，硒可干擾正常前列腺上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，在預(yù)防前列腺癌發(fā)生中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示，mock組腫瘤組織的STAT3表達(dá)增強(qiáng)，細(xì)胞生長(zhǎng)活躍，血管形成豐富，而MSC降低STAT3的表達(dá)，表現(xiàn)出大量的凋亡細(xì)胞，細(xì)胞增殖不明顯。另外，MSC可通過(guò)降低STAT3的表達(dá)而延緩HIPC發(fā)生。

從本研究的結(jié)果可知，MSA體外通過(guò)干擾AR、PSA和STAT3的表達(dá)而抑制LNCaP細(xì)胞生長(zhǎng)，并促進(jìn)其凋亡，通過(guò)構(gòu)建裸鼠前列腺癌去勢(shì)后復(fù)發(fā)模型發(fā)現(xiàn)：MSC體內(nèi)可抑制去勢(shì)后的前列腺癌生長(zhǎng)，并降低血清中PSA的含量，延遲HIPC發(fā)生，其主要機(jī)制可能一是MSC可干擾AR的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制PSA的分泌而起到抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用；二是MSC可下調(diào)STAT3的表達(dá)，結(jié)合我們前期研究工作[17]，MSC可通過(guò)抑制腫瘤血管形成，實(shí)現(xiàn)抑制前列腺癌生長(zhǎng)的目的，為臨床前列腺癌的輔助治療提供新的思路。

本研究成功復(fù)制裸鼠前列腺癌去勢(shì)后復(fù)發(fā)模型；有機(jī)硒可延緩HIPC的發(fā)生，硒聯(lián)合去勢(shì)治療前列腺癌具有廣闊前景。