游贛花， 龍向淑， 宋 方， 黃 晶， 田茂波， 肖 燕， 鄧世燕， 吳 強△

(1貴州大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 貴州 貴陽 550025； 2貴州省食品藥品檢驗所, 貴州 貴陽 550004； 3貴州省人民醫(yī)院, 貴州大學(xué)人民醫(yī)院心內(nèi)科， 貴州 貴陽 550002)

血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells, VSMC)是構(gòu)成血管壁的重要成分，其異常增殖和遷移是動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)、高血壓以及冠狀動脈介入治療術(shù)后再狹窄等血管增殖性疾病發(fā)病的重要病理生理基礎(chǔ)[1-2]。二甲雙胍(metfor-min,Met)是一種廣泛應(yīng)用于臨床的2型糖尿病降糖藥；此外，二甲雙胍還具有抗AS特性。在一項納入了3 234名前驅(qū)糖尿病受試者進(jìn)行的臨床研究中，與安慰劑組比較，二甲雙胍組冠狀動脈鈣化發(fā)生率和嚴(yán)重程度均顯著降低，提示二甲雙胍可能對糖尿病導(dǎo)致的冠狀動脈粥樣硬化起抑制作用[3]。長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA, lncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄物長度大于200 nt且不具有蛋白編碼功能的非編碼RNA[4]，可參與調(diào)控AS的發(fā)生發(fā)展[5-6]。研究顯示二甲雙胍可抑制人原代VSMC增殖和遷移[7]，但二甲雙胍是否通過lncRNA肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1, MALAT1)影響VSMC細(xì)胞增殖和遷移尚未明了。鑒于此，本研究擬觀察二甲雙胍與lncRNA-MALAT1的相關(guān)性及VSMC活力、遷移及凋亡的相應(yīng)變化，為防治血管增殖性疾病提供新參考資料。

材 料 和 方 法

1 實驗材料

人VSMC購自中南大學(xué)湘雅細(xì)胞庫。二甲雙胍購自北京索萊寶科技有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)液和Opti-MEM轉(zhuǎn)染培養(yǎng)液購自Gibco；胎牛血清購自BI；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所；雙染法細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海七海復(fù)泰生物科技有限公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen；PCR熒光染料試劑盒購自TaKaRa；血液總RNA快速提取試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；GAPDH內(nèi)參照抗體購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；抑癌因子 p53 抗體購自沈陽萬類生物科技有限公司；小干擾RNA由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成；PCR擴增引物由上海生工生物工程有限公司合成。

2 主要方法

2.1病例收集 35例冠心病(coronary heart di-sease, CHD)患者(男, 24例；女, 11例)，平均年齡(64.6±8.8)歲，均于2018年6～8月在貴州省人民醫(yī)院經(jīng)冠狀動脈造影確診。對照組38例(男, 22例；女, 16例)，平均年齡(57.3±6.1)歲，為在貴州省人民醫(yī)院例行健康體檢者。冠心病病例納入標(biāo)準(zhǔn)：至少一支主要冠狀動脈血管狹窄>80%的穩(wěn)定型心絞痛患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)不穩(wěn)定型心絞痛或心肌梗死；(2)合并其他器質(zhì)性心臟??；(3)合并嚴(yán)重肝腎疾病、家族性高膽固醇血癥、惡性腫瘤及炎癥性疾病。以上人群均每例取靜脈血3 mL，所有標(biāo)本收集過程均在貴州省人民醫(yī)院倫理委員會審查通過，病人知情的情況下進(jìn)行。

2.2VSMC的培養(yǎng) 快速從液氮罐中取出VSMC凍存管經(jīng)37 ℃水浴，再加入5～10倍體積的RPMI-1640完全培養(yǎng)液160×g離心5 min后棄上清液，加入1 mL 10% RPMI-1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞后，加培養(yǎng)液至4 mL，置于37 ℃含5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，24 h后更換新培養(yǎng)液。

2.3細(xì)胞干預(yù)方法 給予終濃度為0、5、10和20 mmol/L的二甲雙胍進(jìn)行細(xì)胞活力檢測，并選擇10 mmol/L的二甲雙胍進(jìn)一步進(jìn)行實驗；或經(jīng)siRNA轉(zhuǎn)染，分為非特異性siRNA轉(zhuǎn)染組(si-NC組)和50 nmol/L MALAT1 siRNA轉(zhuǎn)染組。

2.4siRNA轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于6孔板中(每孔2×105/個)，用不含雙抗的10% RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至50%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按siRNA transfection reagent說明書操作，加入轉(zhuǎn)染復(fù)合物干預(yù)5 h后，換正常含雙抗的培養(yǎng)液培養(yǎng)一定時間后收集細(xì)胞用于實驗。si-MALAT1序列，forward： 5’-GACCUUGAAAUCCAUGACCUU-3’， reverse： 5’-AACGUCAUGGAUUUCAAGGU C-3’； si-NC，forward： 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’， reverse： 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。

2.5CCK-8檢測細(xì)胞活力 取對數(shù)生長期細(xì)胞，按每孔3×103個接種于96孔板，細(xì)胞孵育過夜后按上述分組進(jìn)行給藥或轉(zhuǎn)染處理，每組分別設(shè)6個復(fù)孔，并設(shè)置2個調(diào)零孔，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后每孔加入10 μL CCK-8溶液，將96孔板置入培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2 h后經(jīng)酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度。

2.6細(xì)胞劃痕實驗 在6孔板背面均勻畫出6條橫穿過孔的線條(每孔3條)，待孔內(nèi)各組細(xì)胞匯合度達(dá)90%后，用劃線工具垂直于孔背面橫線在細(xì)胞表面劃痕。吸棄孔內(nèi)液體，并用PBS緩沖液輕柔的清洗2遍，加入低血清培養(yǎng)液。顯微鏡下拍照，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h并拍照，計算遷移面積。

2.7流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 收集細(xì)胞，加入400μL 1×Binding Buffer 輕輕重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC輕輕混勻，室溫避光孵育15 min，加入10 μL PI染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置5 min，在30 min內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測。

2.8RT-qPCR檢測mRNA表達(dá) 按TRIzol法提出細(xì)胞總RNA后(血液中RNA的提取按照血液總RNA快速提取試劑盒說明書進(jìn)行)，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，RT-qPCR進(jìn)行擴增。PCR擴增條件為：95 ℃ 1 min預(yù)變性；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，重復(fù)循環(huán)40次；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s進(jìn)行熔解曲線分析。以GAPDH為內(nèi)參照，2-ΔΔCt法計算各組lncRNA-MALAT1和p53 mRNA的相對表達(dá)量。MALAT1的上游引物序列為5’-AATGTTAAGAGAAGCCCAGGG-3’，下游引物序列為5’-AAGGTCAAGAGAAG TGTCAGC-3’；p53的上游引物序列為5’-CTCCTCAGCATCTTATCCGAG-3’，下游引物序列序列為5’-GCTGTTCCGTCCCAGTAGATTA-3’；GAPDH的上游引物序列為5’-AGCCACATCGCTCAGACAC-3’，下游引物序列為5’-GCCCAATACGACCAAATCC-3’。

2.9Western blot檢測蛋白表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白，每孔上樣30 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE，濕法轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)移蛋白條帶至PVDF膜。將膜置Western 封閉液中室溫下封閉2 h；加入p53 I抗工作液置4 ℃冰箱過夜；TBST緩沖液(pH=7.4)洗膜，室溫下孵育稀釋的II抗1.5 h；TBST洗膜，電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影。同法封閉、孵育GAPDH。ImageJ 軟件對條帶進(jìn)行灰度分析。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用GraphPad Prism 7.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組獨立樣本比較采用t檢驗，多組獨立樣本比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 lncRNA-MALAT1表達(dá)情況的檢測

RT-qPCR檢測38例無CHD的對照人群與35例冠脈狹窄>80%的CHD患者血樣中l(wèi)ncRNA-MALAT1的表達(dá)水平；si-NC和si-MALAT1瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞，進(jìn)行沉默效率檢測；10 mmol/L二甲雙胍給藥，并分別于24、48和72 h后檢測lncRNA-MALAT1的表達(dá)。結(jié)果顯示，與對照人群相比，lncRNA-MALAT1在CHD患者血樣中表達(dá)顯著升高(P<0.05)，見圖1A；與Si-NC組相比， si-MALAT1組中l(wèi)ncRNA-MALAT1的表達(dá)顯著降低(P<0.05)，見圖1B；二甲雙胍給藥后lncRNA-MALAT1的表達(dá)呈時間依賴性降低(P<0.05)，見圖1C。

Figure 1.RT-qPCR was performed to detect the expression of lncRNA-MALAT1. A: the expression of MALAT1 in peripheral blood samples; B: detection of the silencing efficiency of si-MALAT1; C: the expression of MALAT1 after metformin (Met) administration. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal group;△P<0.05vssi-NC group;#P<0.05vscontrol group.

圖1 RT-qPCR檢測lncRNA-MALAT1的表達(dá)

2 二甲雙胍給藥對VSMC活力、遷移及凋亡的影響

CCK-8結(jié)果顯示,5、10和20 mmol/L二甲雙胍給藥24 h、48 h和72 h均可在一定程度上呈濃度及時間依賴性抑制VSMC細(xì)胞活力(P<0.05)，見圖2A;劃痕實驗結(jié)果顯示，與空白對照組相比，10 mmol/L二甲雙胍給藥24 h后VSMC的遷移率顯著降低(P<0.05)，見圖2B;流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,10 mmol/L二甲雙胍給藥48 h后VSMC的凋亡率顯著升高(P<0.05)，見圖2C。

Figure 2.Effect of metformin (Met) on VSMC viability, migration and apoptosis. A: the viability of VSMC detected by CCK-8 assay; B: the migration ability of VSMC detected by wound healing assay (×40); C: the apoptosis rate of VSMC detected by flow cytometry. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖2 二甲雙胍對VSMC活力、遷移和凋亡的影響

3 si-MALAT1對VSMC活力、遷移及凋亡的影響

CCK-8結(jié)果顯示,與si-NC組比較，si-MALAT1分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h、48 h和72 h后呈時間依賴性抑制VSMC細(xì)胞活力(P<0.05)，見圖3A;劃痕實驗結(jié)果顯示,si-MALAT1轉(zhuǎn)染24 h后VSMC的遷移率顯著降低(P<0.05)，見圖3B;流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,si-MALAT1轉(zhuǎn)染48 h后VSMC的凋亡率升高不明顯，見圖3C。

Figure 3.Effect of si-MALAT1 on VSMC viability, migration and apoptosis. A: the viability of VSMC detected by CCK-8 assay; B: the migration ability of VSMC detected by wound healing assay (×40); C: the apoptosis of VSMC detected by flow cytometry. Mean±SD.n=3.*P<0.05vssi-NC group.

圖3 Si-MALAT1對VSMC活力、遷移和凋亡的影響

4 二甲雙胍給藥對p53表達(dá)水平的影響

我們進(jìn)一步用RT-qPCR和Western blot檢測了二甲雙胍給藥后p53的表達(dá)變化。與空白對照組比較，10 mmol/L二甲雙胍給藥48 h后p53 mRNA水平顯著升高(P<0.05)，見圖4A；同時p53蛋白表達(dá)水平亦顯著升高(P<0.05)，見圖4B。

Figure 4.Effect of metformin (Met) on the expression of p53 at mRNA and protein levels. A: the mRNA expression of p53 detected by RT-qPCR; B: the protein expression of p53 detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖4 二甲雙胍給藥對p53 mRNA及蛋白表達(dá)水平的影響

5 si-MALAT1轉(zhuǎn)染對p53表達(dá)水平的影響

接下來，我們用RT-qPCR和Western blot檢測了si-MALAT1轉(zhuǎn)染后p53的表達(dá)變化。與si-NC組比較，si-MALAT1轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后p53 mRNA水平顯著升高(P<0.05)，見圖5A；同時p53蛋白表達(dá)水平亦顯著升高(P<0.05)，見圖5B。

Figure 5.Effect of si-MALAT1 on the expression of p53 at mRNA and protein levels. A: the mRNA expression of p53 detected by RT-qPCR; B: the protein expression of p53 detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vssi-NC group.

圖5 si-MALAT1轉(zhuǎn)染對p53 mRNA及蛋白表達(dá)水平的影響

討 論

VSMC過度增殖是血管增殖性疾病發(fā)病的主要環(huán)節(jié)，研究如何采取有效措施抑制VSMC增殖、遷移以及表型轉(zhuǎn)化等是血管增殖性疾病領(lǐng)域研究的熱點[1-2]。

二甲雙胍因其作用廣泛、副作用小而成為近年來的研究熱點。研究顯示二甲雙胍具有抗AS作用[7-8]，但相關(guān)的分子機制尚未完全明確。

研究發(fā)現(xiàn)哺乳動物基因中超過98%轉(zhuǎn)錄為非編碼RNA，僅有不到2%的基因轉(zhuǎn)錄為蛋白質(zhì)[9-10]。lncRNA與AS密切相關(guān)，差異表達(dá)的lncRNA可為診治心血管疾病提供潛在的新靶點[11-12]。MALAT1也被稱為核富集轉(zhuǎn)錄本2(nuclear-enriched abundant transcript 2, NEAT2)，是在多種癌癥中過度表達(dá)的lncRNA，其高表達(dá)與高增殖和腫瘤生長、轉(zhuǎn)移相關(guān)[13-14]，而沉默MALAT1表達(dá)可抑制遷移、轉(zhuǎn)移和降低致癌性[15]。VSMC過度增殖及遷移是AS及CHD發(fā)病的病理基礎(chǔ)，而MALAT1是否參與上述疾病的發(fā)生及二甲雙胍是否通過影響MALAT1表達(dá)而發(fā)揮其抗AS作用未見文獻(xiàn)報道。本研究首次發(fā)現(xiàn)CHD患者外周血中MALAT1表達(dá)較無CHD的對照人群顯著升高。體外研究顯示，敲減VSMC中MALAT1表達(dá)能抑制VSMC的活力和遷移，但對其凋亡無明顯影響；同時，二甲雙胍給藥后MALAT1表達(dá)呈時間依賴性降低，由此提示二甲雙胍可能通過下調(diào)MALAT1表達(dá)而抑制VSMC活力和遷移。因下調(diào)MALAT1表達(dá)后對VSMC凋亡無明顯影響，推測二甲雙胍靶向下調(diào)MALAT1表達(dá)可能通過影響增殖相關(guān)因子或非典型促凋亡通路而發(fā)揮其抑制VSMC增殖及遷移作用。此外，本研究采用的人VSMC細(xì)胞系未模擬AS模型給予相應(yīng)處理而有可能導(dǎo)致VSMC反應(yīng)與AS病變的VSMC有一定的差異性。

p53是被廣泛研究的轉(zhuǎn)錄因子，其激活效應(yīng)包括誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞凋亡、自噬和衰老以及抑制侵襲、遷移、干細(xì)胞重建和代謝重編程[16-17]。MALAT1沉默可導(dǎo)致p53和其靶標(biāo)如p21激活，Tripathi等[18]在HeLa、U2OS和WI-38-VA13等癌細(xì)胞系中沉默MALAT1后發(fā)現(xiàn)其具有弱的p53活性，提示p53可能是MALAT1的下游靶分子。本研究在VSMC中敲減MALAT1表達(dá)，發(fā)現(xiàn)p53 mRNA水平及蛋白表達(dá)均顯著升高，與已報道的研究結(jié)果相一致。結(jié)合二甲雙胍可呈時間依賴性降低MALAT1表達(dá)，推測二甲雙胍可能靶向MALAT1而激活p53表達(dá)。

綜上所述，二甲雙胍可能靶向MALAT1而調(diào)控VSMC活力及遷移，且該效應(yīng)可能與p53的激活有關(guān)，但二甲雙胍、MALAT1及p53之間具體的分子作用機制有待進(jìn)一步研究。