王少群，邱丹騰，林春通，張紅，劉樹滔

（1.廈門信道生物技術(shù)有限公司，福建 廈門 361026；2.福州大學生物工程研究所，福建 福州 350108）

膠原蛋白的基本結(jié)構(gòu)單元是原膠原，由具有3條左手螺旋α肽鏈相互纏繞形成的右手螺旋結(jié)構(gòu)的一類蛋白質(zhì)[1]。因其含量豐富，來源廣泛，水解產(chǎn)物具有多種生物活性功能，廣泛應用于食品、化妝品、生物醫(yī)療等各個領(lǐng)域。

膠原蛋白飲料是通過添加膠原蛋白源（如膠原蛋白、膠原蛋白肽），并對其它各個組分調(diào)配形成的一種功能性飲料。對它的研究很多，主要為保健膠原蛋白飲料，如生姜-膠原蛋白[2]、木瓜-膠原蛋白[3]、枸杞子-膠原蛋白[4]、大棗-膠原蛋白[5]等，但多以配方優(yōu)化為主，鮮有健康功能性研究。通過對京東（https://www.jd.com/）和淘寶（https://www.taobao.com/）的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)膠原蛋白飲料多為果味飲料，產(chǎn)品風味欠佳，功能效果有限。

發(fā)酵果汁是由乳酸菌/酵母菌等益生菌對果汁的發(fā)酵而形成的營養(yǎng)食品，風味獨特，且具有新的營養(yǎng)和保健功能[6]。國內(nèi)外對發(fā)酵果汁飲料的研究很多，主要分為：⑴各種果蔬為主的發(fā)酵果汁飲料[7-9]；⑵不同菌種形成的單菌種發(fā)酵果汁或多菌種混合發(fā)酵果汁飲料[10,11]；⑶搭配藥食同源食材的發(fā)酵果汁飲料[12,13]；⑷少數(shù)搭配動物源食材（如：膠原蛋白）的發(fā)酵果汁飲料[14]。然而，通過發(fā)酵果汁與膠原蛋白的組合以改善產(chǎn)品風味，提升功能效果的研究較少。

為了使膠原蛋白飲料更容易為市場所接受，本文以膠原蛋白肽為原料，添加發(fā)酵果汁和其它輔料，研制口味良好、功能多樣的發(fā)酵果汁膠原蛋白飲料。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑

海嬌-膠原蛋白肽凍干粉：購自上海利統(tǒng)生化制品有限公司；保和堂-膠原蛋白果汁飲料：上海葡萄王企業(yè)有限公司；天然派-膠原蛋白果汁飲品：深圳市天然派生物科技有限公司；依蓮-膠原蛋白液態(tài)飲品：上海中邦斯瑞生物藥業(yè)技術(shù)有限公司；益盛漢參-膠原蛋白肽果汁飲品：時代生物科技（深圳）有限公司；Lumi-膠原蛋白液態(tài)飲品：大江生醫(yī)股份有限公司；日本芳珂-膠原蛋白果汁飲料：日本FANCL株式會社。

表1 發(fā)酵果汁膠原蛋白飲料配方表 單位：g

發(fā)酵紅棗濃縮汁、發(fā)酵復合莓汁、發(fā)酵木瓜汁、發(fā)酵蘋果汁、發(fā)酵檸檬汁、藍莓濃縮汁、發(fā)酵西柚汁、發(fā)酵蘋果濃縮果汁等：購自福建綠泉食品有限公司。

阿斯巴甜、檸檬酸、蘋果酸、果膠、黃原膠等食品添加劑：購自廈門榮新盛食品有限公司；T-AOC試劑盒、總蛋白定量測試盒（雙縮脲法）：南京建成生物工程有限公司；其余藥品均購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器

U-1900型紫外-可見分光光度計、CF15RX型高速離心機：日本日立公司；

恒溫水浴鍋：上海精宏實驗設(shè)備有限公司。

1.3 飲料配方

詳細配方見表1。

1.4 方法

1.4.1 飲料的口味確定

1.4.1.1 感官評價方法及標準

評價項目及評價標準見表2，等級劃分標準見表3，評價流程如下：

對發(fā)酵果汁飲料作隨機編號→準備干燥、潔凈的杯子對應發(fā)酵果汁飲料編號→組織10個人感官評價小組，品嘗發(fā)酵果汁飲料并作評價。

1.4.1.2 不同品牌膠原蛋白飲料的感官評價

選擇6款市面上典型的膠原蛋白飲料作感官評價，分別為：

⑴ 保和堂-膠原蛋白果汁飲料；⑵ 天然派-膠原蛋白果汁飲品；⑶ 依蓮-膠原蛋白液態(tài)飲品；⑷ 益盛漢參-膠原蛋白肽果汁飲品；⑸ Lumi-膠原蛋白液態(tài)飲品；⑹ 日本芳珂-膠原蛋白果汁飲料。

1.4.1.3 不同口味發(fā)酵果汁的感官評價

選擇5種不同風味的發(fā)酵果汁，包括：

表2 感官評價評分標準

表3 感官評價等級劃分標準

⑴ 發(fā)酵紅棗濃縮汁；⑵ 發(fā)酵復合莓汁；⑶ 發(fā)酵木瓜汁；⑷ 發(fā)酵蘋果汁；⑸ 發(fā)酵檸檬汁。

分別稀釋5倍后，做感官評價。

1.4.1.4 不同口味發(fā)酵果汁膠原蛋白飲料的感官評價

按照1.3飲料配方分別調(diào)配成發(fā)酵果汁膠原蛋白飲料，并做感官評價。

1.4.2 飲料的制備

按照常規(guī)的果汁飲料工藝流程制備發(fā)酵果汁膠原蛋白飲料。

1.4.3 飲料的產(chǎn)品質(zhì)量分析

由福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院進行產(chǎn)品質(zhì)量分析，檢測項目包括：可溶性固形物（20 ℃ 折光計法）；總酸（以檸檬酸計）；菌落總數(shù)；大腸桿菌；沙門氏菌；金黃色葡萄球菌；霉菌；酵母菌。

1.4.4 飲料的抗氧化能力測試

1.4.4.1 鹽酸羥胺法

采用黃嘌呤氧化酶（羥胺法）測定樣品對·O2-的清除能力，步驟按照論文[15]所述的SOD酶活測定方法。

式中，A2—空白組吸光值；A1—樣品組吸光值。

1.4.4.2 鐵離子還原法

抗氧化物質(zhì)能使反應體系的Fe3+還原成Fe2+，可與菲啉類物質(zhì)形成穩(wěn)固的有色絡合物，可根據(jù)比色法測定。步驟參照總抗氧化能力（T-AOC）測定試劑盒。

1.4.4.3 DPPH自由基清除法采用DPPH法測定樣品對DPPH·的清除能力[16]。

式中，A2—空白組吸光值；A1—樣品組吸光值。

1.4.5 飲料的體外消化率測試

根據(jù)蛋白質(zhì)/多肽都具有雙縮脲反應，本文以雙縮脲法測定樣品的膠原蛋白肽含量，以反應飲料在體內(nèi)被胃/腸道消化利用的程度。

模擬胃液/腸液配方——參照美國藥典[18]。

模擬胃液：NaCl 2.0 g，胃蛋白酶3.2 g，HCl 7.0 mL，用ddH2O定容至1000 mL。

模擬腸液：

A液：KH2PO4 6.8 g，ddH2O 500 mL，用0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8；

B液：胰蛋白酶10 g，加入適量ddH2O使溶解；

A、B液邊攪拌邊混勻，用ddH2O定容至1000 mL。

樣品制備：取樣品（60 mg/mL，50 mL）加入500 mL模擬胃液/腸液，37 ℃水浴，分別于0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h取出2 mL×3組作為待測溶液。

步驟：參照總蛋白定量測試盒（雙縮脲法），蛋白質(zhì)含量用C表示。

式中，C0—未消化時的蛋白質(zhì)濃度；C1—不同消化時間的蛋白質(zhì)濃度。

1.4.6 飲料的抗疲勞能力測試

⑴ 負重游泳實驗[19]：

對小鼠（約28 g）進行樣品灌胃，0.5 h后，4個水桶分別放入6只尾部負荷5%體質(zhì)量鉛皮的小鼠，使其于水溫為28 ℃、直徑為35 cm、高32 cm的水桶中游泳。小鼠沉入水中連續(xù)3次，每次如果超過10 s無法重新浮出水面稱為力竭。游泳開始至力竭的時間，為負重游泳時間。

⑵ 文獻表明[20]，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）對機體具有抗疲勞能力，故作為陽性對照。

⑶ 給藥量：對照組灌胃生理鹽水0.24 mL，SOD組灌胃SOD（400 U/mL）0.24 mL，木瓜飲料組和復合莓飲料組灌胃每只0.24 mL，見表4。

式中，T0—空白組的負重游泳時間；T1—不同樣品組的負重游泳時間。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用origin 9.0、excel 2013軟件進行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 飲料的口味確定

2.1.1 不同品牌膠原蛋白飲料的感官評價

圖1 不同品牌膠原蛋白飲料感官評價結(jié)果

感官評定總分中（圖1），保和堂和芳珂屬于B級，依蓮、益盛漢參、Lumi屬于C級，天然派屬于D級，沒有一個品牌達到A級；口感+氣味中，保和堂、益盛漢參屬于C級，天然派、依蓮屬于D級，芳珂屬于B級，沒有一個品牌達到A級。所以，不同品牌膠原蛋白飲料的感官評價皆未能達到最佳等級。

2.1.2 不同口味發(fā)酵果汁的感官評價

為研制較佳口味膠原蛋白飲料，需要尋找較佳口味的發(fā)酵果汁作基礎(chǔ)。

圖2 不同口味發(fā)酵果汁感官評價結(jié)果

感官評定總分中（圖2），發(fā)酵紅棗濃縮汁、發(fā)酵蘋果汁、發(fā)酵檸檬汁屬于C級，發(fā)酵復合莓汁、發(fā)酵木瓜汁都屬于B級；口感+氣味中，發(fā)酵紅棗濃縮汁、發(fā)酵木瓜汁屬于B級，發(fā)酵復合莓汁屬于A級，發(fā)酵蘋果汁、發(fā)酵檸檬汁都屬于C級。在感官評價總分/口感氣味中，不同口味的發(fā)酵果汁的評分等級主要分布為B、C級水平，但還未達到最佳A級，而發(fā)酵蘋果汁的評分最差。

綜上，選擇發(fā)酵紅棗濃縮汁、發(fā)酵復合莓汁、發(fā)酵木瓜汁、發(fā)酵檸檬汁為發(fā)酵果汁膠原蛋白飲料的后續(xù)實驗的果汁基礎(chǔ)。

2.1.3 不同口味發(fā)酵果汁膠原蛋白飲料的感官評價

按照1.3飲料配方調(diào)配成發(fā)酵果汁膠原蛋白飲料，以膠原蛋白液、芳珂膠原蛋白飲料做對比，通過感官評價選擇最受歡迎的2種果汁飲料。

圖3 不同口味發(fā)酵果汁膠原蛋白飲料感官評價結(jié)果

由圖3可得，隨著膠原蛋白含量的增加，膠原蛋白飲料的感官評價分數(shù)呈降低的趨勢。這是因為加入越多的膠原蛋白肽，果汁的香味越難以掩蓋魚皮膠原蛋白特有的腥臭味，進而影響飲料的風味；從感官評價總分/口感氣味分數(shù)看，發(fā)酵木瓜型和發(fā)酵復合莓型2種口味的飲料略受歡迎，即便與芳珂膠原蛋白飲料對比，亦相差不大。

因此，選擇發(fā)酵木瓜和發(fā)酵復合莓膠原蛋白果汁飲料作后續(xù)配方優(yōu)化。

2.2 飲料的制備

為達到最佳的口感、色澤以及滿足人體每日對膠原蛋白的需求，經(jīng)糖酸比（酸∶檸檬酸+蘋果酸）、膠原蛋白肽含量優(yōu)化，飲料配方最終確定如表5。

2種飲料的最佳配方為：

⑴ 發(fā)酵木瓜果汁膠原蛋白飲料根據(jù)表1調(diào)配，且糖酸比38∶1（糖∶檸檬酸∶蘋果酸=25∶0.35∶0.3=90∶1.26∶1.08），膠原蛋白肽含量6%；

⑵ 發(fā)酵復合莓果汁膠原蛋白飲料根據(jù)表1調(diào)配，糖酸比18∶1（糖∶檸檬酸∶蘋果酸=25∶0.8∶0.6=90∶2.88∶2.16），膠原蛋白肽含量6%。

表5 發(fā)酵果汁膠原蛋白飲料配方表 單位：g

2.3 飲料的產(chǎn)品質(zhì)量分析

發(fā)酵木瓜/復合莓果汁膠原蛋白飲料的pH值分別為4.32和4.14，均小于4.5，屬于酸性飲料。經(jīng)巴氏滅菌法（90 ℃，15 min）滅菌后的產(chǎn)品質(zhì)量分析如表6。參照食品安全國家標準GB4789.2-2016，檢驗結(jié)果顯示各項指標均為合格。

表6 發(fā)酵果汁膠原蛋白飲料的產(chǎn)品質(zhì)量分析

2.4 飲料的抗氧化能力

圖4 發(fā)酵果汁膠原蛋白飲料的抗氧化能力

通過3種方法檢測發(fā)酵果汁膠原蛋白飲料的抗氧化能力，一定程度的表明其生物活性，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可得：

⑴ 2種發(fā)酵果汁膠原蛋白飲料和膠原蛋白肽都具有一定程度的抗氧化能力。

⑵ 三種樣品的抗氧化能力（用K表示）順序：K發(fā)酵復合莓果汁膠原蛋白飲料＞K發(fā)酵木瓜果汁膠原蛋白飲料＞K膠原蛋白肽。

⑶ 膠原蛋白肽的基礎(chǔ)上，添加發(fā)酵木瓜/復合莓果汁，有助于抗氧化能力的增加。

2.5 飲料的體外消化率

生物蛋白質(zhì)屬于大分子物質(zhì)，在進入人體胃/腸道內(nèi)，一般被降解消化成小分子物質(zhì)，才易被吸收，且分子越小，越容易被吸收。所以，通過檢測發(fā)酵果汁膠原蛋白飲料的體外消化率，一定程度反應飲料在胃/腸道內(nèi)的吸收情況。體外消化率如圖5所示。

圖5 發(fā)酵果汁膠原蛋白飲料的體外消化率

發(fā)酵木瓜果汁膠原蛋白飲料、發(fā)酵復合莓果汁膠原蛋白飲料、膠原蛋白肽、BSA在模擬胃/腸液體系中的消化結(jié)果，有著大致相同的結(jié)論。

⑴ 隨著消化時間延長，胃/腸道體系對樣品的體外消化率總體上呈現(xiàn)上升趨勢，即蛋白質(zhì)/多肽被降解成更小分子。

⑵ 在胃/腸液體系，發(fā)酵木瓜果汁膠原蛋白飲料和發(fā)酵復合莓果汁膠原蛋白飲料的消化率（用D表示）比膠原蛋白肽的消化率稍高，即D發(fā)酵木瓜果汁膠原蛋白飲料≈D發(fā)酵復合莓果汁膠原蛋白飲料≥D膠原蛋白肽，表明發(fā)酵木瓜/復合莓果汁的添加，有助于膠原蛋白肽的降解消化，更加有利于人體吸收。

⑶ 各樣品在腸液中的消化率比在胃液中的消化率顯著較高，說明樣品的消化吸收可能主要發(fā)生在腸道環(huán)境。

2.6 飲料的抗疲勞能力

圖6 發(fā)酵果汁膠原蛋白飲料的抗疲勞能力

灌胃SOD、發(fā)酵木瓜果汁膠原蛋白飲料、發(fā)酵復合莓果汁膠原蛋白飲料的小鼠抗疲勞能力都有顯著提高（p＜0.05），抗疲勞能力排序為：F發(fā)酵復合莓果汁膠原蛋白飲料＞FSOD＞F發(fā)酵木瓜果汁膠原蛋白飲料＞50%。

3 結(jié)論

⑴ 以發(fā)酵木瓜/復合莓口味作為飲料的果汁基礎(chǔ)口感最好，其中：最適糖酸比分別為38∶1和18∶1；膠原蛋白肽含量皆為6%。

⑵ 飲料的抗氧化實驗：2種果汁飲料皆具有抗氧化活性，其順序為：K發(fā)酵復合莓果汁膠原蛋白飲料＞K發(fā)酵木瓜果汁膠原蛋白飲料＞K膠原蛋白肽，說明在膠原蛋白肽的基礎(chǔ)上，添加發(fā)酵木瓜/復合莓果汁有助于抗氧化能力的增加。

⑶ 飲料的體外消化率實驗：飲料的體外消化率D發(fā)酵木瓜果汁膠原蛋白飲料≈D發(fā)酵復合莓果汁膠原蛋白飲料≥D膠原蛋白肽，表明發(fā)酵木瓜/復合莓果汁的添加，有助于膠原蛋白肽的降解消化，更加有利于人體吸收。

⑷ 飲料的抗疲勞實驗：灌胃2種飲料皆能顯著提高小鼠的抗疲勞能力（p＜0.05），抗疲勞能力排序為：F發(fā)酵復合莓果汁膠原蛋白飲料＞F發(fā)酵木瓜果汁膠原蛋白飲料＞50%。

所以，在體外消化率相當?shù)幕A(chǔ)上，小鼠的抗疲勞能力與飲料的抗氧化能力呈正相關(guān)。

綜上，本文研制的發(fā)酵果汁膠原蛋白飲料具有口感好、生物活性功能多樣的特點，可望為市場所接受。