亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        蘿卜硫素介導(dǎo)Wnt/β-catenin信號通路誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡的研究

        2019-11-20 02:15:00顧文燕
        天津中醫(yī)藥 2019年11期
        關(guān)鍵詞:硫素抑制率蘿卜

        李 麗,顧文燕,姜 紅

        (恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院手術(shù)室,恩施 445000)

        蘿卜硫素(Sulforaphane)是一種從十字花科植物中提取的異硫氰酸鹽,易溶于水,還易溶于二氯甲烷和乙酸乙酯,沸點較高,還易被氧化降解,并且蘿卜硫素在抗腫瘤、抗氧化、抗炎及免疫調(diào)節(jié)等方面具有較強的藥理作用[1-4]。前期研究發(fā)現(xiàn)蘿卜硫素主要通過激活胃癌細胞Ⅱ型解毒酶的生成發(fā)揮抗腫瘤作用[5]。蘿卜硫素還能通過抑制炎癥蛋白表達來降低胃癌細胞的生長和侵襲[6]。近期研究也提出蘿卜硫素可通過影響MAPK信號通路活化誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡[7-8]。相關(guān)報道提出對胃癌細胞內(nèi)Wnt/β-catenin信號通路進行阻斷,能抑制胃癌細胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡[9-10],然而關(guān)于蘿卜硫素誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡是否通過作用Wnt/β-catenin信號通路,目前尚不清楚。胃癌在中國的發(fā)病率及死亡率較高,主要是術(shù)后腫瘤細胞轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)風(fēng)險較高,因此尋找安全有效的藥物對胃癌進行預(yù)防及治療迫在眉睫?;谔}卜硫素在抗腫瘤方面具有明顯的藥理活性,文章研究了蘿卜硫素對胃癌細胞增殖的抑制作用及其作用機制,以期為臨床應(yīng)用提供理論參考。因此,筆者將以胃癌SGC-7901細胞內(nèi)Wnt/βcatenin 信號通路關(guān)鍵蛋白 β-catenin、GSK-3β、TCF4/LEF為主要研究對象,闡述蘿卜硫素誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡的作用機制。

        1 材料及方法

        1.1 胃癌細胞 SGC-7901細胞株由武漢巴菲爾生物有限公司提供(來源于美國ATCC細胞庫)。

        1.2 儀器 DNM-9602G酶標(biāo)儀(美國Thermo公司);DYY-6C電泳儀(北京六一儀器廠);5000 Plus凝膠成像系統(tǒng)(美國ProteinSimple公司);H2050R型臺式冷凍高速離心機(德國EPPENDORF公司);BBS-V800型單人超凈臺(山東鑫貝西公司);SPX-250型細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)。

        1.3 藥物與試劑 蘿卜硫素(山東綠葉制藥,批號H2011265418,純度≥98%);胎牛血清、RMPI-1640培養(yǎng)基及0.25%胰蛋白酶購自英國Abcam公司;鼠抗 β-catenin、GSK-3β、c-Myc及 Caspase3抗體購自英國Abcam公司;CCK8試劑盒購自北京智杰方遠科技有限公司(批號:CK57);Annexin V/PI凋亡試劑盒購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司;熒光素酶報告基因試劑盒購自New England Biolabs(Beijing)公司。

        1.4 細胞培養(yǎng) 采用1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)SGC-7901細胞,條件為37℃、5%CO2濃度的恒濕培養(yǎng)箱,用0.25%胰酶-EDTA消化傳代培養(yǎng)。當(dāng)細胞生長狀態(tài)良好時,取對數(shù)生長期細胞用于后續(xù)實驗。

        1.5 CCK8實驗 取對數(shù)生長期細胞消化、計數(shù),以5×104個/mL細胞密度接種于96孔板中,培養(yǎng)過夜,然后用 10、20、40 μmol/L 蘿卜硫素處理細胞 24、48、72 h后吸去舊培養(yǎng)基,每孔加入10 μL的CCK8試劑,繼續(xù)培養(yǎng)2 h后,在450 nm波長處檢測每孔吸光度OD值,并計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率(%)=(1-藥物組OD值/對照組OD值)×100%。

        1.6 細胞凋亡檢測 取對數(shù)生長期細胞消化、重懸、計數(shù)后,以1×105/mL的濃度接種于6孔板,培養(yǎng)24 h 后,加入 10、20、40 μmol/L 蘿卜硫素干預(yù)細胞24 h后,收集細胞,先用預(yù)冷的PBS清洗細胞2遍,然后分別加入Annexin-V FITC和PI處理細胞(按照試劑盒操作說明書進行),最后用流式細胞儀分析細胞周期。

        1.7 熒光素酶報告基因?qū)嶒?把對數(shù)生長期細胞接種于T25培養(yǎng)瓶,貼壁后用Lipofectamine轉(zhuǎn)染LEF/TCF4 報告質(zhì)粒(pTOP-Luc)3 μg,4 h 后換液。12 h后將細胞消化接種于24孔板中,貼壁后加入10、20、40 μmol/L 蘿卜硫素進行干預(yù)。24 h 后收集細胞裂解,按試劑盒操作說明書測定熒光素酶活性。

        1.8 蛋白表達檢測 按照“1.6”項處理完細胞后,收集細胞裂解、超聲破碎、12000r/min離心12min后收集上清,BCA試劑盒測定上清蛋白濃度。每個樣本上樣50μg進行凝膠電泳,待蛋白完全分離后進行轉(zhuǎn)膜實驗。結(jié)束后加入5%脫脂奶粉封閉液于搖床上室溫封閉1h后,分別加入β-catenin、GSK-3β、c-Myc及Caspase3抗體(體積稀釋比例均為1∶1 000)4℃反應(yīng)過夜。次日TBST洗膜3次后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(體積稀釋比例為1∶3 000),室溫反應(yīng)1 h。再用TBST洗膜3次,每次10 min,以ECL試劑顯影后進行蛋白條帶灰度值分析。

        1.9 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 20.0軟件統(tǒng)計,計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,多組間比較采用單因素方差分析,重復(fù)測量資料采用重復(fù)測量設(shè)計方差分析,組間兩兩比較采用Bonferroni分析,P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 蘿卜硫素對SGC-7901細胞增殖抑制率的影響 經(jīng)過 10、20、40 μmol/L蘿卜硫素干預(yù) SGC-7901細胞24、48、72h后增殖抑制率比較結(jié)果見表1。蘿卜硫素干預(yù)24、48、72 h后,與對照組比較,低、中、高劑量蘿卜硫素組SGC-7901細胞抑制率明顯升高,并且各藥物組之間細胞抑制率存在顯著性差異(P<0.05),呈現(xiàn)出劑量依賴性;在同一藥物濃度條件下,相比于藥物處理24 h,藥物干預(yù)48和72 h后細胞增殖抑制率也明顯升高,且各時間點之間差異均有顯著性(P<0.05),表現(xiàn)出時間依賴性。

        2.2 蘿卜硫素對SGC-7901細胞凋亡的影響 流式細胞儀檢測了蘿卜硫素對SGC-7901細胞周期的影響,見表2、圖1。結(jié)果提示SGC-7901細胞經(jīng)蘿卜硫素干預(yù)后,處于G0/G1期的細胞數(shù)顯著增多,而S期及G2/M期細胞數(shù)相對減少,由此說明蘿卜硫素能誘導(dǎo)SGC-7901細胞凋亡。

        2.3 蘿卜硫素對SGC-7901細胞TCF4/LEF報告質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄活性的影響 與對照組(1.00±0.00)比較,10、20、40 μmol/L 蘿卜硫素組 TCF4/LEF 轉(zhuǎn)錄活性[(0.72±0.21)、(0.51±0.17)、(0.37±0.28)]隨藥物劑量升高呈逐漸下降的趨勢,差異有顯著性(F=521.357,P=0.000)。結(jié)果提示蘿卜硫素能顯著抑制TCF4/LEF轉(zhuǎn)錄活性,還表現(xiàn)出濃度依賴性,說明蘿卜硫素可顯著抑制Wnt/β-catenin信號的傳導(dǎo)。

        2.4 蘿卜硫素對促凋亡蛋白及Wnt/β-catenin通路蛋白的影響 各組間胃癌SGC-7901細胞中βcatenin、GSK-3β、c-Myc及 Caspase3 蛋白表達水平比較見圖2,結(jié)果提示不同劑量蘿卜硫素均能抑制β-catenin及c-Myc蛋白表達,而誘導(dǎo)GSK-3β及Caspase3蛋白表達,并且它們的表達水平與對照組相比,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

        表1 各組間SGC-7901細胞抑制率比較Tab.1 Comparison of SGC-7901 cell inhibitory rates in each group

        表2 各組間細胞周期比較()Tab.2 Comparison of cell cycle in each group()

        表2 各組間細胞周期比較()Tab.2 Comparison of cell cycle in each group()

        注:與對照組比較,*P<0.05。

        分組 劑量(μmol/L) G0/G1 S G2/M對照組 - 48.6±2.3 18.1±1.5 33.3±2.4蘿卜硫素低劑量組 10 52.6±3.6 15.2±1.3 32.2±2.1蘿卜硫素中劑量組 20 63.4±1.8* 10.3±2.0* 26.3±1.8蘿卜硫素高劑量組 40 69.5±2.9* 9.8±1.5 20.7±2.4*

        圖1 各組間細胞凋亡率比較Fig.1 Comparison of cell apoptotic rates in each group

        3 討論

        對于胃癌發(fā)病機制的研究還存在較大爭議,目前對于胃癌的治療手段以手術(shù)為主,然而術(shù)后化療藥物不僅療效不佳,還會導(dǎo)致病灶周圍正常組織的損傷,進而誘發(fā)免疫功能紊亂[11-12]。因為目前缺少對胃癌患者早期診斷的標(biāo)志物,大多數(shù)患者確診后處于中晚期,術(shù)后患者又會出現(xiàn)腫瘤細胞轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及化療藥物帶來的不良反應(yīng),極大降低了患者的生存質(zhì)量。隨著物質(zhì)生活水平的提升,胃癌患病率也在不斷提升,所以提高臨床診斷率、早期干預(yù)、改善患者術(shù)后生存質(zhì)量是急需解決的問題[13-15]。因此,尋找對胃癌藥理作用較強的天然活性成分已成為目前研究的熱點。

        圖2 各組間β-catenin、GSK-3β、c-Myc及Caspase3蛋白表達水平比較Fig.2 Comparison of expression levels of β-catenin,GSK-3β,c-Myc and Caspase3 proteins in each group

        蘿卜硫素是十字花科植物中的一種天然活性成分,對多種腫瘤細胞增殖均表現(xiàn)出較強的抑制作用,其中包括胃癌細胞[5-8];但是蘿卜硫素是通過何種機制作用于胃癌細胞的研究較少。蘿卜硫素具有毒副作用低、不產(chǎn)生交叉耐藥的特點,能夠聯(lián)合其他藥物進行治療患者,可能成為輔助治療腫瘤的新藥。前期有相關(guān)報道提出蘿卜硫素可通過Wnt/βcatenin信號通路下調(diào)miR-211表達,從而誘導(dǎo)膠質(zhì)母細胞瘤的凋亡[16];還提出蘿卜硫素可通過抑制Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)增強伊馬替尼對慢性白血病癌癥干細胞治療的有效性[17]。文章實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)蘿卜硫素對胃癌SGC-7901細胞的增殖有顯著的抑制作用,且能誘導(dǎo)SGC-7901細胞的早期凋亡,進一步研究發(fā)現(xiàn)其作用機制可能與抑制Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)。

        Wnt/β-catenin信號通路中的正性調(diào)節(jié)因子是β-catenin,主要表達于細胞膜,維持同型細胞間的黏連;然而磷酸化肌醇3激酶β(GSK-3β)為Wnt信號通路的負性調(diào)控因子,可與Axin、APC等形成復(fù)合體誘導(dǎo)β-catenin的磷酸化,導(dǎo)致β-catenin很快被蛋白酶體水解,進而保證β-catenin在生理條件下的低表達狀態(tài)。文章研究也發(fā)現(xiàn)蘿卜硫素能呈濃度依賴性的抑制β-catenin及c-Myc蛋白表達,而誘導(dǎo)GSK-3β及Caspase3蛋白表達,說明蘿卜硫素可以抑制Wnt/β-catenin信號通路活化達到降低胃癌細胞增殖的效果。當(dāng)前β-catenin已成為治療胃癌藥物的重要靶點之一[9],關(guān)于β-catenin信號傳導(dǎo)的探討較多集中于β-catenin的表達及其轉(zhuǎn)核,對其下游轉(zhuǎn)錄因子TCF4/LEF的研究甚少。本文熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果提示蘿卜硫素能呈劑量依賴性的顯著抑制TCF4/LEF轉(zhuǎn)錄活性,從而抑制Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)。總之,蘿卜硫素能明顯抑制SGC-7901細胞增殖,并誘導(dǎo)其凋亡,可能作用機制與抑制Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)。

        猜你喜歡
        硫素抑制率蘿卜
        中藥單體對黃嘌呤氧化酶的抑制作用
        蘿卜硫素減輕脂多糖誘導(dǎo)小鼠急性腎損傷的作用及機制研究
        硫肥對不同氮磷鉀水平下春玉米硫素積累轉(zhuǎn)化的影響
        血栓彈力圖評估PCI后氯吡格雷不敏感患者抗血小板藥物的療效
        蘿卜硫素通過下調(diào)微小核糖酸-22改善缺氧誘導(dǎo)的心肌H9c2細胞凋亡
        蘿卜硫素通過下調(diào)Cox-2/Akt/GSK3β信號傳導(dǎo)抑制人皮膚鱗狀細胞癌A431細胞增殖
        蘿卜蹲
        買蘿卜
        日本莢蒾葉片中乙酰膽堿酯酶抑制物的提取工藝優(yōu)化*
        鹽度變化對生物發(fā)光細菌的毒性抑制作用研究
        2022国内精品免费福利视频| av一区二区三区亚洲| 亚洲色成人WWW永久在线观看| 亚洲成av人片在线天堂无| 李白姓白白又白类似的套路| 亚洲乳大丰满中文字幕| 夜爽8888视频在线观看| 欧洲国产精品无码专区影院| 美利坚合众国亚洲视频| 成年免费a级毛片免费看无码| 久久人人爽人人爽人人片av麻烦| 天天干夜夜躁| 网红尤物泛滥白浆正在播放| 中文字幕免费在线观看动作大片| 性高朝久久久久久久| 97色综合| 干出白浆视频在线观看| 成人在线免费电影| 中文无码精品一区二区三区| 偷拍自拍一区二区三区| 99国产精品久久一区二区三区 | 麻豆国产精品久久天堂| 人妻少妇精品久久久久久| 亚洲永久无码7777kkk| 国产亚洲精品hd网站| 久久精品亚洲精品国产区| 国产精品免费av片在线观看| 性夜夜春夜夜爽aa片a| 亚洲视频不卡免费在线| 一区二区三区字幕中文| 国产在线视频一区二区三区| 精品久久杨幂国产杨幂| 国产久色在线拍揄自揄拍| 国产在线精品一区二区中文| 亚洲综合中文字幕乱码在线| 国内精品久久人妻性色av| 蜜桃18禁成人午夜免费网站| 东京热加勒比无码少妇| 美女爽好多水快进来视频| 亚洲一区二区三区在线更新| 亚洲成av人片女在线观看|