李 麗，顧文燕，姜 紅

（恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院手術(shù)室，恩施 445000）

蘿卜硫素（Sulforaphane）是一種從十字花科植物中提取的異硫氰酸鹽，易溶于水，還易溶于二氯甲烷和乙酸乙酯，沸點較高，還易被氧化降解，并且蘿卜硫素在抗腫瘤、抗氧化、抗炎及免疫調(diào)節(jié)等方面具有較強的藥理作用[1-4]。前期研究發(fā)現(xiàn)蘿卜硫素主要通過激活胃癌細(xì)胞Ⅱ型解毒酶的生成發(fā)揮抗腫瘤作用[5]。蘿卜硫素還能通過抑制炎癥蛋白表達(dá)來降低胃癌細(xì)胞的生長和侵襲[6]。近期研究也提出蘿卜硫素可通過影響MAPK信號通路活化誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡[7-8]。相關(guān)報道提出對胃癌細(xì)胞內(nèi)Wnt/β-catenin信號通路進行阻斷，能抑制胃癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡[9-10]，然而關(guān)于蘿卜硫素誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡是否通過作用Wnt/β-catenin信號通路，目前尚不清楚。胃癌在中國的發(fā)病率及死亡率較高，主要是術(shù)后腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)風(fēng)險較高，因此尋找安全有效的藥物對胃癌進行預(yù)防及治療迫在眉睫?；谔}卜硫素在抗腫瘤方面具有明顯的藥理活性，文章研究了蘿卜硫素對胃癌細(xì)胞增殖的抑制作用及其作用機制，以期為臨床應(yīng)用提供理論參考。因此，筆者將以胃癌SGC-7901細(xì)胞內(nèi)Wnt/βcatenin 信號通路關(guān)鍵蛋白 β-catenin、GSK-3β、TCF4/LEF為主要研究對象，闡述蘿卜硫素誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的作用機制。

1 材料及方法

1.1 胃癌細(xì)胞 SGC-7901細(xì)胞株由武漢巴菲爾生物有限公司提供（來源于美國ATCC細(xì)胞庫）。

1.2 儀器 DNM-9602G酶標(biāo)儀（美國Thermo公司）；DYY-6C電泳儀（北京六一儀器廠）；5000 Plus凝膠成像系統(tǒng)（美國ProteinSimple公司）；H2050R型臺式冷凍高速離心機（德國EPPENDORF公司）；BBS-V800型單人超凈臺（山東鑫貝西公司）；SPX-250型細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）。

1.3 藥物與試劑 蘿卜硫素（山東綠葉制藥，批號H2011265418，純度≥98%）；胎牛血清、RMPI-1640培養(yǎng)基及0.25%胰蛋白酶購自英國Abcam公司；鼠抗 β-catenin、GSK-3β、c-Myc及 Caspase3抗體購自英國Abcam公司；CCK8試劑盒購自北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司（批號：CK57）；Annexin V/PI凋亡試劑盒購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司；熒光素酶報告基因試劑盒購自New England Biolabs（Beijing）公司。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) 采用1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)SGC-7901細(xì)胞，條件為37℃、5%CO2濃度的恒濕培養(yǎng)箱，用0.25%胰酶-EDTA消化傳代培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.5 CCK8實驗 取對數(shù)生長期細(xì)胞消化、計數(shù)，以5×104個/mL細(xì)胞密度接種于96孔板中，培養(yǎng)過夜，然后用 10、20、40 μmol/L 蘿卜硫素處理細(xì)胞 24、48、72 h后吸去舊培養(yǎng)基，每孔加入10 μL的CCK8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，在450 nm波長處檢測每孔吸光度OD值，并計算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-藥物組OD值/對照組OD值）×100%。

1.6 細(xì)胞凋亡檢測 取對數(shù)生長期細(xì)胞消化、重懸、計數(shù)后，以1×105/mL的濃度接種于6孔板，培養(yǎng)24 h 后，加入 10、20、40 μmol/L 蘿卜硫素干預(yù)細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞，先用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞2遍，然后分別加入Annexin-V FITC和PI處理細(xì)胞（按照試劑盒操作說明書進行），最后用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期。

1.7 熒光素酶報告基因?qū)嶒?把對數(shù)生長期細(xì)胞接種于T25培養(yǎng)瓶，貼壁后用Lipofectamine轉(zhuǎn)染LEF/TCF4 報告質(zhì)粒（pTOP-Luc）3 μg，4 h 后換液。12 h后將細(xì)胞消化接種于24孔板中，貼壁后加入10、20、40 μmol/L 蘿卜硫素進行干預(yù)。24 h 后收集細(xì)胞裂解，按試劑盒操作說明書測定熒光素酶活性。

1.8 蛋白表達(dá)檢測 按照“1.6”項處理完細(xì)胞后，收集細(xì)胞裂解、超聲破碎、12000r/min離心12min后收集上清，BCA試劑盒測定上清蛋白濃度。每個樣本上樣50μg進行凝膠電泳，待蛋白完全分離后進行轉(zhuǎn)膜實驗。結(jié)束后加入5%脫脂奶粉封閉液于搖床上室溫封閉1h后，分別加入β-catenin、GSK-3β、c-Myc及Caspase3抗體（體積稀釋比例均為1∶1 000）4℃反應(yīng)過夜。次日TBST洗膜3次后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（體積稀釋比例為1∶3 000），室溫反應(yīng)1 h。再用TBST洗膜3次，每次10 min，以ECL試劑顯影后進行蛋白條帶灰度值分析。

1.9 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 20.0軟件統(tǒng)計，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，重復(fù)測量資料采用重復(fù)測量設(shè)計方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蘿卜硫素對SGC-7901細(xì)胞增殖抑制率的影響 經(jīng)過 10、20、40 μmol/L蘿卜硫素干預(yù) SGC-7901細(xì)胞24、48、72h后增殖抑制率比較結(jié)果見表1。蘿卜硫素干預(yù)24、48、72 h后，與對照組比較，低、中、高劑量蘿卜硫素組SGC-7901細(xì)胞抑制率明顯升高，并且各藥物組之間細(xì)胞抑制率存在顯著性差異（P<0.05），呈現(xiàn)出劑量依賴性；在同一藥物濃度條件下，相比于藥物處理24 h，藥物干預(yù)48和72 h后細(xì)胞增殖抑制率也明顯升高，且各時間點之間差異均有顯著性（P<0.05），表現(xiàn)出時間依賴性。

2.2 蘿卜硫素對SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞儀檢測了蘿卜硫素對SGC-7901細(xì)胞周期的影響，見表2、圖1。結(jié)果提示SGC-7901細(xì)胞經(jīng)蘿卜硫素干預(yù)后，處于G0/G1期的細(xì)胞數(shù)顯著增多，而S期及G2/M期細(xì)胞數(shù)相對減少，由此說明蘿卜硫素能誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞凋亡。

2.3 蘿卜硫素對SGC-7901細(xì)胞TCF4/LEF報告質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄活性的影響 與對照組（1.00±0.00）比較，10、20、40 μmol/L 蘿卜硫素組 TCF4/LEF 轉(zhuǎn)錄活性[（0.72±0.21）、（0.51±0.17）、（0.37±0.28）]隨藥物劑量升高呈逐漸下降的趨勢，差異有顯著性（F=521.357，P=0.000）。結(jié)果提示蘿卜硫素能顯著抑制TCF4/LEF轉(zhuǎn)錄活性，還表現(xiàn)出濃度依賴性，說明蘿卜硫素可顯著抑制Wnt/β-catenin信號的傳導(dǎo)。

2.4 蘿卜硫素對促凋亡蛋白及Wnt/β-catenin通路蛋白的影響 各組間胃癌SGC-7901細(xì)胞中βcatenin、GSK-3β、c-Myc及 Caspase3 蛋白表達(dá)水平比較見圖2，結(jié)果提示不同劑量蘿卜硫素均能抑制β-catenin及c-Myc蛋白表達(dá)，而誘導(dǎo)GSK-3β及Caspase3蛋白表達(dá)，并且它們的表達(dá)水平與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

表1 各組間SGC-7901細(xì)胞抑制率比較Tab.1 Comparison of SGC-7901 cell inhibitory rates in each group

表2 各組間細(xì)胞周期比較（）Tab.2 Comparison of cell cycle in each group（）

表2 各組間細(xì)胞周期比較（）Tab.2 Comparison of cell cycle in each group（）

注：與對照組比較，*P<0.05。

分組 劑量（μmol/L） G0/G1 S G2/M對照組 - 48.6±2.3 18.1±1.5 33.3±2.4蘿卜硫素低劑量組 10 52.6±3.6 15.2±1.3 32.2±2.1蘿卜硫素中劑量組 20 63.4±1.8* 10.3±2.0* 26.3±1.8蘿卜硫素高劑量組 40 69.5±2.9* 9.8±1.5 20.7±2.4*

圖1 各組間細(xì)胞凋亡率比較Fig.1 Comparison of cell apoptotic rates in each group

3 討論

對于胃癌發(fā)病機制的研究還存在較大爭議，目前對于胃癌的治療手段以手術(shù)為主，然而術(shù)后化療藥物不僅療效不佳，還會導(dǎo)致病灶周圍正常組織的損傷，進而誘發(fā)免疫功能紊亂[11-12]。因為目前缺少對胃癌患者早期診斷的標(biāo)志物，大多數(shù)患者確診后處于中晚期，術(shù)后患者又會出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及化療藥物帶來的不良反應(yīng)，極大降低了患者的生存質(zhì)量。隨著物質(zhì)生活水平的提升，胃癌患病率也在不斷提升，所以提高臨床診斷率、早期干預(yù)、改善患者術(shù)后生存質(zhì)量是急需解決的問題[13-15]。因此，尋找對胃癌藥理作用較強的天然活性成分已成為目前研究的熱點。

圖2 各組間β-catenin、GSK-3β、c-Myc及Caspase3蛋白表達(dá)水平比較Fig.2 Comparison of expression levels of β-catenin，GSK-3β，c-Myc and Caspase3 proteins in each group

蘿卜硫素是十字花科植物中的一種天然活性成分，對多種腫瘤細(xì)胞增殖均表現(xiàn)出較強的抑制作用，其中包括胃癌細(xì)胞[5-8]；但是蘿卜硫素是通過何種機制作用于胃癌細(xì)胞的研究較少。蘿卜硫素具有毒副作用低、不產(chǎn)生交叉耐藥的特點，能夠聯(lián)合其他藥物進行治療患者，可能成為輔助治療腫瘤的新藥。前期有相關(guān)報道提出蘿卜硫素可通過Wnt/βcatenin信號通路下調(diào)miR-211表達(dá)，從而誘導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的凋亡[16]；還提出蘿卜硫素可通過抑制Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)增強伊馬替尼對慢性白血病癌癥干細(xì)胞治療的有效性[17]。文章實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)蘿卜硫素對胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖有顯著的抑制作用，且能誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞的早期凋亡，進一步研究發(fā)現(xiàn)其作用機制可能與抑制Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)。

Wnt/β-catenin信號通路中的正性調(diào)節(jié)因子是β-catenin，主要表達(dá)于細(xì)胞膜，維持同型細(xì)胞間的黏連；然而磷酸化肌醇3激酶β（GSK-3β）為Wnt信號通路的負(fù)性調(diào)控因子，可與Axin、APC等形成復(fù)合體誘導(dǎo)β-catenin的磷酸化，導(dǎo)致β-catenin很快被蛋白酶體水解，進而保證β-catenin在生理條件下的低表達(dá)狀態(tài)。文章研究也發(fā)現(xiàn)蘿卜硫素能呈濃度依賴性的抑制β-catenin及c-Myc蛋白表達(dá)，而誘導(dǎo)GSK-3β及Caspase3蛋白表達(dá)，說明蘿卜硫素可以抑制Wnt/β-catenin信號通路活化達(dá)到降低胃癌細(xì)胞增殖的效果。當(dāng)前β-catenin已成為治療胃癌藥物的重要靶點之一[9]，關(guān)于β-catenin信號傳導(dǎo)的探討較多集中于β-catenin的表達(dá)及其轉(zhuǎn)核，對其下游轉(zhuǎn)錄因子TCF4/LEF的研究甚少。本文熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果提示蘿卜硫素能呈劑量依賴性的顯著抑制TCF4/LEF轉(zhuǎn)錄活性，從而抑制Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)。總之，蘿卜硫素能明顯抑制SGC-7901細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡，可能作用機制與抑制Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)。