李 麗，顧文燕，姜 紅

（恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院手術室，恩施 445000）

蘿卜硫素（Sulforaphane）是一種從十字花科植物中提取的異硫氰酸鹽，易溶于水，還易溶于二氯甲烷和乙酸乙酯，沸點較高，還易被氧化降解，并且蘿卜硫素在抗腫瘤、抗氧化、抗炎及免疫調節(jié)等方面具有較強的藥理作用[1-4]。前期研究發(fā)現(xiàn)蘿卜硫素主要通過激活胃癌細胞Ⅱ型解毒酶的生成發(fā)揮抗腫瘤作用[5]。蘿卜硫素還能通過抑制炎癥蛋白表達來降低胃癌細胞的生長和侵襲[6]。近期研究也提出蘿卜硫素可通過影響MAPK信號通路活化誘導胃癌細胞凋亡[7-8]。相關報道提出對胃癌細胞內Wnt/β-catenin信號通路進行阻斷，能抑制胃癌細胞的增殖并誘導其凋亡[9-10]，然而關于蘿卜硫素誘導胃癌細胞凋亡是否通過作用Wnt/β-catenin信號通路，目前尚不清楚。胃癌在中國的發(fā)病率及死亡率較高，主要是術后腫瘤細胞轉移及復發(fā)風險較高，因此尋找安全有效的藥物對胃癌進行預防及治療迫在眉睫?；谔}卜硫素在抗腫瘤方面具有明顯的藥理活性，文章研究了蘿卜硫素對胃癌細胞增殖的抑制作用及其作用機制，以期為臨床應用提供理論參考。因此，筆者將以胃癌SGC-7901細胞內Wnt/βcatenin 信號通路關鍵蛋白 β-catenin、GSK-3β、TCF4/LEF為主要研究對象，闡述蘿卜硫素誘導胃癌細胞凋亡的作用機制。

1 材料及方法

1.1 胃癌細胞 SGC-7901細胞株由武漢巴菲爾生物有限公司提供（來源于美國ATCC細胞庫）。

1.2 儀器 DNM-9602G酶標儀（美國Thermo公司）；DYY-6C電泳儀（北京六一儀器廠）；5000 Plus凝膠成像系統(tǒng)（美國ProteinSimple公司）；H2050R型臺式冷凍高速離心機（德國EPPENDORF公司）；BBS-V800型單人超凈臺（山東鑫貝西公司）；SPX-250型細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）。

1.3 藥物與試劑 蘿卜硫素（山東綠葉制藥，批號H2011265418，純度≥98%）；胎牛血清、RMPI-1640培養(yǎng)基及0.25%胰蛋白酶購自英國Abcam公司；鼠抗 β-catenin、GSK-3β、c-Myc及 Caspase3抗體購自英國Abcam公司；CCK8試劑盒購自北京智杰方遠科技有限公司（批號：CK57）；Annexin V/PI凋亡試劑盒購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司；熒光素酶報告基因試劑盒購自New England Biolabs（Beijing）公司。

1.4 細胞培養(yǎng) 采用1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)SGC-7901細胞，條件為37℃、5%CO2濃度的恒濕培養(yǎng)箱，用0.25%胰酶-EDTA消化傳代培養(yǎng)。當細胞生長狀態(tài)良好時，取對數生長期細胞用于后續(xù)實驗。

1.5 CCK8實驗 取對數生長期細胞消化、計數，以5×104個/mL細胞密度接種于96孔板中，培養(yǎng)過夜，然后用 10、20、40 μmol/L 蘿卜硫素處理細胞 24、48、72 h后吸去舊培養(yǎng)基，每孔加入10 μL的CCK8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，在450 nm波長處檢測每孔吸光度OD值，并計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率（%）=（1-藥物組OD值/對照組OD值）×100%。

1.6 細胞凋亡檢測 取對數生長期細胞消化、重懸、計數后，以1×105/mL的濃度接種于6孔板，培養(yǎng)24 h 后，加入 10、20、40 μmol/L 蘿卜硫素干預細胞24 h后，收集細胞，先用預冷的PBS清洗細胞2遍，然后分別加入Annexin-V FITC和PI處理細胞（按照試劑盒操作說明書進行），最后用流式細胞儀分析細胞周期。

1.7 熒光素酶報告基因實驗 把對數生長期細胞接種于T25培養(yǎng)瓶，貼壁后用Lipofectamine轉染LEF/TCF4 報告質粒（pTOP-Luc）3 μg，4 h 后換液。12 h后將細胞消化接種于24孔板中，貼壁后加入10、20、40 μmol/L 蘿卜硫素進行干預。24 h 后收集細胞裂解，按試劑盒操作說明書測定熒光素酶活性。

1.8 蛋白表達檢測 按照“1.6”項處理完細胞后，收集細胞裂解、超聲破碎、12000r/min離心12min后收集上清，BCA試劑盒測定上清蛋白濃度。每個樣本上樣50μg進行凝膠電泳，待蛋白完全分離后進行轉膜實驗。結束后加入5%脫脂奶粉封閉液于搖床上室溫封閉1h后，分別加入β-catenin、GSK-3β、c-Myc及Caspase3抗體（體積稀釋比例均為1∶1 000）4℃反應過夜。次日TBST洗膜3次后加入HRP標記的山羊抗兔IgG（體積稀釋比例為1∶3 000），室溫反應1 h。再用TBST洗膜3次，每次10 min，以ECL試劑顯影后進行蛋白條帶灰度值分析。

1.9 數據分析 采用SPSS 20.0軟件統(tǒng)計，計量資料采用均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，重復測量資料采用重復測量設計方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 蘿卜硫素對SGC-7901細胞增殖抑制率的影響 經過 10、20、40 μmol/L蘿卜硫素干預 SGC-7901細胞24、48、72h后增殖抑制率比較結果見表1。蘿卜硫素干預24、48、72 h后，與對照組比較，低、中、高劑量蘿卜硫素組SGC-7901細胞抑制率明顯升高，并且各藥物組之間細胞抑制率存在顯著性差異（P<0.05），呈現(xiàn)出劑量依賴性；在同一藥物濃度條件下，相比于藥物處理24 h，藥物干預48和72 h后細胞增殖抑制率也明顯升高，且各時間點之間差異均有顯著性（P<0.05），表現(xiàn)出時間依賴性。

2.2 蘿卜硫素對SGC-7901細胞凋亡的影響 流式細胞儀檢測了蘿卜硫素對SGC-7901細胞周期的影響，見表2、圖1。結果提示SGC-7901細胞經蘿卜硫素干預后，處于G0/G1期的細胞數顯著增多，而S期及G2/M期細胞數相對減少，由此說明蘿卜硫素能誘導SGC-7901細胞凋亡。

2.3 蘿卜硫素對SGC-7901細胞TCF4/LEF報告質粒轉錄活性的影響 與對照組（1.00±0.00）比較，10、20、40 μmol/L 蘿卜硫素組 TCF4/LEF 轉錄活性[（0.72±0.21）、（0.51±0.17）、（0.37±0.28）]隨藥物劑量升高呈逐漸下降的趨勢，差異有顯著性（F=521.357，P=0.000）。結果提示蘿卜硫素能顯著抑制TCF4/LEF轉錄活性，還表現(xiàn)出濃度依賴性，說明蘿卜硫素可顯著抑制Wnt/β-catenin信號的傳導。

2.4 蘿卜硫素對促凋亡蛋白及Wnt/β-catenin通路蛋白的影響 各組間胃癌SGC-7901細胞中βcatenin、GSK-3β、c-Myc及 Caspase3 蛋白表達水平比較見圖2，結果提示不同劑量蘿卜硫素均能抑制β-catenin及c-Myc蛋白表達，而誘導GSK-3β及Caspase3蛋白表達，并且它們的表達水平與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

表1 各組間SGC-7901細胞抑制率比較Tab.1 Comparison of SGC-7901 cell inhibitory rates in each group

表2 各組間細胞周期比較（）Tab.2 Comparison of cell cycle in each group（）

表2 各組間細胞周期比較（）Tab.2 Comparison of cell cycle in each group（）

注：與對照組比較，*P<0.05。

分組 劑量（μmol/L） G0/G1 S G2/M對照組 - 48.6±2.3 18.1±1.5 33.3±2.4蘿卜硫素低劑量組 10 52.6±3.6 15.2±1.3 32.2±2.1蘿卜硫素中劑量組 20 63.4±1.8* 10.3±2.0* 26.3±1.8蘿卜硫素高劑量組 40 69.5±2.9* 9.8±1.5 20.7±2.4*

圖1 各組間細胞凋亡率比較Fig.1 Comparison of cell apoptotic rates in each group

3 討論

對于胃癌發(fā)病機制的研究還存在較大爭議，目前對于胃癌的治療手段以手術為主，然而術后化療藥物不僅療效不佳，還會導致病灶周圍正常組織的損傷，進而誘發(fā)免疫功能紊亂[11-12]。因為目前缺少對胃癌患者早期診斷的標志物，大多數患者確診后處于中晚期，術后患者又會出現(xiàn)腫瘤細胞轉移、復發(fā)及化療藥物帶來的不良反應，極大降低了患者的生存質量。隨著物質生活水平的提升，胃癌患病率也在不斷提升，所以提高臨床診斷率、早期干預、改善患者術后生存質量是急需解決的問題[13-15]。因此，尋找對胃癌藥理作用較強的天然活性成分已成為目前研究的熱點。

圖2 各組間β-catenin、GSK-3β、c-Myc及Caspase3蛋白表達水平比較Fig.2 Comparison of expression levels of β-catenin，GSK-3β，c-Myc and Caspase3 proteins in each group

蘿卜硫素是十字花科植物中的一種天然活性成分，對多種腫瘤細胞增殖均表現(xiàn)出較強的抑制作用，其中包括胃癌細胞[5-8]；但是蘿卜硫素是通過何種機制作用于胃癌細胞的研究較少。蘿卜硫素具有毒副作用低、不產生交叉耐藥的特點，能夠聯(lián)合其他藥物進行治療患者，可能成為輔助治療腫瘤的新藥。前期有相關報道提出蘿卜硫素可通過Wnt/βcatenin信號通路下調miR-211表達，從而誘導膠質母細胞瘤的凋亡[16]；還提出蘿卜硫素可通過抑制Wnt/β-catenin信號傳導增強伊馬替尼對慢性白血病癌癥干細胞治療的有效性[17]。文章實驗結果發(fā)現(xiàn)蘿卜硫素對胃癌SGC-7901細胞的增殖有顯著的抑制作用，且能誘導SGC-7901細胞的早期凋亡，進一步研究發(fā)現(xiàn)其作用機制可能與抑制Wnt/β-catenin信號通路有關。

Wnt/β-catenin信號通路中的正性調節(jié)因子是β-catenin，主要表達于細胞膜，維持同型細胞間的黏連；然而磷酸化肌醇3激酶β（GSK-3β）為Wnt信號通路的負性調控因子，可與Axin、APC等形成復合體誘導β-catenin的磷酸化，導致β-catenin很快被蛋白酶體水解，進而保證β-catenin在生理條件下的低表達狀態(tài)。文章研究也發(fā)現(xiàn)蘿卜硫素能呈濃度依賴性的抑制β-catenin及c-Myc蛋白表達，而誘導GSK-3β及Caspase3蛋白表達，說明蘿卜硫素可以抑制Wnt/β-catenin信號通路活化達到降低胃癌細胞增殖的效果。當前β-catenin已成為治療胃癌藥物的重要靶點之一[9]，關于β-catenin信號傳導的探討較多集中于β-catenin的表達及其轉核，對其下游轉錄因子TCF4/LEF的研究甚少。本文熒光素酶報告基因實驗結果提示蘿卜硫素能呈劑量依賴性的顯著抑制TCF4/LEF轉錄活性，從而抑制Wnt/β-catenin信號傳導?？傊?，蘿卜硫素能明顯抑制SGC-7901細胞增殖，并誘導其凋亡，可能作用機制與抑制Wnt/β-catenin信號通路有關。