李田楠，黃健花，劉睿杰，常 明，王小三，王興國，金青哲

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

隨著現(xiàn)代人對(duì)養(yǎng)生的關(guān)注，亞麻籽油因具有多種保健功能日漸得到消費(fèi)者的青睞[1]。然而，亞麻籽油在儲(chǔ)存中常易氧化變苦[2]，Brühl等[3]鑒定證實(shí)亞麻籽油的關(guān)鍵苦味化合物為一種環(huán)八肽(Cyclolinopeptide E，CLE)，俗稱苦味肽。

目前，關(guān)于亞麻籽油CLE的定量檢測(cè)多采用HPLC法，以往關(guān)于CLE定量的研究中多側(cè)重CLE在亞麻籽油加工或儲(chǔ)存過程中的變化[4-6]，幾乎未有文獻(xiàn)關(guān)注不同前處理方法對(duì)CLE測(cè)定效果的影響，僅利嘉祥等[7]對(duì)SPE硅膠柱分離法與乙醇萃取法做了比較，認(rèn)為乙醇萃取法對(duì)于亞麻籽油中環(huán)肽的富集更有優(yōu)勢(shì)。

對(duì)于油脂樣品中微量伴隨物測(cè)定的前處理方法主要有溶劑萃取法和固相萃取法(SPE)。溶劑萃取法是一種經(jīng)典的色譜分析前處理方法，具有設(shè)備簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn)，但也存在萃取時(shí)間長(zhǎng)、液態(tài)樣品易乳化等問題。固相萃取法采用高選擇性的固定相，改善了因溶劑萃取過程中的乳化現(xiàn)象對(duì)樣品定量造成的偏差[8-9]，然而Sharav等[10]采用硅膠柱層析提取亞麻籽油環(huán)肽，分析前需要裝柱，操作人員的影響較大，且上樣量和試劑消耗量大。目前市場(chǎng)上可買到商品化的固相萃取小柱，操作簡(jiǎn)單、所需樣品和溶劑量少，成為一種常用的樣品前處理方法。

本文對(duì)高效液相色譜定量測(cè)定亞麻籽油苦味肽的溶劑萃取法和固相萃取法純化富集前處理效果進(jìn)行了比較，旨在為亞麻籽油苦味肽選擇合適的純化富集前處理方法，為深入研究亞麻籽油的苦味奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

亞麻籽油，由寧夏君星坊食品科技有限公司提供。

SPE硅膠小柱，上海安譜公司；Cyclolinopeptide E標(biāo)準(zhǔn)品，純度99%，加拿大Prairie Tide化學(xué)品公司；無水甲醇、乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷、無水乙醇，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈、甲醇，色譜純，百靈威科技有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Waters Acquity型超高效液相色譜儀，Waters Synapt Q-TOF-MS質(zhì)譜儀，Masslynx 4.1色譜工作站；Waters1525高效液相色譜儀，Waters 2996可變波長(zhǎng)二極管陣列檢測(cè)器；KH7200DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；R-501旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海申順生物科技有限公司；SHZ-3循環(huán)水多用真空泵；AL204電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 溶劑萃取法提取亞麻籽油中苦味肽

1.2.1.1 甲醇溶劑萃取法

參考Aladedunye等[6]的環(huán)肽提取方法。稱取1 g 亞麻籽油加入10 mL色譜純甲醇，旋渦振蕩1 min，超聲處理1 h，離心后收集上清液。

1.2.1.2 乙醇溶劑萃取法

參考利嘉祥等[7]的方法。稱取5 g亞麻籽油，以料液比5∶8加入無水乙醇，旋渦振蕩5 min。離心后吸取上清液，重復(fù)萃取3次，合并萃取液，40℃旋蒸脫溶，用色譜級(jí)甲醇將燒瓶底部的油移至離心管中，旋渦振蕩并離心，吸取上清液至10 mL的容量瓶中，定容。

1.2.2 固相萃取法提取亞麻籽油中苦味肽

比較填料為0.5、1、2 g不同規(guī)格SPE硅膠小柱的前處理效果，參考Gui等[11]的樣品前處理方法。先分別將硅膠柱用1、2、4 mL正己烷活化，將1 g油樣溶于1 mL正己烷，上柱。在真空條件下，依次用正己烷、正己烷-乙酸乙酯(體積比8∶2)、正己烷-乙酸乙酯(體積比5∶5)各10 mL進(jìn)行洗脫，將小柱抽干后，再分別用乙酸乙酯、甲醇-二氯甲烷(體積比1∶9)各10 mL進(jìn)行洗脫，收集最后兩步洗脫液，合并后于40℃旋蒸脫溶，用色譜級(jí)甲醇分2～3次復(fù)溶圓底燒瓶底部的環(huán)肽，并通過超聲促進(jìn)溶解，定容至5 mL。

1.2.3 HPLC定量測(cè)定亞麻籽油苦味肽

將亞麻籽油樣品按照1.2.1或1.2.2方法前處理后，經(jīng)過HPLC進(jìn)行定量分析，采用外標(biāo)法定量。

參考連瑩君等[12]梯度洗脫的方法，使用Amethyst C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以乙腈為流動(dòng)相A、超純水為流動(dòng)相B，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm，柱溫35℃，進(jìn)樣量20 μL條件下測(cè)定。苦味肽含量按下式計(jì)算。

式中：x為亞麻籽油中苦味肽含量，mg/kg；ρ為試樣測(cè)定液中苦味肽質(zhì)量濃度，μg/mL；V為試樣測(cè)定液定容體積，mL；m為試樣的稱樣量，g。

2 結(jié)果與討論

2.1 溶劑萃取法與固相萃取法比較

2.1.1 溶劑萃取法與固相萃取法的除雜效果比較

取一苦味亞麻籽油為試驗(yàn)原料，分別用溶劑萃取法和固相萃取法進(jìn)行前處理，通過HPLC測(cè)定CLE含量。所有前處理方法測(cè)得的HPLC譜圖顯示，通過溶劑萃取法和固相萃取法前處理，CLE均可以得到良好的分離效果，所測(cè)CLE在色譜圖中均于保留時(shí)間19 min左右出峰，前處理不影響CLE的出峰。但是，就不同前處理方法油樣的各色譜圖的雜峰而言，與SPE硅膠小柱前處理相比，溶劑萃取前處理后油樣的色譜圖中保留時(shí)間在28 min以后有較多雜峰，其中含有較多的甘油三酯，這些雜質(zhì)的存在對(duì)于保護(hù)液相色譜柱、提高柱效是極為不利的。溶劑萃取預(yù)處理亞麻籽油的HPLC譜圖之所以有大量雜峰，是由于油脂在萃取溶劑中存在一定程度的溶解，尤其是乙醇萃取法樣品，由于其對(duì)油脂溶解性相對(duì)更好[13]，雜峰尤為明顯，即使以油脂溶解性較差的甲醇為例，甲醇萃取法預(yù)處理油樣的HPLC譜圖中，所含雜質(zhì)的峰面積是CLE峰面積的7.14倍，而SPE硅膠小柱前處理油樣將甘油三酯及其他雜質(zhì)有效去除，其色譜圖所含雜質(zhì)的峰面積是CLE峰面積的4.23倍(甲醇萃取預(yù)處理和SPE預(yù)處理亞麻籽油HPLC譜圖見圖1，其余色譜圖略)。因此，為了保護(hù)色譜柱、提高柱效、延長(zhǎng)柱子使用壽命，固相萃取法預(yù)處理較溶劑萃取更理想。

注：a.甲醇萃取預(yù)處理；b.SPE預(yù)處理。

2.1.2 溶劑萃取法與固相萃取法的提取效果比較

不同方法預(yù)處理的除雜效果存在較大差異，但是就分析檢測(cè)方法的樣品前處理而言，僅僅實(shí)現(xiàn)有效除雜是不夠的，脫除雜質(zhì)的同時(shí)，還須實(shí)現(xiàn)待測(cè)物的有效保留，因此進(jìn)一步比較了同一亞麻籽油樣品經(jīng)不同前處理后，所測(cè)得的CLE含量，評(píng)估不同前處理方法對(duì)亞麻籽油CLE測(cè)定的有效性，結(jié)果如表1所示。

表1 不同前處理方法提取同一亞麻籽油CLE測(cè)定結(jié)果

注：同列不同字母表示具有顯著性差異(p<0.05)。

由表1可知，乙醇溶劑萃取法對(duì)亞麻籽油進(jìn)行前處理所測(cè)CLE含量比其他方法明顯偏低，甲醇溶劑萃取與固相萃取法前處理所測(cè)CLE含量基本相當(dāng)。進(jìn)一步對(duì)比3種不同規(guī)格的SPE硅膠小柱的前處理效果，發(fā)現(xiàn)隨著SPE硅膠小柱填料量的增加，CLE含量測(cè)定值減小，使用填料規(guī)格為0.5 g的SPE硅膠小柱對(duì)亞麻籽油進(jìn)行前處理所測(cè)CLE含量最高。

綜上所述，采用填料為0.5 g的SPE硅膠小柱進(jìn)行亞麻籽油CLE測(cè)定的前處理，較溶劑萃取法具有更好的除雜與提取效果，該SPE硅膠小柱前處理方法更適宜進(jìn)行亞麻籽油CLE測(cè)定前的純化富集。

2.2 固相萃取法前處理方法的評(píng)價(jià)

2.2.1 苦味肽的定性分析

為了進(jìn)一步評(píng)估固相萃取法作為亞麻籽油中CLE提取方法的有效性，將亞麻籽油樣品經(jīng)過填料規(guī)格為0.5 g的SPE硅膠小柱處理后送樣檢測(cè)，與CLE標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)通過超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行定性分析。CLE在正離子模式下易形成[M+H]+等準(zhǔn)分子離子，首先根據(jù)m/z為977.5選出目標(biāo)峰，通過分析其二級(jí)質(zhì)譜(見圖2)，判斷是否為CLE分子。

圖2 CLE標(biāo)準(zhǔn)品(a)與亞麻籽油樣品m/z為

由圖2可知，CLE標(biāo)準(zhǔn)品的二級(jí)質(zhì)譜圖中主要峰的m/z分別為977.50、913.48、830.46、731.39、618.31、554.30、408.18、358.19、261.12、211.13、183.14、120.07。而在亞麻籽油樣品m/z為977.5的化合物的二級(jí)質(zhì)譜圖中，以上m/z均能找到，因此可證明該化合物是CLE。這說明固相萃取法可以將亞麻籽油中存在的CLE有效提取出來。

2.2.2 準(zhǔn)確度評(píng)價(jià)和精密度評(píng)價(jià)

取兩份質(zhì)量為1.0 g的亞麻籽油，在其中一份中加入1 mL 100 μg/mL的CLE標(biāo)準(zhǔn)甲醇溶液，與另一份同時(shí)經(jīng)過填料規(guī)格為0.5 g的SPE硅膠小柱前處理后，測(cè)定CLE含量，計(jì)算樣品加標(biāo)回收率，結(jié)果見表2。

表2 苦味肽的樣品加標(biāo)回收率

由表2可知，樣品加標(biāo)回收率測(cè)定結(jié)果與GB/T 27404—2008中的參考范圍非常接近。

將亞麻籽油經(jīng)過填料規(guī)格為0.5 g的SPE硅膠小柱前處理，分別于4、8、12 h測(cè)定CLE含量，計(jì)算得到組內(nèi)精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.62%；將前處理后的樣品連續(xù)測(cè)定5 d，計(jì)算得到組間精密度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.79%。綜上，說明該方法的準(zhǔn)確度和精密度良好。

3 結(jié) 論

本文比較了HPLC定量測(cè)定亞麻籽油苦味肽的溶劑萃取法和固相萃取法的純化富集前處理效果。就除雜效果而言，固相萃取法比溶劑萃取法所提取的環(huán)肽樣品中甘油三酯及其他雜質(zhì)顯著減少，有利于保護(hù)液相色譜柱、提高柱效；就提取效果而言，使用填料規(guī)格為0.5 g的SPE硅膠小柱可以得到較好的分離及富集效果。經(jīng)過定性分析、準(zhǔn)確度及精密度評(píng)價(jià)，證明此方法準(zhǔn)確可靠，可作為測(cè)定亞麻籽油中苦味肽含量的前處理方法。