張學松　張謝　宋毓飛　林虹　吳玲劍

[摘要] 目的 觀察缺氧模擬物二氯化鈷（CoCl2）對人源HCT116腸癌細胞成纖維細胞生長因子21（FGF21）表達的影響。 方法 分別用0、50、100和200 μmol/L的CoCl2處理HCT116細胞24 h，同時用200 μmol/L的CoCl2處理HCT116細胞12、48 h，RT-PCR 法和Western blot法分別檢測細胞中的FGF21 mRNA和蛋白的表達水平;分別用缺氧誘導因子抑制劑2ME2和YC-1，同時加入CoCl2處理HCT116腸癌細胞24 h，RT-PCR法檢測細胞中的FGF21 mRNA;用抗氧化劑NAC和CoCl2同時處理HCT116腸癌細胞24 h，RT-PCR法和Western blot法分別檢測細胞中的FGF21 mRNA和蛋白的表達量。 結果 隨CoCl2濃度增加和作用時間延長，HCT116細胞FGF21 mRNA 相對表達量逐漸降低（P<0.05）。Western blot結果顯示，與對照組相比，CoCl2組FGF21 蛋白表達水平顯著下降（P<0.05）。缺氧誘導因子抑制劑處理后，HCT116細胞FGF21 mRNA相對表達量依然降低（P<0.05）。抗氧化劑處理后，HCT116細胞FGF21 mRNA 和蛋白相對表達量未出現(xiàn)明顯降低（P>0.05）。 結論 CoCl2對HCT116腸癌細胞FGF21 的表達有抑制作用，該作用與缺氧誘導因子無關，而與氧化應激有關。

[關鍵詞] 缺氧;成纖維細胞生長因子21;HCT116腸癌細胞;二氯化鈷

[中圖分類號] R735.3 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-9701（2019）25-0014-04

Regulation of hypoxia on fibroblast growth factor 21 in HCT116 intestinal cancer cells

ZHANG Xuesong1 ZHANG Xie2 SONG Yufei1 LIN Hong3 WU Lingjian4

1.Department of Gastroenterology，Ningbo Medical Center Lihuili Hospital，Ningbo ? 315040，China; 2.Department of Pharmacy，Ningbo Medical Center Lihuili Hospital，Ningbo ? 315040，China; 3.College of Laboratory Medicine，College of Life Sciences，Wenzhou Medical University，Wenzhou ? 325000，China; 4.Department of Dermatology，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou ? 325000，China

[Abstract] Objective To observe the effect of hypoxia mimicking cobalt dichloride（CoCl2） on the expression of fibroblast growth factor 21（FGF21） in human HCT116 intestinal cancer cells. Methods HCT116 cells were treated with 0， 50， 100 and 200 μmol/L CoCl2 for 24 h， and HCT116 cells were treated with 200 μmol/L CoCl2 for 12 and 48 h. RT-PCR and Western blot were used to detect the expression of FGF21 mRNA and protein in the cells. HCT116 intestinal cancer cells were treated with hypoxia-inducible factor inhibitors 2ME2 and YC-1， respectively， added into CoCl2 for 24 h. RT-PCR was used to detect FGF21 mRNA in cells. HCT116 intestinal cancer cells were treated with antioxidants NAC and CoCl2 for 24 h， and the expression of FGF21 mRNA and protein was detected by RT-PCR and Western blot. Results With the increase of CoCl2 concentration and prolonged action time， the relative expression of FGF21 mRNA in HCT116 cells decreased gradually（P<0.05）. Western blot results showed that the expression of FGF21 protein in CoCl2 group was significantly lower than that in the control group（P<0.05）. After treatment with hypoxia-inducible factor inhibitor， the relative expression of FGF21 mRNA in HCT116 cells was still decreased（P<0.05）. After antioxidant treatment， the relative expression of FGF21 mRNA and protein in HCT116 cells did not decrease significantly（P>0.05）. Conclusion CoCl2 can inhibit the expression of FGF21 in HCT116 intestinal cancer cells， which is not related to hypoxia-inducible factors but related to oxidative stress.

[Key words] Hypoxia; Fibroblast growth factor 21; HCT116 intestinal cancer cells; Cobalt dichloride

腫瘤細胞生長過程中缺氧及糖脂代謝紊亂是重要的病理生理過程，缺氧誘導因子-1（HIF-1）對腫瘤細胞的能量代謝起重要的調控作用，但目前人們對缺氧導致腫瘤代謝紊亂的分子機制尚不完全清楚[1，2]。成纖維細胞生長因子-21（FGF21）是一種潛在的代謝調節(jié)因子，參與機體物質代謝，維持機體內脂糖代謝的平衡[3，4]。FGF21的主要功能體現(xiàn)在降低血糖和改善血脂方面[5]，但迄今為止，關于FGF21與腫瘤關系的研究報道甚少。本研究采用化學缺氧劑二氯化鈷（CoCl2）進行誘導，觀察缺氧對HCT116腸癌細胞FGF21表達的影響，為開發(fā)新型抗腫瘤藥物提供新靶點和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人源HCT116腸癌細胞（上海中科院細胞庫）;CoCl2，2ME2，YC-1，NAC（美國Sigma公司）;胎牛血清（FBS），Trizol，Mc Coy's 5A培養(yǎng)基（美國Invitrogen公司），F(xiàn)GF21抗體（美國santa cruz公司，貨號：sc-81946）、GAPDH抗體（美國santa cruz公司，貨號：sc-47724）、兔抗鼠二抗（美國santa cruz公司，貨號：sc-2039）。

1.2 主要儀器

顯微鏡（ECLPSE 80i型，日本Nikon公司）;高速冷凍離心機（micro21R型，美國Thermo Fisher公司）;超純水（Direct-Q3 型，美國Millipore公司）;PCR儀（T100型，美國Bio-Rad公司）;凝膠成像儀器（ChemiDocTM XRS+，美國Bio-Rad公司）。

1.3 細胞培養(yǎng)

HCT116 腸癌細胞用含10% FBS的 Mc Coy's 5A的培養(yǎng)基培養(yǎng)，在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期。每48～72小時更換1次新鮮培養(yǎng)液，72～96 h傳代1次。

1.4 CoCl2對HCT116細胞的處理

3×105細胞/3 mL接種于100 mm 培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)12 h，待細胞貼壁后，0.1%血清培養(yǎng)基饑餓12 h后，分別用0、50、100和200 μmol/L 的CoCl2處理HCT116 細胞24 h后收取蛋白和RNA;用200 μmol/L 的CoCl2分別處理HCT116 細胞0、12和24 h，提取細胞總蛋白和RNA用于后續(xù)實驗。

1.5 缺氧誘導因子抑制劑對HCT116細胞的處理

將HCT116細胞分為4 組，2ME2+CoCl2、YC-1+ CoCl2組分別以缺氧誘導因子抑制劑2ME2（100 μmol/L）或YC-1（50 μmol /L）與CoCl2（200 μmol/L）同時處理HCT116細胞24 h，對照組不處理，CoCl2組直接加200 μmol/L的CoCl2處理24 h后提取細胞總蛋白和RNA用于后續(xù)實驗。

1.6 抗氧化劑對HCT116細胞的處理

將HCT116細胞分為3 組，NAC+CoCl2組以ROS抑制劑NAC（3 μmol/L）與CoCl2（200 μmol/L）同時處理HCT116細胞24 h，對照組不處理，CoCl2組直接加200 μmol/L 的CoCl2處理24 h后提取細胞總蛋白和RNA，用于后續(xù)實驗。

1.7 RT-PCR 法檢測FGF21 mRNA的表達

Trizol 法提取細胞中的RNA，取1 μg 的RNA 進行逆轉成cDNA 后進行擴增，以β-actin 為內參照基因，上游引物為5′-GAGACCTTCAACACCCC-3′，下游引物為5′- ATAGCTCTTCTCCAGGGAGG -3′。mFGF21上游引物為5′-ACCTGGAGATCAGGGAGGAT-3′，下游引物為5′-GCACAGGAACCTGGATGTCT-3′。

1.8 Western bolt法檢測FGF21蛋白的表達

按蛋白裂解液說明書抽提蛋白，BCA法測定總蛋白濃度，蛋白變性后行SDS-PAGE電泳，濕轉法到PVDF膜上，加入3% BSA封閉液，室溫下孵育2 h，加入FGF21一抗（1：500），4℃封閉過夜，棄一抗，Tris-HCl緩沖鹽溶液+吐溫（TBST）洗3遍。加入1：5000的二抗，室溫孵育2 h后，棄二抗，TBST洗3遍，增強化學熒光發(fā)光法顯影，曝光。

1.9 統(tǒng)計學方法

應用GraphPad 5.0統(tǒng)計軟件。計量資料用（x±s）表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 缺氧對HCT116腸癌細胞FGF21 mRNA表達的影響

0、50、100和200 μmol/L CoCl2作用于HCT116細胞24 h 后，F(xiàn)GF21 mRNA表達量分別為（0.99±0.24）μmol/L，（0.83±0.06）μmol/L，（0.45±0.07）μmol/L，（0.14±0.04）μmol/L，呈濃度梯度式下降，當CoCl2濃度增加到100 μmol/L以后，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見圖1A;200 μmol/L CoCl2作用于HCT116細胞0、12和24 h后，F(xiàn)GF21 mRNA相對表達量為（1.01±0.07）μmol/L，（0.44±0.16）μmol/L，（0.09±0.02）μmol/L，呈時間梯度式下降（P<0.05），見圖1B。故后續(xù)細胞采用200 μmol/L的CoCl2和24 h作為缺氧處理條件。

2.2 缺氧對HCT116腸癌細胞FGF21蛋白表達的影響

Western blot結果顯示，與對照組（灰度值為1.04±0.17）相比，CoCl2處理組FGF-21 蛋白表達水平顯著下降（灰度值為0.54±0.15，P<0.05），表明化學缺氧可以顯著降低HCT116腸癌細胞內FGF-21蛋白含量。

2.3 缺氧誘導因子對HCT116腸癌細胞FGF21 mRNA表達的影響

用兩種不同的缺氧誘導因子抑制劑2ME2和YC-1處理HCT116腸癌細胞，同時加入CoCl2處理 24 h。對照組、CoCl2組、2ME2+CoCl2組、YC-1CoCl2組FGF-21 mRNA相對表達量分別為（1.00±0.05）μmol/L，（0.14±0.01）μmol/L，（0.12±0.03）μmol/L，（0.12±0.03）μmol/L。但是這兩種抑制劑并沒有緩解CoCl2對FGF-21 mRNA表達的抑制作用，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）（圖3）。說明CoCl2對HCT116腸癌細胞中FGF-21表達的抑制作用并不依賴于缺氧誘導因子。

圖3 ? 缺氧誘導因子對HCT116腸癌細胞FGF21 mRNA表達的影響 *P<0.05

2.4 氧化應激對HCT116腸癌細胞FGF21表達的影響

為了研究CoCl2對HCT116腸癌細胞FGF-21的調節(jié)作用是否與氧化應激有關，抗氧化劑NAC與CoCl2同時處理HCT116腸癌細胞24 h。對照組、CoCl2組、NAC+CoCl2組mRNA相對表達量分別為（1.01±0.14）μmol/L，（0.45±0.09）μmol/L，（0.72±0.07）μmol/L。對照組、CoCl2組、NAC+CoCl2組灰度值分別為（1.00±0.02），（0.41±0.03），（0.58±0.04）。如圖4A、B所示，CoCl2對HCT116細胞FGF-21mRNA和蛋白表達的下調作用被NAC抑制，說明CoCl2對HCT116細胞FGF-21的調節(jié)作用依賴于氧化應激。

圖4 ? NAC對HCT116腸癌細胞FGF21表達的影響

（A：NAC與CoCl2同時處理24 h HCT116腸癌細胞FGF21 mRNA的表達情況;B：NAC與CoCl2同時處理24 h HCT116腸癌細胞FGF21蛋白的表達情況;C：FGF21與GAPDH灰度比值，*P<0.05）

3 討論

腫瘤最主要的特征是腫瘤細胞的生長失控，不斷增多的細胞導致耗氧量增加，從而形成腫瘤內缺氧微環(huán)境，這在機體實體瘤中的表現(xiàn)尤其明顯[6，7]。缺氧可通過多種機制促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展，包括誘發(fā)酸性內環(huán)境、觸發(fā)腫瘤微血管形成、誘導上皮間質轉化、重塑細胞外基質、促進腫瘤免疫逃避和腫瘤適應、維持腫瘤干細胞的存在及抑制衰老[8-10]。HIF-1是在缺氧條件下存在于哺乳動物和人體內的一種轉錄因子，它最先在缺氧誘導的細胞核抽提物中發(fā)現(xiàn)[11]。作為轉錄因子，HIF-1可調控多種與腫瘤相關的基因，這些基因表達的蛋白有利于腫瘤在缺氧條件下的能量代謝和氧氣輸送[11-13]。目前研究顯示腫瘤細胞生長過程中缺氧及糖脂代謝紊亂是重要的病理生理過程，但人們對缺氧導致腫瘤代謝紊亂的分子機制尚不完全清楚。

FGF21是FGFs的一個新成員，與以前發(fā)現(xiàn)的FGFs不同，它與糖脂代謝有著密切的關系，具有內分泌調節(jié)功能[14，15]。在肥胖嚙齒類動物中，F(xiàn)GF21能夠減輕其體重，增加胰島素敏感性以及調節(jié)脂蛋白水平[15]。本文前期研究發(fā)現(xiàn)CoCl2誘發(fā)急性化學缺氧可加重非酒精脂肪肝小鼠的肝臟損傷，并上調FGF21的表達[16]，但FGF21與腫瘤相關性研究甚少。本研究還發(fā)現(xiàn)脂肪肉瘤組織中FGF21蛋白較瘤旁組織中表達率明顯降低，隨訪結果顯示，F(xiàn)GF21蛋白高表達組患者較低表達組預后更好，不易發(fā)生復發(fā)[17]。在肝臟組織中，肝細胞特異性FGF21的過表達可以延緩化學物質誘導的肝癌形成，而不影響正常肝臟發(fā)育及損傷后的代償性反應[17]。過表達的FGF21可能是通過激活肝細胞上的FGF受體（FGFR4）來延緩二乙基亞硝胺誘導肝癌的進程[19]。在腫瘤細胞中，缺氧對FGF21的調控似乎與細胞類型有關。在鼠黑色素瘤細胞中，缺氧可以誘導FGF21的表達;但在腸道的腫瘤細胞中，缺氧卻可以抑制FGF21的主要轉錄因子PPAR-α的表達[20]?；瘜W缺氧對Caco-2細胞中FGF21的影響不依賴于HIF-α，而是依賴于氧化應激介導的機制[21]。這些研究均表明，缺氧導致腫瘤細胞的代謝紊亂可能與FGF21有關。本研究也發(fā)現(xiàn)缺氧降低HCT116腸癌細胞FGF21 mRNA和蛋白的表達量，且FGF21的調控作用與缺氧誘導因子無關，依賴于氧化應激反應。接下來將進一步研究FGF21對腫瘤細胞代謝的調控作用，闡明FGF21的生物學功能，為腫瘤防治和新藥開發(fā)提供新的靶點和理論基礎。

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（收稿日期：2019-03-04）