顧桂芳 丁月平

慢性阻塞性肺病（COPD）是一種進(jìn)行性疾病，其中慢性中性粒細(xì)胞炎癥的發(fā)生與肺實(shí)質(zhì)（肺氣腫）和小氣道疾病的破壞有關(guān)，導(dǎo)致氣流受限和肺功能下降[1-2]。吸入有害物質(zhì)如香煙煙霧等是COPD 發(fā)生的常見(jiàn)危險(xiǎn)因素，然而并不是所有的吸煙者都會(huì)患COPD，表明COPD 的發(fā)生具有遺傳性[3]。miRNAs 是由大約19-25 個(gè)核苷酸組成的小型非編碼RNA，通過(guò)增加mRNA 的降解或抑制特定mRNA 的蛋白翻譯而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后基因的抑制。它們參與各種生物過(guò)程，其表達(dá)的改變可能導(dǎo)致病理狀況，如肺疾病[4]。本研究的主要目的是分析miR-146a 基因rs2910164位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與血漿中miR-146a-5p 表達(dá)水平相關(guān)性對(duì)COPD 發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的影響，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2014 年5 月—2017 年10 月期間浙江省紹興市上虞人民醫(yī)院和浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科收治的145 例COPD 患者作為研究組。從浙江省紹興市上虞人民醫(yī)院和浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院招募145 名健康體檢者作為對(duì)照組。本研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)，與所有受試者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 納入、排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)慢性阻塞性肺疾病學(xué)組制定的COPD 診治指南（2007 年修訂版）中COPD 診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；（2）患者相互之間無(wú)血緣關(guān)系；（3）第一秒鐘用力呼氣量占用力肺活量比值（FEV1/FVC）＜70%，并且吸入支氣管舒張劑后FEV1/FVC 仍＜70%。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）患有支氣管擴(kuò)張、結(jié)節(jié)病、肺間質(zhì)纖維化、肺結(jié)核、支氣管哮喘、糖尿病、心臟病等疾?。唬?）腫瘤患者。

1.3 基因型檢測(cè) 所有受試者均取5mL 靜脈血，分離血漿后血細(xì)胞用于基因組DNA 提取，血漿保存于-80℃冰箱。血細(xì)胞中提取基因組DNA 使用的試劑盒來(lái)自天根生化科技（北京）有限公司，批號(hào)2014040301。設(shè)計(jì)miR-146a 基因rs2910164 位點(diǎn)PCR 擴(kuò)增正向引物序列為5’-GAGGGGTCTTTGCACCATCT-3’；反向序列為5’-CAAGCCCACGATGACAGAGA-3’。以提取的受試者基因組DNA 作為模板，使用生工生物工程（上海）股份有限公司生成的PCR 試劑盒進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，批號(hào)2014110538。PCR擴(kuò)增后將PCR 產(chǎn)物取10μL 進(jìn)行商業(yè)化測(cè)序，供應(yīng)商為生工生物工程（上海）股份有限公司，測(cè)序結(jié)果使用Chromas 軟件進(jìn)行分析，本研究中miR-146a 基因rs2910164 位點(diǎn)不同基因型測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 rs2910164 位點(diǎn)不同基因型測(cè)序結(jié)果

1.4 血漿miR-146a-5p 表達(dá)水平檢測(cè) 進(jìn)行RNA提取和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)血漿miR-146a-5p 表達(dá)水平。使用Tri Reagent（Sigma-Aldrich Co.，St.Louis，USA）根據(jù)制造商的說(shuō)明提取總RNA，使用RevertAid TM 逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒（K1622，批號(hào)2014091302，F(xiàn)ermentas，MA，USA）從總RNA 合成cDNA。使用特異性引物[6]和Maxima TM SYBR Green qPCR Master Mix（K0222，批 號(hào)20131205043，F(xiàn)ermentas）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，U6 用作miR-146a-5p 表達(dá)正?；膬?nèi)部對(duì)照，檢測(cè)miR-146a-5p 相對(duì)U6 的表達(dá)水平。

1.5 血漿IL-8 水平檢測(cè) 使用人IL-8 ELISA 試劑盒（Abcam，貨號(hào)ab46032，批號(hào)2014061304）檢測(cè)血漿中IL-8 細(xì)胞因子檢測(cè)水平。所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，每個(gè)樣本做3 個(gè)復(fù)孔。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0 軟件。計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，使用χ2檢驗(yàn)分析組間差異。計(jì)量資料的表示方法為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s），使用t 檢驗(yàn)和單因素方差分析組間差異。使用非條件Logistic 回歸模型估計(jì)比值比（OR）和95%置信區(qū)間（CI）。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較 研究組中男86 例，女59例；年齡38～75 歲，平均（56.45±10.85）歲；平均體質(zhì)指數(shù)（BMI）（23.54±2.34）kg/m2。對(duì)照組中男88 例，女57 例；年齡40～77 歲，平均（58.31±12.24）歲；平均BMI（23.61±2.54）kg/m2。研究組與對(duì)照組年齡、性別、BMI 等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

2.2 兩組miR-146a 基因rs2910164 位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與COPD 風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性 研究組和對(duì)照組miR-146a 基因rs2910164 位點(diǎn)基因型頻率之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=15.52，P＜0.01）。以野生型（CC）為標(biāo)準(zhǔn)，雜合子（CG）和純合子（GG）均是COPD 的危險(xiǎn)因素（OR=2.40，95%CI=1.42～4.07；OR=3.27，95%CI=1.27～8.57，P=0.01），顯性模型（CG+GG）下COPD風(fēng)險(xiǎn)較高（OR=2.53，95%CI=1.54～4.19，P＜0.001）；隱性模型下患COPD 的風(fēng)險(xiǎn)較低（P=0.07）。以miR-146a 基因rs2910164 位點(diǎn)C 等位基因?yàn)閰⒖?，突變型等位基因G 是COPD 的高風(fēng)險(xiǎn)因素（OR=1.99，95%CI=1.37～2.89，P＜0.001），見(jiàn)表1。

2.3 兩組血漿miR-146a-5p、IL-8 水平 研究組患者血漿miR-146a-5p 水平顯著低于對(duì)照組，血漿IL-8 細(xì)胞因子水平顯著高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=14.74，P＜0.01；t=23.67，P＜0.001），見(jiàn)表2。

2.4 不同基因型受試者血漿miR-146a-5p、IL-8 水平比較 野生型（CC）受試者血漿miR-146a-5p 水平顯著高于雜合子（CG），純合子（GG）最低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=16.75，P＜0.01），而野生型（CC）受試者血漿IL-8 細(xì)胞因子水平顯著低于雜合子（CG），純合子（GG）最高，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=19.37，P＜0.001），見(jiàn)表3。

表1 兩組miR-146a 基因rs2910164 位點(diǎn)基因型和等位基因頻率比較（±s）[例（%）]

表1 兩組miR-146a 基因rs2910164 位點(diǎn)基因型和等位基因頻率比較（±s）[例（%）]

注：OR：比值比；CI：置信區(qū)間：CC：野生型；CG：雜合子；GG：純合子；研究組：慢性阻塞性肺疾病患者；對(duì)照組：健康體檢者

表2 兩組血漿miR-146a-5p、IL-8 水平比較（±s）

表2 兩組血漿miR-146a-5p、IL-8 水平比較（±s）

注：REL：相對(duì)表達(dá)水平；IL-8：白介素-8；研究組：慢性阻塞性肺疾病患者；對(duì)照組：健康體檢者

表3 不同基因型受試者血漿miR-146a-5p、IL-8 水平比較（±s）

表3 不同基因型受試者血漿miR-146a-5p、IL-8 水平比較（±s）

注：REL：相對(duì)表達(dá)水平；IL-8：白介素-8；CC：野生型；CG：雜合子；GG：純合子；研究組：慢性阻塞性肺疾病患者；對(duì)照組：健康體檢者

2.5 血漿miR-146a-5p 水平與IL-8 細(xì)胞因子相關(guān)性 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，血漿miR-146a-5p 表達(dá)水平與IL-8 細(xì)胞因子水平之間呈負(fù)相關(guān)性（r=-0.63，P＜0.001），見(jiàn)圖2。

3 討論

圖2 血漿miR-146a-5p 水平與IL-8 細(xì)胞因子相關(guān)性（n=145）注：IL-8：白介素-8

miRNA 是一類(lèi)豐富的19～25 個(gè)核苷酸長(zhǎng)左右的非蛋白質(zhì)編碼RNA，通過(guò)與靶基因信使RNA（mRNA）的3'非翻譯區(qū)（UTR）結(jié)合調(diào)節(jié)大約三分之一的蛋白質(zhì)的編碼基因，導(dǎo)致翻譯抑制或mRNA 降解[7-8]。據(jù)報(bào)道，miR-146a 前體中的多態(tài)性（rs2910164）與多種惡性腫瘤有關(guān)[9-10]。rs2910164 位點(diǎn)C 等位基因位于前miR-146a 過(guò)客鏈上第一個(gè)核苷酸約60 個(gè)堿基的位置，計(jì)算機(jī)會(huì)預(yù)測(cè)導(dǎo)致成熟發(fā)夾內(nèi)的錯(cuò)配。本研究結(jié)果顯示，miR-146a 基因rs2910164 位點(diǎn)野生型（CC）受試者血漿miR-146a-5p 水平顯著高于突變型，這種差異至少部分歸因于研究人群的不同遺傳背景[11]。有學(xué)者研究miR-146a-5p 在COPD 氣道上皮和肺成纖維細(xì)胞之間異常IL-1α 信號(hào)傳導(dǎo)中的作用，結(jié)果顯示原代人肺成纖維細(xì)胞與氣道上皮細(xì)胞共培養(yǎng)顯著增加miR-146a-5p 的表達(dá)，其完全依賴(lài)于上皮衍生的IL-1α[12]。miR-146a-5p 表達(dá)具有抗炎作用，通過(guò)下調(diào)IL-1 途徑下游的白細(xì)胞介素-1 受體相關(guān)激酶1（IRAK-1）的表達(dá)，并隨后減少肺成纖維細(xì)胞的IL-8 釋放。本研究結(jié)果顯示，COPD 患者血漿miR-146a-5p 水平顯著低于對(duì)照組，且血漿IL-8 水平顯著高于對(duì)照組，另外分析血漿miR-146a-5p 水平與IL-8 細(xì)胞因子水平結(jié)果顯示，血漿miR-146a-5p 表達(dá)水平與IL-8 細(xì)胞因子水平之間呈負(fù)相關(guān)性，與Osei 等[11]研究結(jié)果一致。從本研究結(jié)果來(lái)看，攜帶rs2910164 位點(diǎn)G 等位基因的人群具有較高的COPD 風(fēng)險(xiǎn)，分析原因筆者認(rèn)為miR-146a-5p 的誘導(dǎo)在COPD 成纖維細(xì)胞中顯著減少，通過(guò)負(fù)反饋調(diào)節(jié)導(dǎo)致IL-8 的釋放增加，而IL-8 在COPD 氣道炎癥的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中具有重要作用[12]。

本研究仍有不足之處，首先樣本量較小，沒(méi)有就不同COPD 嚴(yán)重程度與miR-146a 基因rs2910164位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性的相關(guān)性進(jìn)行分析；其次，未能結(jié)合環(huán)境因素的影響進(jìn)行分析，忽略了環(huán)境因素的影響。