葉 武 黃勍棟 唐婷玉 葉 芃 杜堅(jiān)宗

肺癌是危害人類(lèi)生命和健康的主要惡性腫瘤之一。蓽茇屬于胡椒科植物蓽茇的干燥未成熟或成熟的果穗[1]。蓽茇酰胺是一種中藥單體，存在于蓽茇根，以及瘤突胡椒和長(zhǎng)柄胡椒根[2]。近年研究發(fā)現(xiàn)，蓽茇酰胺具有抗腫瘤、抗炎、抗血小板凝集、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗真菌、抗血吸蟲(chóng)、抗焦慮以及抗抑郁等多種藥理作用[3]。本研究旨在探討蓽茇酰胺對(duì)肺癌的抗腫瘤作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥 品 蓽茇酰胺（批號(hào)S7551）購(gòu)于美國(guó)Selleck chemicals 公司；2'、7'-二氯-熒光素二乙酸酯（DCFH-DA，批號(hào)S0033）購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)研究所；N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC，批號(hào)S0077）購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)研究所；3-甲基腺嘌呤（批號(hào)S9281）購(gòu)于美國(guó)Selleck chemicals 公司。

1.2 試劑及儀器 CCK-8 溶液（批號(hào)C008-3）購(gòu)于上海七海復(fù)泰生物科技有限公司；α-tubulin（批號(hào)T5168）購(gòu)于美國(guó)Sigma 公司；微管相關(guān)蛋白輕鏈3B抗體（LC3B，批號(hào)nb100）購(gòu)于美國(guó)Novus Biologicals公司；ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（批號(hào)P0018AS）購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)研究所；BD FACS Calibur 流式細(xì)胞儀購(gòu)于美國(guó)BD 公司；超微量分光光度計(jì)購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司，凝膠電泳儀購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad 公司；化學(xué)發(fā)光熒光影像分析儀購(gòu)于日本富士膠片公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肺腺癌A549 細(xì)胞株（上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)提供）接種于含10%小牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基，置于5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 天更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞密度為80%～90%時(shí)，用胰酶消化，進(jìn)行細(xì)胞傳代。待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 細(xì)胞內(nèi)活性氧水平檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、蓽茇酰胺組和蓽茇酰胺+NAC 組。對(duì)照組采用生理鹽水處理A549 細(xì)胞48h，蓽茇酰胺組采用3μM 蓽茇酰胺處理A549 細(xì)胞48h，蓽茇酰胺+NAC 組采用3μM蓽茇酰胺和10mM NAC 處理A549 細(xì)胞48h。蓽茇酰胺或NAC 處理A549 細(xì)胞后，將細(xì)胞與10μM DCFH-DA 在37℃下孵育30min。無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞。使用BD FACS Calibur 流式細(xì)胞儀測(cè)定熒光強(qiáng)度，該值代表細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平。

2.3 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活力 實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、蓽茇酰胺組，蓽茇酰胺+NAC 組和3-甲基腺嘌呤+蓽茇酰胺組。前三組處理同2.2，3-甲基腺嘌呤+蓽茇酰胺組采用3μM 蓽茇酰胺和3mM 3-甲基腺嘌呤處理A549 細(xì)胞48h。將A549 細(xì)胞（3000 個(gè)/孔）接種于96孔板中，置入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h 后，加入蓽茇酰胺、NAC 或自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤，采用超微量分光光度計(jì)測(cè)定在450nm 處各孔的吸光度（OD 值）。

2.4 蛋白質(zhì)印跡 使用細(xì)胞裂解液裂解A549 細(xì)胞，BCA 法測(cè)定蛋白濃度。取30～60μg 總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE 電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，用含5%脫脂牛奶的TBST 封閉2h，加入α-tubulin 或LC3B，4℃孵育過(guò)夜。TBST 漂洗3 次，將膜置于二抗中，室溫下孵育1.5h，ECL 顯影，置入化學(xué)發(fā)光熒光影像分析儀曝光，采用Image J 軟件分析目的蛋白的相對(duì)灰度，計(jì)算公式為：目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)量資料的兩組間均數(shù)比較采用Student’s t 檢驗(yàn)，多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組A549 細(xì)胞ROS 水平比較 蓽茇酰胺組A549 細(xì)胞ROS 水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），蓽茇酰胺+NAC 組細(xì)胞ROS 水平低于蓽茇酰胺組（P＜0.05），與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1、插頁(yè)圖1。

圖1 各組A549 細(xì)胞ROS 水平比較

表1 各組A549 細(xì)胞ROS 水平比較（±s）

表1 各組A549 細(xì)胞ROS 水平比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與蓽茇酰胺組比較，△P＜0.05；ROS：活性氧；NAC：N-乙酰-L-半胱氨酸

3.2 各組細(xì)胞活力比較 蓽茇酰胺組細(xì)胞活力顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。蓽茇酰胺+NAC 組與對(duì)照組細(xì)胞活力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。蓽茇酰胺與NAC 合用后，細(xì)胞活力恢復(fù)至用藥前水平，與蓽茇酰胺組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組細(xì)胞活力比較（%，±s）

表2 各組細(xì)胞活力比較（%，±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與蓽茇酰胺組比較，△P＜0.05；NAC：N-乙酰-L-半胱氨酸

3.3 各組A549 細(xì)胞LC3B-II 表達(dá)水平比較 蓽茇酰胺組細(xì)胞LC3B-II 表達(dá)顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），蓽茇酰胺與NAC 合用后，LC3B-II 表達(dá)下降至用藥前水平。見(jiàn)插頁(yè)圖2。

圖2 各組A549 細(xì)胞LC3B-Ⅱ表達(dá)水平

3.4 3-甲基腺嘌呤對(duì)蓽茇酰胺抗腫瘤作用的影響3-甲基腺嘌呤+蓽茇酰胺組LC3B-II 表達(dá)顯著低于對(duì)照組和蓽茇酰胺組（P 均＜0.05），3-甲基腺嘌呤+蓽茇酰胺組A549 細(xì)胞活力顯著低于蓽茇酰胺組（P＜0.05）。見(jiàn)表3、插頁(yè)圖3。

表3 3-甲基腺嘌呤對(duì)蓽茇酰胺抗腫瘤作用的影響（%，±s）

表3 3-甲基腺嘌呤對(duì)蓽茇酰胺抗腫瘤作用的影響（%，±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與蓽茇酰胺組比較，△P＜0.05

4 討論

蓽茇酰胺屬生物堿類(lèi)化合物，具有多種藥理學(xué)作用。研究表明，蓽茇酰胺選擇性地抑制腫瘤細(xì)胞而不影響正常組織[4]。Raj 等[5]研究發(fā)現(xiàn)，蓽茇酰胺增加腫瘤細(xì)胞的ROS 水平，但是其對(duì)正常細(xì)胞的ROS 水平無(wú)明顯影響。正常細(xì)胞基礎(chǔ)代謝水平較低，很少依賴(lài)ROS 應(yīng)激反應(yīng)途徑。腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生明顯的氧化應(yīng)激反應(yīng)，為適應(yīng)氧化應(yīng)激反應(yīng)，腫瘤細(xì)胞啟動(dòng)抗氧化防御系統(tǒng)，較大程度上依賴(lài)ROS 應(yīng)激反應(yīng)途徑。因此，蓽茇酰胺選擇性地增加腫瘤細(xì)胞ROS 含量，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖和遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6]。本研究顯示，蓽茇酰胺提高肺癌細(xì)胞的ROS 水平，抑制細(xì)胞增殖，NAC 與蓽茇酰胺合用能逆轉(zhuǎn)蓽茇酰胺介導(dǎo)的ROS 含量升高和細(xì)胞增殖抑制作用。這提示蓽茇酰胺可能通過(guò)調(diào)節(jié)ROS 依賴(lài)途徑抑制肺癌細(xì)胞增殖。

自噬是存在于真核細(xì)胞內(nèi)的一種依賴(lài)溶酶體途徑的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器降解過(guò)程。與肺癌、肺動(dòng)脈高壓、慢性阻塞性肺病、急性肺損傷和呼吸道感染等多種肺部疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[5，7]。LC3B 在自噬過(guò)程中扮演重要角色，常被作為監(jiān)測(cè)巨自噬發(fā)生的特異性標(biāo)志蛋白[8-9]。本研究顯示，蓽茇酰胺處理肺癌細(xì)胞，LC3B-II 表達(dá)顯著增加，與NAC 合用逆轉(zhuǎn)蓽茇酰胺介導(dǎo)的LC3B-II 升高。這提示蓽茇酰胺參與調(diào)節(jié)ROS 依賴(lài)的細(xì)胞自噬。

肺癌細(xì)胞自噬水平升高，并依賴(lài)自噬來(lái)維持細(xì)胞生長(zhǎng)和存活所需的線(xiàn)粒體功能和細(xì)胞代謝[10-11]。本研究將自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤處理肺癌細(xì)胞，LC3B-II 表達(dá)顯著降低。3-甲基腺嘌呤和蓽茇酰胺聯(lián)用明顯增強(qiáng)蓽茇酰胺的抗腫瘤作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)蓽茇酰胺通過(guò)調(diào)節(jié)ROS依賴(lài)途徑，抑制肺癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞自噬。自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤降低肺癌細(xì)胞自噬，增強(qiáng)蓽茇酰胺的抗腫瘤作用。