洪鴻翔，陳勁宇，鄧宏健，孫郁雨，袁 錕，王祥宇，崔志明

目前，老齡化已成為世界范圍公認(rèn)的社會(huì)問(wèn)題，衰老導(dǎo)致人體骨量下降、骨質(zhì)疏松、關(guān)節(jié)炎癥、關(guān)節(jié)退變，并由此引起重要關(guān)節(jié)部位疾病、甚至功能的喪失。骨骼問(wèn)題引起的疾病是最普遍存在的人類健康問(wèn)題，而生物醫(yī)用金屬材料成為解決這些問(wèn)題的重要方法之一。二氧化鈦（TiO2）是一種具有耐化學(xué)腐蝕性、光化學(xué)催化特性的無(wú)機(jī)化工材料，被廣泛用于醫(yī)藥、日化、化妝品、食品中。研究表明[1]TiO2能夠通過(guò)呼吸、消化等途徑進(jìn)入體內(nèi)，并且在特定部位富集，從而對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒性。文獻(xiàn)報(bào)道[2]，TiO2在肝中沉淀最多，隨著TiO2濃度的升高，肝功能受到明顯損害，并導(dǎo)致抗氧化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)衰竭、全身出現(xiàn)炎癥反應(yīng)等一系列綜合征。PD-1/PD-L1信號(hào)通路是動(dòng)物體中較為保守的信號(hào)通路，對(duì)機(jī)體免疫調(diào)控起著重要的作用[3]。本研究從PD-1/PD-L1信號(hào)通路入手，探討TiO2對(duì)小鼠肝細(xì)胞的毒性作用，從而為了解TiO2毒性及其防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑與設(shè)備 清潔級(jí)ICR小鼠由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SYXK(蘇)20020022；TiO2購(gòu)自上海醫(yī)藥集團(tuán)；兔抗小鼠 PD-1、 兔抗小鼠 PD-L1、Rat anti-mouse-CD19-FITC、Rat anti-mouse-CD4-FITC、Rat anti-mouse-CD8-PE、兔抗GAPDH及山羊抗兔IgG購(gòu)自美國(guó)abcam公司；IL-6、IL-10、TNF-α、CRP 試劑盒購(gòu)自上海西唐生物科技有限公司；生化自動(dòng)分析儀（日本日立，型號(hào)：7170），高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)eppendorf,型號(hào)：5180），電泳槽（北京六一儀器廠，型號(hào)：DYY-Ⅲ），凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó) Bio-Rad，型號(hào)：GEL DOC2000）。

1.2 模型構(gòu)建和分組處理 實(shí)驗(yàn)前小鼠適應(yīng)性飼喂5 d，然后隨機(jī)分為4組，每組30只，分別為空白組、TiO2（低、中、高劑量）組，TiO2組每天分別尾部靜脈注射10、50、150 mg/kg的TiO2， 空白組注射10 ml/kg生理鹽水，連續(xù)注射2 w。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 體重及肝臟系數(shù) 注射給藥2 w后，稱量實(shí)驗(yàn)小鼠體重后，麻醉、處死，取肝臟，吸水紙吸干水分，準(zhǔn)確稱量肝臟重量，肝臟系數(shù)=肝臟濕重（mg）/體重（g）。

1.3.2 肝功能 上述小鼠處死后，采用摘眼球取血法采集血液，25000 r/min離心10 min分離血清，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、亮氨酸氨酸肽酶（ALP）、乳酸脫氫酶（LDH）水平。

1.3.3 血清炎癥因子含量 采用上述血清標(biāo)本，檢測(cè)白細(xì)胞介素 -6（IL-6）、IL-10、腫瘤壞死因子（TNF-α）、C-反應(yīng)蛋白（CRP）水平。

1.3.4 肝組織抗氧化酶活性 小鼠處死后，取新鮮肝組織研磨，加入1%聚乙稀吡咯烷酮，5000 r/min離心30 min，取上清液，測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)，過(guò)氧化氫酶(CAT)，抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APx)，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSHPx)活性。

1.3.5 檢測(cè)PD-1、PD-L1蛋白表達(dá)水平 稱取200 mg肝組織，加入裂解液，超聲裂解30 s，12000 r/min、4℃離心10 min，收集上清，BCA檢測(cè)蛋白濃度；待測(cè)樣品與Loading buffer混合，加入至制備好的SDS-PAGE 凝膠上樣孔中，25 μl/孔，4 ℃轉(zhuǎn)膜 1.5 h，采用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h，分別加入一抗兔抗小鼠PD-1或兔抗小鼠PD-L1，4℃過(guò)夜；TBST洗膜后，加入辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的羊抗兔IgG，37℃孕育2 h，ECL顯影，以GAPDH作為內(nèi)參，采用蛋白免疫印跡法檢測(cè)PD-1和PD-L1蛋白水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用方差分析和t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TiO2對(duì)小鼠肝臟系數(shù)的影響 空白組、低劑量TiO2組、中劑量TiO2組和高劑量TiO2組的肝臟系數(shù)分別為（39.87±4.32）、（51.12±4.78）、（63.81±5.04）和（72.95±5.29）mg/kg，各 TiO2組肝系數(shù)均顯著高于空白組（P＜0.05），且隨著劑量增加，肝臟系數(shù)逐漸增大（P＜ 0.05）。

2.2 TiO2對(duì)小鼠肝功能的影響 各TiO2組血清ALT、AST、ALP、LDH 水平均明顯高于空白組（P＜0.05）， 且劑量越大，ALT、AST、ALP、LDH 水平越高（P＜ 0.05，表 1）。

2.3 TiO2對(duì)肝組織抗氧化酶活性的影響 各TiO2組肝組織抗氧化酶活性均明顯低于空白組（P＜0.05），且劑量越大，肝組織抗氧化酶活性越低（P＜0.05，表 2）。

2.4 TiO2對(duì)小鼠血清炎癥因子含量的影響 各TiO2組血清炎癥因子含量均明顯高于空白組（P＜0.05），且劑量越大，炎癥因子含量越高（P＜0.05，表3）。

2.5 TiO2對(duì)小鼠肝組織PD-1、PD-L1蛋白表達(dá)的影響 與空白組比較，各TiO2組肝組織PD-1、PD-L1蛋白表達(dá)水平明顯升高，且呈劑量效應(yīng)依賴關(guān)系（P＜0.05，圖 1）。

3 討論

隨著TiO2的廣泛應(yīng)用，其安全性越來(lái)越受重視。TiO2可以通過(guò)口腔、鼻腔、皮膚等途徑進(jìn)入機(jī)體，通過(guò)血液循環(huán)、淋巴轉(zhuǎn)運(yùn)在機(jī)體的各器官中沉積，如肝腎等，并對(duì)器官產(chǎn)生毒性作用。研究表明[4]，靜脈注射TiO21 w后，肝臟明顯腫大，肝組織細(xì)胞損傷變性，AST和ALT活性上升。本研究采用TiO2構(gòu)建小鼠肝損傷模型，結(jié)果也顯示，TiO2能夠明顯提高肝臟系數(shù)，ALT、AST、ALP、LDH 活性明顯升高，且劑量越大，ALT、AST、ALP、LDH 水平越高。

表1 各實(shí)驗(yàn)小鼠肝功能比較（n=30）

正常情況下，機(jī)體內(nèi)ROS產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡，而TiO2會(huì)打破平衡，造成ROS大量積累，進(jìn)而導(dǎo)致過(guò)氧化損傷[5]。研究表明[6]，TiO2在肝細(xì)胞中的積累導(dǎo)致ROS和Cyp1a1的表達(dá)水平增加，并抑制CAT等多種過(guò)氧化物酶的活性，進(jìn)而導(dǎo)致肝臟的氧化損傷。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各TiO2組肝組織抗氧化酶活性均明顯低于空白組（P＜0.05），且劑量越大，肝組織抗氧化酶活性越低，提示TiO2能夠使肝臟抗氧化系統(tǒng)遭受破壞，其毒性效果與劑量呈正相關(guān)。

表2 各組肝組織抗氧化酶活性比較（n=30）

表3 各組血清炎癥因子含量比較（n=30）

圖1 各組PD-1、PD-L1肝組織PD-1、PD-L1蛋白表達(dá)水平比較

文獻(xiàn)報(bào)道[7]，肝內(nèi)炎癥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致肝功能障礙，同時(shí)還會(huì)加重肝臟重構(gòu)。既往研究結(jié)果顯示[8-9]，TiO2能顯著激活 MIF、TNF-a、IL-6、IL-1β、CRP、IL-4 和 IL-10等細(xì)胞炎癥因子 mRNA和蛋白表達(dá)水平。本研究結(jié)果也顯示，TiO2會(huì)引起 TNF-α、IL-6、IL-10、CRP水平升高，且劑量越大，炎癥因子含量越高，證實(shí)TiO2會(huì)引起小鼠機(jī)體炎癥反應(yīng)。

文獻(xiàn)報(bào)道[10]，PD-1/PD-L1信號(hào)通路在T細(xì)胞活化、增殖、免疫細(xì)胞和炎癥因子產(chǎn)生的過(guò)程中起重要的作用，該信號(hào)通路激活會(huì)抑制免疫系統(tǒng)功能，促進(jìn)免疫耐受。經(jīng)典的PD-1/PD-L1信號(hào)通路活化表現(xiàn)為PD-1在細(xì)胞質(zhì)中增多，進(jìn)而調(diào)節(jié)Th1細(xì)胞Th2的反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，與空白組比較，各TiO2組肝組織PD-1、PD-L1蛋白表達(dá)水平明顯升高，且呈劑量效應(yīng)依賴關(guān)系，提示TiO2對(duì)肝細(xì)胞的毒性作用可能是通過(guò)調(diào)節(jié)PD-1/PD-L1信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)。

綜上所述，TiO2可能通過(guò)PD-1/PD-L通路對(duì)小鼠肝細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，且其毒性具有劑量效應(yīng)關(guān)系。