馮輝 范亞磊 張金鳳 朱紅利 魏利輝, , *

谷氧還蛋白(AbGrx-1)對水稻干尖線蟲在氧化脅迫下的保護作用

馮輝2范亞磊2張金鳳2朱紅利1魏利輝1, 2, *

(1南京農(nóng)業(yè)大學 植物保護學院，南京 210095；2江蘇省農(nóng)業(yè)科學院 植物保護研究所，南京 210014；*通訊聯(lián)系人，E-mail：weilihui@jaas.ac.cn)

谷氧還蛋白(glutaredoxin, Grx)作為一種抗氧化酶，在通過清除多余活性氧來維持生物細胞氧化還原平衡、降低細胞膜損傷過程中發(fā)揮重要作用。水稻干尖線蟲()能在高溫、滲透及氧化脅迫等多種逆境壓力中存活。本研究旨在探究Grx在水稻干尖線蟲抗氧化脅迫中的作用。通過cDNA末端快速擴增技術(shù)(rapid amplification of cDNA ends, RACE)，獲得了一個水稻干尖線蟲谷氧還蛋白基因，進行了序列比對和遺傳進化分析；通過qRT-PCR檢測了在線蟲響應(yīng)氧化和溫度脅迫中的表達差異，通過原核表達獲得了AbGrx-1的重組蛋白，并分析了AbGrx-1蛋白浸泡對水稻干尖線蟲在氧化和高溫脅迫下存活的影響。基因全長包括90 bp的5＇非翻譯區(qū)(UTR)、321 bp的編碼區(qū)和97 bp的3＇UTR，開發(fā)閱讀框(橫跨91至411位)編碼106個氨基酸。AbGrx-1蛋白的第24至27位點具有谷氧還蛋白催化殘基(CPYC)，分別在第69至第72和第83至第86位點存在保守的谷胱甘肽結(jié)合位點RSVP和GGDD，歸為Ⅰ類谷氧還蛋白。遺傳進化樹顯示AbGrx-1與燕麥真滑刃線蟲()Grx親緣關(guān)系最近，位于同一進化分支。在H2O2處理和12℃下時顯著上調(diào)表達，但在0℃, 4℃, 37℃和45℃極端溫度中下調(diào)表達。高濃度H2O2和高溫導致水稻干尖線蟲死亡率增加，AbGrx-1重組蛋白能顯著提高暴露于高濃度H2O2中線蟲的存活率，但不影響高溫下線蟲的存活率。AbGrx-1參與調(diào)控水稻干尖線蟲的抗氧化免疫反應(yīng)，在抵抗氧化損傷、維持線蟲生存方面具有重要功能。

水稻干尖線蟲；谷氧還蛋白；基因克?。恢亟M蛋白；抗氧化

活性氧(ROS)是生物體在呼吸、代謝時因氧分子的不完全還原而產(chǎn)生的，在需氧生物發(fā)育過程中十分重要。除此之外，生物體還會受到外界氧化脅迫壓力導致細胞內(nèi)ROS水平升高。ROS的過度積累會損傷生物大分子DNA、蛋白質(zhì)和脂類[1]。為了避免氧化損傷，生物體利用酶和非酶抗氧化系統(tǒng)調(diào)節(jié)自身氧化平衡。谷氧還蛋白(Grx)是維持胞間氧化平衡的關(guān)鍵酶，利用谷胱甘肽的還原能力維持和調(diào)控細胞氧化還原狀態(tài)和氧化還原信號途徑，在胞內(nèi)ROS清除、蛋白和脂類氧化損傷修復等抗氧化過程中發(fā)揮重要功能[2, 3]。

Grx是熱穩(wěn)定和小分子量(10~16 kD)蛋白，具有3個活性結(jié)構(gòu)域，即二硫鍵活性中心、GSH結(jié)合位點和一個疏水性表面區(qū)域。Grx 活性中心的氨基酸序列為-Cys-Pro-Tyr-Cys-，其中，半胱氨酸(Cys)為催化基團。根據(jù)序列特點，Grx可分為六類(Ⅰ-Ⅵ)，其中，二硫基(Ⅰ類)和單硫基(Ⅰ或Ⅱ類)在所有生物中均存在，Ⅲ類在高等植物中存在，Ⅳ類在光合作用的真核生物中存在，Ⅴ類存在于藍藻細菌和變形菌中，Ⅵ類存在于藍藻細菌中[1]。

目前僅有少數(shù)幾個種類線蟲的基因被克隆和研究，這些在維持線蟲細胞活性氧穩(wěn)態(tài)、降低細胞膜損傷發(fā)揮重要作用。模式生物秀麗隱桿線蟲()谷氧還蛋白GLRX-21能阻止硒誘導的氧化脅迫對線蟲的損害[4]。動物寄生線蟲克氏錐蟲()谷氧還蛋白TcGrx參與二硫谷胱甘肽還原反應(yīng)以及靶標蛋白的去谷胱甘肽化[5]。草莓芽線蟲()的谷氧還蛋白AF-GLX-1受脫水干燥和滲透壓脅迫誘導表達，并參與調(diào)控線蟲在逆境下越冬和存活[6]。

水稻干尖線蟲()是水稻上的遷移性寄生線蟲，在進入水稻穎花后迅速繁殖，在25℃最適溫度下10 d就可繁殖一代，并伴隨著水稻的成熟逐漸進入低濕休眠狀態(tài)[7]。基于這種特性，水稻干尖線蟲具有忍受脫水干燥的能力，在干燥種子中能進入休眠狀態(tài)，兩三年內(nèi)仍保持很強的活力。水稻干尖線蟲還有抵抗溫度逆境的能力。Tenent等[8]發(fā)現(xiàn)水稻干尖線蟲在貯存于?18℃的稻種中可存活30個月；同時，由于水稻干尖線蟲侵染水稻地上組織，在水稻生長季節(jié)的大田環(huán)境中，常常暴露于高溫環(huán)境中，因此水稻干尖線蟲也具有極強的耐高溫能力。此外，之前的一些研究利用氧化劑(H2O2)對水稻干尖線蟲進行表面消毒而不影響線蟲的運動和侵染，暗示水稻干尖線蟲具有強大的抵抗氧化脅迫能力。目前參與水稻干尖線蟲的抗逆反應(yīng)多個基因被克隆，包括鈣網(wǎng)膜蛋白[9]、熱激蛋白HSP90[10]、海藻糖酶[11]和胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白基因等[12]。這些基因在水稻干尖線蟲應(yīng)對溫度脅迫、滲透脅迫、氧化脅迫以及取食等過程中發(fā)揮作用，但有關(guān)Grx的功能仍未見報道。

本研究克隆了一個水稻干尖線蟲抗谷氧還蛋白基因，并對其在線蟲響應(yīng)氧化和溫度脅迫過程中的表達情況進行了監(jiān)測，同時對進行了原核表達，分析了AbGrx-1重組蛋白對氧化脅迫和高溫脅迫下線蟲存活的影響，以期闡明水稻干尖線蟲的逆境適應(yīng)機理，為防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 線蟲準備

線蟲最初分離自水稻病穗，后在長滿灰葡萄孢菌 ()的平板上培養(yǎng)擴繁。將在平板上培養(yǎng)20 d左右的線蟲用無菌水洗滌下來，用35%蔗糖溶液進行收集純化，并用消毒液(含100 μg/mL 兩性霉素B、100 μg/mL 硫酸鏈霉素和100 μg/mL氨芐青霉素)洗滌蟲體3次，最后用ddH2O洗滌保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 RNA提取和cDNA合成

收集50 μL 活性良好的線蟲在液氮中速凍30s，然后用一次性研磨棒迅速研磨成勻漿，采用TRIzol試劑(Invitrogen，美國)進行RNA提取。RNA質(zhì)量和產(chǎn)量通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop 2000分光光度計(OD260/280)進行評估。

cDNA合成按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(HiscriptII 1stStrand cDNA Synthesis Kit, 南京)說明書進行：將含有1 μL RNA(1 μg/μL)，1 μL Oligo dT23引物(10 μmol/L)和6μL ddH2O的無核酸酶的PCR管，于65℃下孵育5 min，立即冰上放置2 min，然后向PCR管中加入10 μL 2×RT Mix和2 μL 反轉(zhuǎn)錄酶(HiscriptII Enzyme)，混勻后50℃下孵育45 min，最后在85℃下孵育5min。

1.3 基因克隆

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中登錄的多種線蟲保守序列信息，應(yīng)用CODEHOP程序(http://blocks.fhcrc.org /codehop.html)設(shè)計簡并引物degGrx-F/R，并進行PCR擴增[13]。根據(jù)獲得的部分序列信息應(yīng)用Primer 3軟件(http://primer3.ut.ee/)設(shè)計特異引物。

3＇和5＇端序列根據(jù)cDNA末端快速擴增試劑盒(SMART? RACE cDNA Ampli?cation Kit，Clontech, 美國)進行擴增。對于3＇端，25 μL反應(yīng)體系如下：2.5 μL 10×PCR緩沖液，2 μL MgCl2(25 mmol/L)，2 μL dNTP (10 mmol/L)，引物AbGrx-F1和UPM (10 μmol/L)各2 μL，0.25 μg cDNA 模板和1個單位的Ex聚合酶(TaKaRa,大連)。PCR條件如下：95℃下預變性5 min；95℃下變性30 s，62℃下退火30 s，72℃下延伸2.5 min，38個循環(huán)；最后72℃下延伸10 min。5＇端采用巢式PCR進行擴增。第一輪采用引物AbGrx-R1和UPM進行降落PCR，體系和條件參照試劑盒說明。第二輪采用引物AbGrx-R2和NUP，反應(yīng)模板為稀釋50倍的第一輪PCR產(chǎn)物，反應(yīng)條件同3＇端RACE。完整序列采用包含開放閱讀框的引物AbGrx-fullF和AbGrx-fullR進行擴增，除退火溫度變?yōu)?5℃，其余反應(yīng)條件同前。所用引物見表1。

表1 本研究引物列表

下劃線為限制性內(nèi)切酶I/I的酶切位點。

The underlined refer to the digestion site byl/l.

1.4 序列和遺傳分析

水稻干尖線蟲谷氧還蛋白(AbGrx-1)氨基酸序列、等電點pI及分子量通過Lasergene 7.1進行預測。AbGrx-1基序特征通過保守域數(shù)據(jù)庫(conserved domain database，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)進行分析。蛋白信號肽、跨膜特征和亞細胞定位分別用SignalP 4.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/)、TMHMM Server 2.0 (http://www.cbs.dtu. dk/services/TMHMM-2.0/)和SubLoc1.0 (http://www. bioinfo.Tsinghua.edu.cn/Sub Loc/)進行預測。采用Clustal O 1.2.4(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clus talo/)進行序列比對分析，并用BoxShade 3.21 (http:// ch. embnet.org/software/BOX_ form.html)進行圖像修飾。應(yīng)用MEGA 7構(gòu)建臨近樹(Neighbor-joint)，采用步靴值(Bootstrap)進行計算，重復1000次。

1.5 線蟲氧化脅迫和溫度逆境存活監(jiān)測

為監(jiān)測在不同程度氧化脅迫和溫度逆境下水稻干尖線蟲的存活率，設(shè)置以下實驗：對于氧化脅迫，將約100 條活性良好的線蟲分別浸泡于含有0、5、10、25、50、100和250 mmol/L H2O2溶液的96孔細胞培養(yǎng)板中，室溫靜置48 h，每12 h在體式顯微鏡下統(tǒng)計線蟲存活率；對于溫度脅迫，將每孔含有約100條線蟲水懸液的96孔細胞培養(yǎng)板分別置于0℃、4℃、12℃、25℃、37℃和45℃孵育箱中，每12 h統(tǒng)計線蟲的存活率。每個處理重復6次。

1.6 基因差異表達分析

基于氧化脅迫和溫度逆境存活結(jié)果，在處理12 h后分別收集不同濃度H2O2和溫度脅迫條件下的線蟲，并進行RNA提取。利用TRIzol試劑提取線蟲總RNA，過程同前。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒[PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)，TaKaRa, 大連]進行cDNA合成；采用熒光定量試劑盒(SsoFast EvaGreen Supermix，Bio-Rad, 美國)進行定量PCR(qRT-PCR),并通過Bio-Rad IQ5系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)采集分析。以水稻干尖線蟲 18S rDNA 為內(nèi)參基因，利用特異引物Ab-18S-F和Ab-18S-R進行的轉(zhuǎn)錄豐度檢測。共3次生物學重復。相對表達水平用2?ΔΔCT法進行計算[14]，并采用檢驗統(tǒng)計差異顯著性。

1.7 AbGrx-1蛋白原核表達和純化

利用分別含有I和I酶切位點引物AbGrx-28a和AbGrx-28a擴增AbGrx1編碼區(qū)序列，連接到pET28a表達載體上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌Top10感受態(tài)細胞并進行轉(zhuǎn)化子篩選，測序正確轉(zhuǎn)化子進行質(zhì)粒提取，并將融合質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，提取陽性克隆進行蛋白表達，加入終濃度為0.5 mmol/L IPTG進行表達誘導。融合菌株在15℃下誘導15 h后進行超聲破碎，含有重組蛋白的上清用6×His標簽蛋白純化試劑盒(ProbeGene, 徐州)進行洗脫純化。洗脫的蛋白在20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)緩沖液中透析濃縮，并通過BCA試劑盒(ProbeGene, 徐州)測定蛋白濃度。

5＇和3＇非翻譯區(qū)用小寫字母表示，開放閱讀框用大寫字母表示；谷氧還蛋白催化殘基用方框表示；用于擴增全長序列的基因特異引物用下劃線標注；終止子（TAA）用星號表示。

Fig. 1. Complete nucleotide and deduced amino acid sequences of the AbGrx-1 cDNA (GenBank Accession No. KP190142).

1.8 AbGrx-1蛋白溶液對逆境脅迫下的線蟲存活的影響

為檢測純化蛋白是否影響線蟲的存活，將線蟲置于含有不同濃度(0、5、10、25和50 μmol/L)的AbGrx-1蛋白溶液中，室溫浸泡48 h，每12 h觀察線蟲存活率。為明確AbGrx-1能否增強線蟲對氧化脅迫和高溫脅迫的能力，將約100條線蟲加入終濃度為5 μmol/L AbGrx-1蛋白溶液中，室溫孵育48 h，將線蟲用ddH2O漂洗2次，再分別轉(zhuǎn)移至50 mmol/L H2O2溶液和45℃孵育箱，12 h后統(tǒng)計線蟲存活率。每處理重復3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 AbGrx-1基因序列和進化樹分析

水稻干尖線蟲谷氧還蛋白的cDNA序列(GeneBank登錄號：KP190142)共508 bp，包括90 bp的5＇非翻譯區(qū)(UTR)、318 bp的編碼區(qū)和97 bp的3＇UTR(圖1)。ProtParam預測開發(fā)閱讀框ORF(橫跨91至411位)編碼106個氨基酸，相對分子質(zhì)量為11.65 kD，理論等電點(pI)為8.77。AbGrx-1無信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)，定位于細胞質(zhì)。通過與NCBI上登錄的其他11種線蟲的Grx序列進行序列比對，發(fā)現(xiàn)AbGrx-1第24至27位點具有Grx催化殘基CYPC，分別在第69至第72和第83至第86位點存在保守的谷胱甘肽結(jié)合位點RSVP和GGDD(圖2)。

通過NCBI/BLASTP發(fā)現(xiàn)谷氧還蛋白在人類、動植物、昆蟲和線蟲等生物有機體中保守存在。AbGrx-1 (AJE60960)與線蟲的Grx具有很高的相似性，其中與動物寄生線蟲捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(, CDJ92071)蛋白序列相似度最高，達68%(E=5× 10?47)，而棘唇線蟲(，VBB32303)相似度最低，為57%(E=2×10?43)；與植物寄生線蟲燕麥真滑刃線蟲(，AAQ20895)和草莓芽線蟲(, AFC377891)分別有67%(E=2×10?54)和64%(E=4×10?49)的相似性；與三種自由生活線蟲(CAP38709)、(EFO84822)和(EGT47413)相似性分別為67%、66%和64%。

以二斑葉螨(，XP_01578 4727)谷氧還蛋白為外圍群體，將NCBI上登錄的23個線蟲的谷氧還蛋白進行進化樹分析。系統(tǒng)發(fā)育樹將線蟲的谷氧還蛋白劃分為2個大的分支，一個分支由羅阿絲蟲(，XP 020304614)、曲折盤尾絲蟲(，OZC08115)、棘唇線蟲(，VBB32303)、馬來絲蟲(，CRZ22053)以及吳策線蟲()等人類和動物寄生絲狀線蟲組成，另一個分支則包括自由生活線蟲、植物寄生線蟲以及人類和動物寄生線蟲。在目前已知的三種植物寄生線蟲中，水稻干尖線蟲AbGrx-1與燕麥真滑刃線蟲(，AAQ20895)劃歸于同一個次級分支，而與草莓芽線蟲(，AFC 377891)分屬不同次級分支(圖3)。

方框表示谷胱甘肽結(jié)合位點，向下箭頭表示谷氧還蛋白的催化殘基；一致和相似的序列分別用星號和圓點表示。

Fig. 2. Sequences alignment ofand other nematode glutaredoxin proteins.

2.2 逆境脅迫下線蟲AbGrx-1表達水平檢測

為了檢測氧化和溫度脅迫對基因表達水平的影響，首先分析了不同濃度H2O2溶液和不同溫度處理對線蟲存活率的影響。結(jié)果顯示，隨著H2O2濃度的逐漸升高，線蟲的存活率逐漸下降。浸泡于100 mmol/L和250 mmol/L H2O2中24 h可導致80%供試線蟲死亡，48 h則導致供試線蟲全部死亡；而5 mmol/L和10 mmol/L H2O2溶液對于線蟲存活無較大影響，在48 h時仍有90%以上的存活率。浸泡于中間濃度25 mmol/L和50 mmol/L的H2O2溶液中，線蟲的存活率存在較大差異：浸泡于25 mmol/L H2O224 h，超過85%線蟲存活，而在50 mmol/L H2O2中，線蟲存活為38.6%(圖4-A)。在溫度逆境下，線蟲在0、4、12、25℃等較低溫度中保持較高存活率，在處理48 h時仍有超過95%存活率。隨著時間的推移和溫度的升高，暴露于37℃和45℃高溫環(huán)境下48 h，線蟲的存活率分別為54.6%和4.2%(圖4-B)。

線蟲浸泡于H2O2溶液中12 h，表達水平顯著提高，在5 mmol/L H2O2溶液中，表達水平為對照組的19.3倍，隨著H2O2濃度的提高，的表達水平下降，但都顯著高于對照組(<0.01)(圖5-A)。當線蟲處于溫度逆境中，相比25℃，的表達水平在0℃、4℃、37℃和45℃下對顯著降低，而在12℃時表達水平顯著提高，為25℃環(huán)境中的1.5倍(<0.01)。

圖3 線蟲谷氧還蛋白的遺傳發(fā)育樹

Fig. 3. Phylogenetic relationship among different glutaredoxin proteins in the known nematodes species.

2.3 AbGrx-1蛋白提高線蟲在逆境脅迫中的存活率

為了研究AbGrx-1蛋白功能，構(gòu)建了融合表達載體進行原核表達。通過IPTG誘導，SDS-PAGE電泳獲得一條約14 kD的蛋白條帶，與理論分子量相當，通過Ni-IDA柱進行洗脫純化獲得高純度的AbGrx-1蛋白(圖6-A)。將線蟲浸泡于不同濃度的AbGrx-1蛋白溶液中，隨著時間的推移和蛋白濃度的升高線蟲的存活率逐漸下降。48 h時，浸泡于50 μmol/L 蛋白溶液超過13%的線蟲死亡，而在低濃度5 μmol/L和10 μmol/L溶液中，線蟲的存活率超過90%(圖6-B)。為了檢測AbGrx蛋白是否增強線蟲的抗逆能力，選擇5 μmol/L濃度進行后續(xù)處理。

將預先浸泡在5 μmol/L AbGrx-1蛋白溶液中的線蟲分別置于氧化和高溫逆境12 h，結(jié)果顯示，AbGrx-1蛋白預處理的線蟲在50 mmol/L H2O2溶液中的存活率為64.73%，顯著高于未預處理的41.28% (<0.01)(圖6-C)。45℃高溫脅迫下，預處理的線蟲存活率為79.81%，高于未處理的65.61%，但差異不顯著；而處于25℃環(huán)境中線蟲的存活率不受影響(圖6-D)。

圖4 氧化脅迫(A, H2O2處理)和溫度脅迫(B)下水稻干尖線蟲的存活率

Fig. 4. Cumulative survival rates ofexposed to H2O2(A) and temperature (B) stress.

柱條表示標準誤；*，**分別表示與對照(0mml/L或25℃)差異達0.05, 0.01顯著水平。

Bars are stardand error. *, ** indicate significant difference between the treatment and the CK(0mml/L or 25℃)at 0.05 and 0.01 levels. The same as in figures below.

圖5 暴露于不同濃度H2O2和不同溫度12 hAbGrx-1的相對表達水平

Fig. 5. Relative expression level of AbGrx-1exposed to H2O2and temperature stress for 12 hours.

3 討論

作為氧化還原酶，Grxs參與維持和調(diào)控胞間氧化還原平衡。目前，已有許多昆蟲的基因被克隆，表達分析也已完成。當遭受饑餓、紫外光照射、機械損傷及高低溫逆境時，亞洲玉米螟()迅速被誘導表達[15]。中華蜜蜂()和受高低溫、H2O2、殺蟲劑、汞等極端因子的誘導[16]。棉鈴蟲()、和受不同溫度和H2O2的誘導[17]，進一步檢測發(fā)現(xiàn)這些Grxs具有抗氧化防御的功能。然而有關(guān)植物寄生線蟲Grx的研究十分有限。

本研究通過RACE-PCR技術(shù)克隆了水稻干尖線蟲的谷氧還蛋白。從氨基酸序列和結(jié)構(gòu)上來說，AbGrx-1蛋白在所有線蟲中都高度保守?；诨钚晕稽c[1]，AbGrx-1與已經(jīng)報道的草莓芽線蟲谷氧還蛋白AF-GLX-1一樣，歸屬于Ⅰ類Grx[6]。盡管如此，在進化關(guān)系上，其中一些Grx在分類上可能存在變異。NJ進化樹分析顯示，盡管位于一個大的進化分支，但AbGrx-1與AF-GLX-1分屬不同的次級分支，而與燕麥真滑刃線蟲、鼠類圓線蟲()和犬弓蛔蟲()的谷氧還蛋白屬于同一次級分支。

前期已有文獻報道，自由生活線蟲對H2O2十分敏感，低濃度H2O2浸泡能快速造成蟲體死亡[4, 18, 19]；而植物線蟲對氧化脅迫具有較強的適應(yīng)性，例如南方根結(jié)線蟲() J2在100 mmol/L H2O2溶液中浸泡30 min，僅有10%的線蟲死亡[20]。相比根結(jié)線蟲，水稻干尖線蟲對H2O2極不敏感，在100 mmol/L和250 mmol/L的H2O2溶液中浸泡24 h仍不會全部死亡(圖4-A)。之前有研究利用H2O2溶液對水稻干尖線蟲進行表面消毒卻不影響線蟲的活性[21, 22]，暗示水稻干尖線蟲可能利用特殊的抗氧化機制來克服外界的氧化脅迫。線蟲對溫度改變的適應(yīng)是其生存的關(guān)鍵。例如，昆蟲病原線蟲小卷蛾斯氏線蟲() 在低溫(5~ 25℃)下的存活率和致病性顯著高于高溫35℃[23]；腎型線蟲()在10℃時不能侵染植物，但在零下低溫環(huán)境中仍能存活6個月[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，適度的低溫脅迫不能顯著影響水稻干尖線蟲的存活，短期的高溫脅迫也不能造成全體供試線蟲死亡(圖4-B)，表明水稻干尖線蟲對溫度逆境具有極強的耐受力。

之前的研究表明，燕麥真滑刃線蟲()的表達不受H2O2和低溫誘導，而受高溫抑制[25]；而低溫能抑制草莓芽線蟲()的表達[6]。這些結(jié)果說明不同線蟲的Grx對于氧化和溫度壓力的反應(yīng)存在差異。通過監(jiān)測H2O2處理和溫度逆境下水稻干尖線蟲基因表達水平，發(fā)現(xiàn)H2O2能顯著誘導的表達，并且低濃度(5 mmol/L) H2O2下表達水平最高(圖5-A)。考慮到低濃度H2O2對線蟲存活率的影響較小，推測5 mmol/L H2O2是水稻干尖線蟲蟲體損傷的臨界濃度，水稻干尖線蟲能通過誘導的高表達激發(fā)自身的抗氧化免疫反應(yīng)。各溫度脅迫下表達水平最多被誘導1.54倍(圖5-B)。當培養(yǎng)溫度從25℃上升到31℃~33℃時，熱激蛋白Hsp90、Hsp70和小分子Hsp蛋白迅速被誘導合成，表現(xiàn)出典型的熱休克反應(yīng)[26]；而低溫和高溫能顯著誘導水稻干尖線蟲Hsp90基因上調(diào)表達[10]。因此，水稻干尖線蟲可能不通過誘導AbGrx-1的表達應(yīng)對溫度逆境。

A，AbGrx-1蛋白的表達和純化；M，標記；1，純化的蛋白；2，IPTG誘導表達的蛋白；3，未誘導蛋白；4，空載；B，不同濃度AbGrx1溶液浸泡對線蟲存活率的影響；C~D，AbGrx-1蛋白預處理的線蟲在氧化（C）和高溫逆境（D）處理中的存活率。**表示處理與對照間差異達0.01顯著水平。

Fig. 6. Role of AbGrx-1 protein in the response ofto oxidization and temperature stresses.

Li等[27]發(fā)現(xiàn)利用蕎麥谷氧還蛋白rbGrx溶液浸泡能降低氧化脅迫和高溫逆境下蟲體內(nèi)活性氧水平，增強SOD、CAT等氧化酶的活性，從而提高線蟲對氧化脅迫和高溫逆境下的存活率，并延長線蟲的壽命。與之不同， AbGrx-1原核表達蛋白溶液預處理能顯著提高氧化脅迫下水稻干尖線蟲的存活率，但不能顯著降低高溫逆境導致的線蟲死亡率(圖6)。通過體外酶活測試，證實AbGrx-1蛋白能有效清除反應(yīng)溶液中H2O2(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。因此，AbGrx-1蛋白能通過降低蟲體活性氧水平以減少細胞的氧化損傷，從而提高線蟲存活率。

在線蟲與寄主互作過程中，寄主能產(chǎn)生活性氧以抵御線蟲的侵染取食；為了存活，線蟲常常分泌一系列抗氧化酶抑制寄主活性氧信號的免疫反應(yīng)[20]。例如，動物病原線蟲通過SOD、GPX和CAT等抵抗ROS對其造成的損傷[28]。松材線蟲()能利用半胱氨酸過氧化物還原酶(Prx2s)弱化寄主防衛(wèi)反應(yīng)，促進侵染[29]。根結(jié)線蟲能分泌轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白(MjTTL5)與寄主植物鐵(硫)氧還蛋白還原酶催化亞基互作，清除侵染細胞活性氧完成侵染[30]。AbGrx-1作為水稻干尖線蟲抵抗氧化脅迫重要蛋白，在侵染寄主早期高度表達(結(jié)果未顯示)，暗示AbGrx-1可能參與水稻干尖線蟲與寄主互作。因此，AbGrx-1可能是水稻干尖線蟲潛在的防控靶點，通過抑制的表達將有助于水稻干尖線蟲病的高效防控。

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Protective Effect of Glutaredoxin (AbGrx-1) onUnder Oxidative Stress

FENG Hui2, FAN Yalei2, ZHANG Jinfeng2, ZHU Hongli1, WEI Lihui1, 2, *

(1,,,;2,,,;Corresponding author,)

The antioxidant glutaredoxin (Grx) plays a crucial role in regulating intracellular redox homeostasis via scavenging of excess reactive oxygen species. The white-tip nematodecan survive in adverse environments including high temperature,osmosis and oxidative stresses. To reveal the antioxidant function of Grx in,herein the full-length cDNA of glutaredoxin (named AbGrx-1) fromwas cloned by using rapid amplification of cDNA ends (RACE), and AbGrx-1 protein and evolutionary relationship were characterized; differential gene expression level was detected in the nematodes under oxidant and temperature stresses by using quantitative real-time PCR; the effect of the recombinant AbGrx-1 protein onsurvival was also tested.The full-lengthcDNA contains a 5' UTR of 90, an ORF of 321 bp encoding a polypeptide of 106 amino acids and a 3' UTR of 97 bp. The deduced amino acid sequence of AbGrx-1 shares a high similarity with other nematodes’ Grxs, and the catalytic residue (CPYC) and glutathione binding sites (RSVP and GGDD) indicate that AbGrx-1 is categorized into Class I Grx. The phylogenetic tree showed AbGrx-1 is located in the same clade with the plant parasitic nematode. AbGrx-1 mRNA is highly induced inexposed to H2O2solution and 12℃, but is suppressed in the nematodes at 0, 4, 37 and 45℃. The high concentration H2O2solutions and high temperature are adverse to survival of, but the survival rate increases with the nematodes pre-soaked in AbGrx-1 recombinant protein solution.AbGrx-1 is required forantioxidative immunity, and plays an essential role in overcoming oxidative damage and nematode survival.

; glutaredoxin; gene cloning; recombinant protein; antioxidation

S435.111.4+8

A

1001-7216(2019)06-0565-10

10.16819/j.1001-7216.2019.9016

2019-01-28；

2019-05-07。

國家自然科學基金資助項目（31401728）；江蘇省農(nóng)業(yè)自主創(chuàng)新資金資助項目[cx(17)3023]。