杜溢墨 潘天 田云錄 劉世家 劉喜 江玲 張文偉 王益華 萬建民

水稻粉質(zhì)皺縮胚乳突變體的表型分析與基因克隆

杜溢墨 潘天 田云錄 劉世家 劉喜 江玲 張文偉 王益華*萬建民

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室/農(nóng)業(yè)部長江中下游粳稻生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室/江蘇省現(xiàn)代作物生產(chǎn)中心/江蘇省植物基因工程技術(shù)研究中心，南京 210095；*通訊聯(lián)系人，E-mail: yihuawang@njau.edu.cn）

水稻種子主要以淀粉形式儲藏能量。淀粉合成需要多種酶類和調(diào)控因子參與，機制較為復(fù)雜。本研究利用水稻胚乳發(fā)育缺陷突變體，克隆和鑒定新的調(diào)控淀粉合成相關(guān)基因，旨在為研究淀粉合成及其調(diào)控提供理論依據(jù)。從化學(xué)誘變劑甲基亞硝基脲（1-methyl-1-nitroso-urea, MNU）處理的寧粳3號(Ningjing 3, WT)突變體庫中篩選到一個能穩(wěn)定遺傳的胚乳粉質(zhì)皺縮突變體，命名為()。與秈稻品種Dular雜交獲得F1種子（F2），通過圖位克隆的策略確定候選基因。利用雜合植株（）分離出的粉質(zhì)種子，觀察形態(tài)學(xué)特征，分析其理化性質(zhì)。使用掃描電鏡和半薄切片技術(shù)觀察胚乳結(jié)構(gòu)。使用qRT-PCR和免疫印跡分析淀粉合成相關(guān)基因表達模式和淀粉合成相關(guān)酶類的蛋白積累量。利用全自動氨基酸分析儀測定成熟胚乳各氨基酸含量。突變體籽粒寬度、厚度以及千粒重顯著下降，同時胚乳中總淀粉、總蛋白、直鏈淀粉含量亦顯著下降，而脂肪含量顯著上升；淀粉黏度、崩解值和消減值顯著低于野生型。突變體中多為單粒型淀粉顆粒，且排列分散。定位于第5染色體長臂約252 kb的區(qū)間內(nèi)，測序發(fā)現(xiàn)編碼Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因（Delta 1-pyrroline-5-carboxylate synthetase,）第1外顯子上發(fā)生單堿基替換，導(dǎo)致一保守的氨基酸發(fā)生變異。突變體中大部分淀粉合成相關(guān)基因表達量下調(diào)，多種淀粉合成相關(guān)蛋白積累量減少。突變體米粉中多種氨基酸含量發(fā)生顯著變化，游離氨基酸含量是其野生型的3.6倍。此外，外源噴施脯氨酸能部分恢復(fù)突變體種子萌發(fā)缺陷表型。編碼脯氨酸合成關(guān)鍵限速酶P5CS，該基因?qū)ε呷橹邪被岬暮铣杉按x起重要的調(diào)控作用，并影響淀粉的合成與積累。

粉質(zhì)胚乳；淀粉合成；基因克??；Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶；氨基酸合成與代謝

水稻是世界上最主要的糧食作物之一，也是全球一半以上人口的主食[1]。我國人口眾多，因此長期高度重視產(chǎn)量育種，導(dǎo)致近年來審定品種中優(yōu)質(zhì)品種比例偏低。隨著人民生活水平不斷提高，稻米品質(zhì)改良顯得愈加重要[2]。水稻種子發(fā)育過程中積累大量的淀粉，其中直鏈淀粉與支鏈淀粉含量、比例和支鏈淀粉的鏈長分布與稻米食味品質(zhì)直接相關(guān)[3]，因此解析稻米淀粉合成與調(diào)控的分子網(wǎng)絡(luò)途徑對稻米品質(zhì)改良至關(guān)重要。淀粉合成過程需要腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(ADP glucose pyropho- sphorylase, AGPase)、顆粒淀粉合酶(Granule-bound starch synthase, GBSS)、淀粉合酶(Starch synthase, SS)、淀粉分支酶(Starch branching enzyme, SBE)、淀粉去分支酶(Debranching enzyme, DBE)等多種關(guān)鍵酶催化[4-5]，同時還涉及到復(fù)雜的調(diào)控過程，雖然已經(jīng)有部分調(diào)控基因的克隆報道，但淀粉的合成調(diào)控路徑遠未異清[6-8]。

大量的研究表明，利用胚乳缺陷突變體克隆鑒定新的淀粉合成調(diào)控相關(guān)基因是可行的[9]。目前已有多個水稻粉質(zhì)胚乳形成相關(guān)基因被報道。如編碼一個三角形四肽重復(fù)基序蛋白，突變后籽粒變小，外觀呈暗胚乳表型，直鏈淀粉含量降低，其過表達植株籽粒變大[10]。編碼一個丙酮酸磷酸雙激酶，其突變體的支鏈淀粉合成受到影響[11]。編碼一個含有CBM48結(jié)構(gòu)域的蛋白，該蛋白與異淀粉酶1（Isoamylase 1, ISA1）互作，可能調(diào)節(jié)ISA1與淀粉顆粒的結(jié)合[12]。編碼一個功能未知蛋白，其突變體胚乳外圍呈粉質(zhì)但中間部分正常[13]。編碼一個P型PPR蛋白，該基因通過對水稻線粒體第1內(nèi)含子的反式剪接影響線粒體功能，并對胚乳發(fā)育起重要作用[14]。編碼依賴于NAD的胞質(zhì)蘋果酸脫氫酶CMDH，該突變體ATP含量降低，淀粉合成相關(guān)酶活性顯著降低，過量表達顯著提高籽粒重量，具有潛在的應(yīng)用前景[15]。此外，也有一些粉質(zhì)皺縮的突變體被報道。如編碼含有DDHD結(jié)構(gòu)域的膜結(jié)合蛋白，其表達產(chǎn)物可能具有磷酸水解酶活性，導(dǎo)致胚乳中的脂質(zhì)合成存在缺陷，影響造粉體發(fā)育[16]。位于第3染色體短臂，編碼一個鳥苷酸激酶OsGK1。該基因突變后，胚乳的淀粉顆粒變小且呈圓型[17]。被精細(xì)定位于第9染色體長臂約228 kb區(qū)間內(nèi)，其突變體淀粉顆粒排列松散，大小不一，單粒型淀粉顆粒增多[18]。因此，對水稻粉質(zhì)胚乳形成的研究能夠進一步豐富淀粉合成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為稻米品質(zhì)改良提供理論參考。

脯氨酸是一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，能夠作為分子伴侶穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，也可以作為抗氧化劑調(diào)節(jié)植物體內(nèi)活性氧平衡[19]。Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(Delta 1-pyrroline-5-carboxylate synthetase, P5CS)催化谷氨酸鹽(Glutamate)生成谷氨酸半醛(Glutamate semialdehyde, GSA)，是植物由谷氨酸通路合成脯氨酸的關(guān)鍵限速酶，可在逆境脅迫時增加植株脯氨酸水平[20]?；蛞呀?jīng)在豇豆、苜蓿、高粱、大豆、剛毛檉柳等多種植物中被克隆，主要參與植物對逆境的響應(yīng)[21-25]。將菜豆和的cDNA導(dǎo)入擬南芥中，在鹽脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因植株葉片中的脯氨酸含量顯著高于對照[26]。在水稻中，采用130 mmol/L NaCl溶液處理日本晴幼苗，其轉(zhuǎn)錄物水平強烈上調(diào)，脯氨酸含量升高[27]。昆蟲和人類中也有關(guān)于的報道。在馬鈴薯甲蟲中沉默或能夠顯著降低血淋巴中脯氨酸和精氨酸含量；敲除顯著增加成蟲死亡率[28]。人體中突變將會導(dǎo)致高氨血癥、低脯氨酸血癥等疾病，臨床表現(xiàn)為皮膚松弛，小腦畸形[29]。因此，對動植物生長發(fā)育起重要作用，但水稻中如何調(diào)控水稻胚乳發(fā)育及淀粉合成等尚未見報道。

本研究從寧粳3號突變體庫中篩選到胚乳粉質(zhì)皺縮突變體，對其籽粒性狀及米粉理化性質(zhì)進行測定，并對其籽粒胚乳結(jié)構(gòu)進行觀察。通過圖位克隆確定候選基因。借助細(xì)胞學(xué)、免疫印跡和氨基酸含量分析等實驗，闡述與造粉體發(fā)育及籽粒中氨基酸合成的關(guān)系，為進一步完善水稻胚乳中淀粉合成調(diào)控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料種植

從化學(xué)誘變劑甲基亞硝基脲(1-methyl-1- nitroso-urea, MNU)處理的寧粳3號突變體庫中篩選到一個能穩(wěn)定遺傳的胚乳粉質(zhì)皺縮突變體，命名為()。突變體純合致死，因而選擇雜合單株與秈稻品種Dular配制雜交組合，用于基因的定位克隆。所有材料均種植于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)土橋?qū)嶒灮睾秃Ｄ狭晁戏被兀耘喙芾矸绞脚c大田生產(chǎn)相同。

1.2 成熟種子理化性狀測定

雜合植株成熟種子去殼后于醫(yī)用燈箱上挑選出粉質(zhì)皺縮個體，磨成糙米粉并過篩（孔徑為0.15 mm），50℃烘箱中放置12 h以上至恒重。直鏈淀粉含量測定使用GB-7648-87法。1）精確稱量標(biāo)樣、野生型和突變體米粉0.1 g置于100 mL容量瓶底部，加入1.0 mL 95%乙醇濕潤米粉；2）加入9 mL 1 mol/L氫氧化鈉溶液，沸水浴10 min；3）取5 mL 樣品溶液置于容量瓶中，再加入1 mL 1 mol/L乙酸溶液，待樣品酸化后加1.5 mL碘液，定容至100 mL，靜置20 min；5）利用分光光度計測量620 nm處樣品的吸光度，以0.09 mol/L氫氧化鈉溶液為空白對照。利用已知淀粉含量與吸光度值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算樣品直鏈淀粉含量。每個樣品3次重復(fù)。

總淀粉含量使用Megazyme總淀粉含量測定試劑盒測定?？傊竞渴褂肍OSS公司全自動脂肪測定儀測定?？偟鞍缀渴褂肍OSS公司全自動凱氏定氮儀測定。每個樣品均重復(fù)測定3次，求平均值。用25 mL蒸餾水將3.0 g米粉混合均勻，采用瑞典Perten公司RVA快速黏度分析儀（Tecmaster）測定黏度特性。

1.3 成熟種子掃描電鏡觀察

選出典型的野生型與突變體種子，送至南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院電鏡實驗中心，由電鏡中心完成樣品制備，在日立S-3000N型掃描電鏡下觀察拍照。

1.4 TTC染色

取野生型與突變體成熟種子各30粒，30℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)浸種12 h，吸干水分后放入15 mL離心管中。稱取0.1 g避光保存的2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑(2, 3, 5-Triphenyltetrazolium chloride, TTC)粉末，溶于100 mL磷酸緩沖液（pH 7.0）中。每個離心管中分別加入10 mL現(xiàn)配的0.1% TTC溶液，避光放置于30℃光照培養(yǎng)箱，2 h和5 h后取出，蒸餾水沖洗后白紙上觀察染色情況并拍照。

1.5 胚乳半薄切片觀察

分別取野生型和突變體花后12 d(Days after flowering，DAF)胚乳，于冰上將胚乳從中間橫向切取1 mm厚度薄片。1）樣品放入離心管中，加入固定液[多聚甲醛2%(/)，戊二醛2%(/)，蔗糖250 mmol/L，PIPES-KOH 50 mmol/L，pH 7.2]，4℃下避光保存。剩余部分放入2.0 mL 離心管中用于SDS-PAGE，鑒定所選極端的準(zhǔn)確性。2）PBS漂洗3次后，分別在30%、50%的乙醇溶液處理樣品，每次15 min(4℃下)。之后在?20℃下用70%乙醇溶液處理2次，每次30 min。3）在?20℃條件下使用70%乙醇∶LR White樹脂(1∶2)、100% LR White樹脂對樣品進行滲透各2 h，100% LR White樹脂滲透12 h。將樣品放入60℃烘箱中高溫聚合48 h以上。使用Leica RM2265切片機切成1 μm厚度薄片，0.1% I2-KI溶液染色后在Zeiss AX10顯微鏡下觀察拍照。

1.6 基因的圖位克隆

配制突變體與秈稻Dular的雜交組合，收獲F1自交種子F2。烘箱干燥后去除種子穎殼，挑選與突變體表型一致的種子提取DNA。利用實驗室已有的分子標(biāo)記引物，篩選突變體和Dular之間的多態(tài)性標(biāo)記，使用10個隱性個體進行連鎖分析。確定連鎖位點后，增加標(biāo)記和隱性個體數(shù)量，擴大群體進行精細(xì)定位。所用引物由水稻變異圖譜網(wǎng)站(http://www.ricevarmap.ncpgr.cn)和Primer Premier 5.0軟件設(shè)計。根據(jù)水稻全基因芯片數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站(http://ricexpro.dna.affrc.go.jp/)上公布的日本晴序列預(yù)測定位區(qū)間內(nèi)ORFs(Open reading frames)。所用引物見表1。

1.7 淀粉合成相關(guān)基因的表達分析

分別取野生型和突變體花后12 d的胚乳，使用TIANGEN公司試劑盒提取胚乳RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA；采用美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司的7500實時PCR系統(tǒng)儀器，以水稻為內(nèi)參進行PCR。反應(yīng)體系包括cDNA模板8.0 μL（約80 ng）、前引物及后引物各1 μL（10 μmol/L）、10 μL SYBR Premix ExII (2 ×)。采用2法對基因表達數(shù)據(jù)進行分析處理[30]。

1.8 蛋白免疫印跡分析

提取成熟的野生型和突變體種子總蛋白進行SDS-PAGE。使用濃度為6%的濃縮膠，8%~18%梯度的分離膠。電泳完成后，用Bio-Rad公司的濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上(Minipore 0.45 μm)。將PVDF膜在封閉液(5%脫脂牛奶，PBST溶解)中孵育1 h。之后分別轉(zhuǎn)移到含有Anti-GBSSI、Anti-AGPS2b、Anti-Flo4、Anti-BEⅡb、Anti-BEⅠ、Anti-AGPL2、Anti-SSⅠ等一抗(1∶10000)的新封閉液中室溫孵育2 h。PBST(氯化鈉8 g, 氯化鉀0.2 g，磷酸氫二鉀0.27 g, 磷酸氫二鈉3.85 g, 吐溫-20 500 μL 溶于1 L蒸餾水中)漂洗PVDF膜3次，每次15 min。再將PVDF膜轉(zhuǎn)移到含有二抗(1:5000)的封閉液中，孵育1 h，重復(fù)漂洗過程。使用ECL化學(xué)發(fā)光液檢測雜交信號。所用抗體為ABclonal公司制備，內(nèi)參抗體為Anti-EF-1α。

1.9 氨基酸序列比對

在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）網(wǎng)站下載不同物種中P5CS同源蛋白序列，使用MEGA 7.0進行比對分析并構(gòu)建其同源蛋白進化樹。

1.10 候選基因OsP5CS的亞細(xì)胞定位

構(gòu)建片段與GFP融合載體。挑選經(jīng)測序正確的陽性克隆，采用TIANGEN公司的質(zhì)粒大量提取試劑盒，提取質(zhì)粒。水稻原生質(zhì)體分離參考前人方法進行[31]。1）在200 μL(2×104)原生質(zhì)體中加入10 μL高濃度(1 μg/ μL)質(zhì)粒；2）加入220 μL 40% PEG溶液，混勻后28℃下避光放置20 min；3）加入880 μL W5溶液(氯化鈉4.5 g，氯化鈣6.935 g，氯化鉀0.185 g，MES 0.195 g，蔗糖0.5 g溶于500 mL蒸餾水，過濾滅菌后使用)混勻；4）于28℃下150下離心3 min，除去PEG；5）加入220 μL W5溶液重懸沉淀，28℃、黑暗條件下培養(yǎng)過夜后使用Zeiss公司LSM710型激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.11 氨基酸含量的分析

取同一塊田生長的野生型與突變體種子，磨成米粉。將米粉過篩后，于50℃烘箱中放置24 h以上烘至恒重。

米粉中水解氨基酸含量測定：稱取0.1 g米粉放入水解管中，加入5 mL 6 mol/L濃鹽酸，充氮封管后置于110℃烘箱中，22 h后取出；蒸餾水定容至100 mL，取1 mL真空干燥后加入1 mL蒸餾水復(fù)溶，使用0.22 μm水系濾頭過濾后置于日本Hitachi公司L-8900型全自動氨基酸分析儀測定水解氨基酸含量。每個樣品3次重復(fù)。

米粉中游離氨基酸含量測定：準(zhǔn)確稱取0.4 g米粉，浸入1.5 mL蒸餾水中，4℃下旋轉(zhuǎn)過夜；12 000 r/min下離心15 min，取上清液到2.0 mL離心管中，加入等體積的4%磺基水楊酸溶液，搖勻后12 000 r/min下離心15 min；用0.22 μm水系濾頭過濾上清液；使用Hitachi公司L-8900型全自動氨基酸分析儀測定游離氨基酸含量。每個樣品3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體fse4的表型分析

突變體成熟籽粒去除穎殼后呈現(xiàn)粉質(zhì)皺縮狀，野生型種子胚乳則飽滿透明(圖1-A~B)?；ê?2 d野生型和突變體胚乳半薄切片觀察顯示，野生型胚乳細(xì)胞淀粉顆粒排列緊密，互相擠壓(圖1-D)，而突變體中淀粉顆粒排列疏松，間隙很大(圖1-E)，說明突變體造粉體發(fā)育相對滯后。掃描電鏡發(fā)現(xiàn)，突變體胚乳中淀粉顆粒大小不一，相互之間存在較大間隙(圖1-G)；野生型種子橫斷面的淀粉顆粒排列整齊，相互擠壓呈多面體晶體結(jié)構(gòu)(圖1-F)。上述結(jié)果顯示對胚乳中造粉體的發(fā)育至關(guān)重要。此外，SDS-PAGE顯示，突變體蛋白質(zhì)譜帶與野生型相比發(fā)生明顯變化，主要儲藏蛋白的積累量極顯著下降(圖1-C)。相較野生型，突變體種子的粒長、粒寬和粒厚分別下降0.8%、7.6%和30.8%（圖1-H），千粒重下降54.1%(圖1-I)。因此，的突變顯著影響了水稻種子的發(fā)育。

A?種子外觀，標(biāo)尺為1 mm；B?種子的橫切面，標(biāo)尺為1 mm；C? SDS-PAGE電泳圖譜。D，E為花后12 d胚乳半薄切片，標(biāo)尺50 μm；F，G為籽粒橫截面掃描電鏡觀察，標(biāo)尺為10 μm；H?千粒重比較，n=3；I?籽粒大小比較，n=20。數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；采用t測驗，*P<0.05, **P＜0.01。

Fig. 1. Phenotypic observation of seeds of WT and.

2.2 突變體fse4胚萌發(fā)觀察

突變體胚萌發(fā)異常，少部分種子不能萌發(fā)，大部分種子長出約2 mm嫩芽后迅速死亡(圖2-A)。TTC染色2 h結(jié)果顯示，突變體胚活力極弱(圖2-D)。將野生型和突變體種子放入30℃光照培養(yǎng)箱中，恒溫吸漲12 h后將其胚進行縱切片觀察，野生型胚出現(xiàn)明顯萌動，具有很強生活力；而突變體胚內(nèi)部結(jié)構(gòu)尚不明顯(圖2-B)。恒溫吸漲24 h后，突變體胚出現(xiàn)結(jié)構(gòu)分化，但仍較野生型緩慢(圖2-C)。TTC染色5 h后，突變體部分種子染上紅色(圖2-E)。說明突變使水稻胚發(fā)育產(chǎn)生缺陷，影響種子萌發(fā)。

A—種子發(fā)芽5 d后的表型。標(biāo)尺為1 cm；B, C—種子在30℃下吸脹12 h(B)和24 h(C)后胚的縱切片，標(biāo)尺為1 mm；D, E—種子TTC染色2 h(D)和5 h(E)后的著色情況。標(biāo)尺為1 cm。

Fig. 2. Seed viability analysis of WT and.

n=3，取平均值±SD；采用t檢驗，*P<0.05，**P<0.01。

Fig. 3. Physicochemical characteristics of WT andmature seeds.

表2 野生型和突變體fse4淀粉的RVA譜特征分析

PKV, Peak viscosity; HPV, Hot pasting viscosity; BDV, Breakdown viscosity; CPV, Cool pasting viscosity; SBV, Setback viscosity; PeT, Peak time; PaT, Past temperature.

2.3 突變體fse4成熟籽粒的理化性狀分析

與野生型成熟種子相比，突變體總淀粉含量、直鏈淀粉含量和總蛋白含量分別下降11%、43%和8%(圖3-A~C)，總脂肪含量則升高62%(圖3-D)。RVA譜分析結(jié)果顯示，突變體與野生型米粉黏度曲線差異顯著：突變體最高黏度(Peak viscosity, PKV)較野生型出現(xiàn)更早，但其最大值低于野生型。此外，突變體崩解值(Breakdown viscosity, BDV)、消減值(Setback viscosity, SBV)、冷膠黏度(Cool pasting viscosity, CPV)等顯著低于野生型(表2)。說明突變影響胚乳淀粉的理化性狀。

2.4 FSE4突變影響發(fā)育胚乳中淀粉合成相關(guān)基因的表達和蛋白積累

提取花后12 d野生型和突變體的胚乳總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進行淀粉合成相關(guān)基因的表達量分析(圖4)。與野生型相比，突變體中包括AGPase各亞基編碼基因，淀粉合酶(SS)各亞基編碼基因在內(nèi)的大部分與淀粉合成相關(guān)的基因表達量不同程度下降(圖4-A)。提取野生型和突變體成熟種子總蛋白進行免疫印跡雜交實驗，結(jié)果顯示突變體中部分淀粉合成相關(guān)蛋白積累量顯著降低(圖4-B)。說明突變影響突變體中淀粉的合成。

A—花后12 d胚乳的淀粉合成相關(guān)基因表達分析(n=3)；采用t檢驗，**P<0.01。以Ubiquitin為內(nèi)參；B—種子中淀粉合成相關(guān)蛋白的積累，以Anti-EF-1α為內(nèi)參抗體。

Fig. 4. Transcripts and protein levels of starch biosynthesis related genes in WT and.

表3 FSE4遺傳分析

A—FSE4與標(biāo)記I5-9和N5-29連鎖；B—利用1568個隱性個體將FSE4定位到252 kb區(qū)間內(nèi)。該區(qū)間內(nèi)有24個ORFs。C—野生型和fse4在基因Os05g0455500序列第一個外顯子上存在單堿基替換。線代表內(nèi)元，黑盒代表外元，白框分別代表5’和3’非翻譯區(qū)。

Fig. 5. Map-based cloning of

2.5 FSE4的遺傳分析和圖位克隆

鑒定雜合型植株的成熟種子分離比，透明飽滿種子與粉質(zhì)皺縮種子的性狀分離比符合3∶1(表3)，因此突變性狀受一對隱性基因控制。

利用雜合植株()與秈稻品種Dular雜交配組，從F2群體中挑選與突變體親本表型一致的粉質(zhì)皺縮種子，用于的精細(xì)定位。使用79個隱性個體將定位于第5染色體長臂，分子標(biāo)記I5-9和N5-29之間約13 cM區(qū)間內(nèi)(圖5-A)。進一步利用1568個隱性個體將區(qū)間限定在TI2和TI6之間約252 kb區(qū)間內(nèi)(圖5-B)。通過RiceXPro網(wǎng)站預(yù)測，該區(qū)間內(nèi)含有24個開放閱讀框(Open reading frames, ORFs)(表4)。測序發(fā)現(xiàn)，突變體的基因第一個外顯子上出現(xiàn)單堿基替換：編碼區(qū)的第 47個堿基由G突變?yōu)锳，導(dǎo)致編碼的精氨酸突變?yōu)榻M氨酸。NCBI網(wǎng)站預(yù)測，編碼Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(Delta1-pyrroline-5-carboxylate synthetase，P5CS)，基因組長6716 bp，包含19個外顯子，18個內(nèi)含子(圖4-C)，編碼區(qū)(Coding sequence, CDS)長2151 bp，編碼一個包含716個氨基酸殘基的蛋白。根據(jù)以上結(jié)果，將定為的候選基因。

2.6 OsP5CS及其同源蛋白序列分析

進化樹分析顯示OsP5CS與小麥、擬南芥、玉米等植物中的P5CS蛋白序列有較高同源性(圖6-A)，說明OsP5CS蛋白功能上的保守性。突變體中突變發(fā)生在第16個氨基酸殘基上，序列比對顯示該位點在上述物種中高度保守(圖6-B)。因此,該保守位點的突變可能是突變體表型產(chǎn)生的原因。

2.7 組織表達分析與亞細(xì)胞定位

為探究基因的表達模式，取野生型寧粳3號植株各個組織樣品，提取RNA后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用實時熒光定量PCR測定各組織中基因表達量。結(jié)果表明，基因在野生型寧粳3號中呈組成性表達，在莖中表達量相對較高(圖7-A)。在胚乳發(fā)育過程中，基因花后6 d表達量較高，花后18 d表達量達到峰值(圖7-B)。為了探究OsP5CS蛋白亞細(xì)胞定位，將融合表達載體(GFP為綠色熒光蛋白)高濃度質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入水稻原生質(zhì)體，過夜培養(yǎng)后激光共聚焦顯微鏡下觀察OsP5CS定位情況。結(jié)果顯示，OsP5CS-GFP融合蛋白的綠色熒光主要出現(xiàn)在胞質(zhì)(圖7-C)。因此OsP5CS定位于胞質(zhì)。

表4 候選區(qū)域內(nèi)的24個開放閱讀框

A—P5CS蛋白的進化樹分析；B—對水稻、小麥、高粱、擬南芥、玉米中OsP5CS同源蛋白氨基酸序列進行比對，紅色字和方框表示fse4突變體中氨基酸殘基突變位點，該位點在上述物種中高度保守。GenBank蛋白序列登錄號：水稻，XP_015640176.1；小麥，BAD97364.1；高粱，ACU65227.1；擬南芥，NP_191120.2；玉米，NP_001339256。

Fig. 6. Conservation analysis of P5CS and its homologous protein sequences.

A, B—OsP5CS基因在莖、葉、根、穗等不同組織（A）和不同花后天數(shù)胚乳（B）中的表達水平，水稻Ubiquitin為內(nèi)參基因。C—pAN580-GFP空載體作為對照（上圖），融合載體OsP5CS-GFP在水稻原生質(zhì)體中表達（下圖）。標(biāo)尺為5 μm。

Fig. 7. Tissue expression ofgene and subcellular localization of OsP5CS protein.

2.8 成熟種子中氨基酸含量分析

由于候選基因參與脯氨酸(Pro)的生物合成，所以我們對突變體米粉中水解氨基酸含量進行測定。結(jié)果顯示，突變體的米粉除天冬氨酸(Asp)、賴氨酸(Lys)、甘氨酸(Gly)外，其他測定氨基酸較野生型均有不同程度下降，如谷氨酸(Glu)和脯氨酸(Pro)含量分別下降32.2%和11.1%(圖8-A)。突變體米粉中水解氨基酸總量較野生型降低9.6%(圖8-B)。

SDS-PAGE結(jié)果顯示，野生型與突變體蛋白含量差異明顯(圖1-C)，但二者氨基酸總量卻相差不到1%(圖3-C、圖8-B)。因此我們對米粉中游離氨基酸含量(Free amino acids，F(xiàn)AA)進行測定。結(jié)果顯示，突變體的米粉中游離脯氨酸、精氨酸(Arg)占FAA總量比例較野生型升高33.3%和265.5%；游離谷氨酸占FAA總量比例較野生型降低57.7%(圖8-E)。有文獻報道，精氨酸、谷氨酸等氨基酸與植物體內(nèi)脯氨酸合成相關(guān)[32]，突變體谷氨酸比例下降，精氨酸比例大幅上升，說明突變后籽粒中脯氨酸合成通路受到嚴(yán)重影響。此外，突變體米粉中各組分游離氨基酸含量均顯著上升(圖8-C)，游離氨基酸總量是其野生型的3.6倍(圖8-D)。說明突變影響種子胚乳中氨基酸的合成與代謝。

A—野生型與突變體fse4中米粉中水解氨基酸含量；B—野生型與fse4中水解氨基酸總量；C—野生型與fse4米粉中游離氨基酸含量；D—野生型與fse4米粉中游離氨基酸總量；E—野生型與突變體fse4中米粉中游離氨基酸的相對含量; n=3, 取平均值；采用t檢驗，*P<0.05, ** P<0.01。

Fig. 8. Analysis of amino acid composition in rice flour.

2.9 施加外源脯氨酸后突變體fse4萌發(fā)缺陷表型得到部分恢復(fù)

OsP5CS是谷氨酸途徑中合成脯氨酸的關(guān)鍵限速酶，因此我們施加外源脯氨酸，觀察突變體種子萌發(fā)的變化。將10粒突變體種子放入10 mmol/L 脯氨酸溶液, 10 d后突變體種子長出1~2 cm的嫩芽，部分種子生出幼根(圖9-C, E)。對照組使用蒸餾水發(fā)芽，放入同樣光照培養(yǎng)箱中，同等條件處理。10 d浸潤在蒸餾水中的突變體種子僅能長出不超過5 mm長度嫩芽，大部分種子僅長出1~2 mm芽，種子沒有根生成(圖9-B, E)。與使用蒸餾水發(fā)芽的野生型種子相比，使用10 mmol/L脯氨酸溶液浸泡的野生型種子發(fā)芽10 d后生長受到抑制，無根生成，芽長顯著降低(圖9-A, D)?？梢?，外源施加10 mmol/L濃度脯氨酸溶液使野生型種子生長受到抑制，但突變體萌發(fā)缺陷可以得到部分恢復(fù)。

3 討論

本研究通過對粉質(zhì)皺縮胚乳突變體的研究，精細(xì)定位了基因，并測序發(fā)現(xiàn)突變體中發(fā)生單個堿基的變異，導(dǎo)致編碼的蛋白質(zhì)第16個氨基酸殘基發(fā)生突變，該位點在植物中高度保守（圖6-B），因此很可能是OsP5CS功能缺陷突變體。OsP5CS的突變很可能造成氨基酸合成和代謝的紊亂，并進一步影響蛋白的合成，這與我們的SDS-PAGE鑒定和氨基酸含量測定結(jié)果吻合（圖1-C，圖8-A、C）。同時，補充外源脯氨酸部分恢復(fù)了突變體的缺陷表型（圖9-C）。擬南芥缺失突變體同樣表現(xiàn)為種子皺縮，胚胎發(fā)育異常，種子萌發(fā)受到抑制[33]，這與突變體胚乳粉質(zhì)皺縮且胚發(fā)育異常的表型極為相似（圖1-A~B）。綜上所述，我們認(rèn)為基因突變造成了突變體的表型。

A—野生型寧粳3號在蒸餾水（上）和10 mmol/L脯氨酸溶液（下）中萌發(fā)10 d后表型；B, C—突變體fse4在蒸餾水（B）和10 mmol/L脯氨酸溶液（C）中萌發(fā)10 d后表型；D, E—野生型寧粳3號（D）和fse4 (E)分別在蒸餾水以及10 mmol/L脯氨酸溶液中萌發(fā)10 d后的芽長，n=3，取平均值；采用t檢驗，**P<0.01。標(biāo)尺為1 cm。

Fig. 9. Partial recovery of themutant phenotype after application of exogenous proline.

根據(jù)起始底物的不同，植物中脯氨酸的合成分為谷氨酸途徑和鳥苷酸途徑兩種[34]。在非脅迫和高氮條件下，由鳥氨酸途徑合成脯氨酸；在滲透脅迫和低氮條件下由谷氨酸途徑合成脯氨酸[34]。P5CS是谷氨酸途徑關(guān)鍵限速酶，在脅迫條件下，基因表達活性增加[35]。精氨酸是鳥苷酸合成的前體氨基酸[36-37]。米粉中游離氨基酸含量測定結(jié)果顯示，突變體中各組分游離氨基酸含量較野生型寧粳3號顯著升高（圖8-C），總量達到野生型的3.6倍（圖8-D），這也解釋了為什么利用凱氏定氮法測定的野生型和突變體蛋白質(zhì)含量差異并不大，但SDS-PAGE電泳圖譜卻顯示突變體中儲藏蛋白積累極顯著下降。進一步分析發(fā)現(xiàn)，突變體中游離精氨酸較野生型升高265.5%，游離谷氨酸較野生型下降57.7%，游離脯氨酸含量升高33.3%（圖8-E）。這表明突變后，植株脯氨酸合成途徑變化劇烈，鳥苷酸合成途徑增強，谷氨酸合成途徑受到抑制。米粉中水解氨基酸含量測定結(jié)果顯示，突變體谷氨酸含量較野生型下降32.2%，精氨酸含量與野生型相當(dāng)，脯氨酸含量下降11.1%（圖8-A）。這表明由于脯氨酸合成的缺陷，影響了其他氨基酸的合成和代謝，造成胚乳中蛋白的合成存在缺陷，最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成的原料（游離氨基酸）大量積累。

前人研究表明，10 mmol/L的外源脯氨酸能夠有效緩解苜蓿受到的鹽脅迫，更高濃度的脯氨酸則對植株產(chǎn)生毒害[38]。用大于10 mmol/L的外源脯氨酸處理擬南芥幼苗，植株生長受到明顯抑制，根長變短，線粒體和葉綠體結(jié)構(gòu)改變，誘發(fā)細(xì)胞死亡[39]。本研究中施加10 mmol/L外源脯氨酸時，野生型種子發(fā)育遲緩，根生長受到抑制（圖9-A），而突變體胚發(fā)育缺陷表型得到部分恢復(fù)，長出1~2 cm嫩芽，部分種子生出幼根（圖9-C, E）。表明突變體體內(nèi)脯氨酸不足與其胚發(fā)育缺陷直接相關(guān)。

我們的研究表明脯氨酸的合成缺陷導(dǎo)致胚乳和胚的發(fā)育形成一系列缺陷，但脯氨酸合成如何影響胚乳發(fā)育以及淀粉的合成與積累還需要進一步研究。

謝辭：感謝農(nóng)業(yè)部長江中下游粳稻生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室、江蘇省現(xiàn)代作物生產(chǎn)中心和江蘇省植物基因工程技術(shù)研究中心對本研究給予的資助。

[1] 謝華安, 張建福, 王烏齊,鄭家團, 黃庭旭. 超級稻育種實踐和前景. 分子植物育種, 2006, 4(S3): 4-10.

Xie H A, Zhang J F, Wang W Q, Zheng J T, Huang T X. Practice and prospect on breeding of super-hybridization rice in China., 2006, 4(3S): 4-10. (in Chinese with English abstract)

[2] 武小金, 尹華奇. 雜交水稻品質(zhì)改良的遺傳基礎(chǔ)和途徑. 雜交水稻, 1994(2): 5-8.

Wu X J, Yin H Q. Genetic basis of and approach to grain quality improvement in hybrid rice.,1994(2): 5-8. (in Chinese with English abstract)

[3] 盧毅, 路興花, 張青峰, 余建國, 肖雄雄, 龐林江, 成紀(jì)予. 稻米直鏈淀粉與米飯物性及食味品質(zhì)的關(guān)聯(lián)特征研究.食品科技, 2018, 43(10): 219-223.

Lu Y, Lu X H, Zhang Q F, Yu J G, Xiao X X, Pang L J, Cheng J Y. Correlation of rice amylose with physical properties and taste quality of rice., 2018, 43(10): 219-223. (in Chinese with English abstract)

[4] Seferoglu A B, Koper K, Can F B, Cevahir G, Kavalir I H. Enhanced heterotetrameric assembly of potato ADP-Glucose pyrophosphorylase using reverse genetics., 2014, 55(8): 1473-1483.

[5] Dian W, Jiang H, Chen Q, Liu F, Wu P. Cloning and characterization of the granule-boundgene in rice: gene expression is regulated by the nitrogen level, sugar and circadian rhythm., 2003, 218(2): 261-268.

[6] 陳雅玲, 包勁松. 水稻胚乳淀粉合成相關(guān)酶的結(jié)構(gòu)、功能及其互作研究進展. 中國水稻科學(xué), 2017, 31(1): 1-12.

Chen Y L, Bao J S. Progress in structures, function and interactions of starch synthesis related enzymes in rice endosperm., 2017, 31(1): 1-12. (in Chinese with English abstract)

[7] 潘鵬屹, 朱建平, 王云龍, 郝媛媛, 蔡躍, 張文偉, 江玲, 王益華, 萬建民. 水稻粉質(zhì)胚乳突變體的表型分析及基因克隆. 中國水稻科學(xué), 2016, 30(5): 447-457.

Pan P Y, Zhu J P, Wang Y L, Hao Y Y, Cai Y, Zhang W W, Wang Y H, Wan J M.Phenotyping and gene cloning of a floury endosperm mutantin rice., 2016, 30(5): 447-457.(in Chinese with English abstract)

[8] 方鵬飛, 李三峰, 焦桂愛, 謝黎紅, 胡培松, 魏祥進, 唐紹清. 水稻粉質(zhì)胚乳突變體的理化性質(zhì)及基因定位. 中國水稻科學(xué), 2014, 28(5): 447-457.

Fang P F, Li S F, Jiao G A, Xie L H, Hu P S, Wei X J, Tang S Q. Physicochemical property analysis and gene mapping of a floury endosperm mutantin rice., 2014, 28(5): 447-457.(in Chinese with English abstract)

[9] Kaushik R P, Khush G S. Genetic analysis of endosperm mutants in rice (L.)., 1991, 83(2): 146-152.

[10] She K, Kusano H, Koizumi K, Yamakawa H, Hakata M, Imamura T, Fukuda M, Naito N, Tsurumaki Y, Yaeshima M, Tsuge T, Matsumoto K, Kudoh M, Itoh E, Kikuchi S, Kishimoto N, Yazaki J, Ando T, Yano M, Aoyama T, Sasaki T, Satoh H, Shimada H. A novel factoris involved in regulation of rice grain size and starch quality., 2010, 22(10): 3280-3294.

[11] Kang H, Park S, Matsuoka M, An G. White-core endospermin rice is generated by knockout mutations in the C4-type pyruvate orthophosphate dikinase gene ()., 2005, 42(6): 901-911.

[12] Peng C, Wang Y, Liu F, Ren Y, Zhou K N, Lü J, Zheng M, Zhao S L, Zhang L, Wang C M, Jiang L, Zhang X, Guo X P, Bao Y Q, Wan J M.encodes a CBM48 domain-containing protein involved in compound granule formation and starch synthesis in rice endosperm., 2014, 77(6): 917-930.

[13] Zhang L, Ren Y, Lu B, Yang C Y, Feng Z M, Liu Z, Chen J, Ma W W, Wang Y, Yu X W, Wang Y L, Zhang W W, Wang Y H, Liu S J, Wu F Q, Zhang X, Guo X P, Bao Y Q, Jiang L, Wan J M.encodes a regulator of starch synthesis and amyloplast development essential for peripheral endosperm development in rice., 2016, 67(3): 633-647.

[14] Wu M M, Ren Y L, Cai M H, Wang Y L, Zhu S S, Zhu J P, Hao Y Y, Teng X, Zhu X P, Jing R N, Zhang H, Zhong M S, Wang Y F, Lei C L, Zhang X, Guo X P, Cheng Z J, Lin Q B, Wang J, Jiang L, Bao Y Q, Wang Y H, Wan J M. Riceencodes a pentatricopeptide repeat protein that is essential for the trans-splicing of mitochondrialintron 1 and endosperm development., 2019, 233: 736-750.

[15] Teng X, Zhong M S, Zhu X P, Wang C M, Ren Y L, Wang Y L, Zhang H, Jiang L, Wang D, Hao Y Y, Wu M M, Zhu J P, Zhang X, Guo X P, Wang Y H, Wan J M.encoding a NAD-dependent cytosolic malate dehydrogenase plays an important role in starch synthesis and seed development in rice., 2019, 17: 1914-1927.

[16] Long W, Wang Y, Zhu S,Jing W, Wang Y H, Ren Y L, Tian Y L, Liu S J, Liu X, Chen L M, Wang D, Zhong M S, Zhang Y Y, Hu T T, Zhu J P, Hao Y Y, Zhu X P, Zhang W W, Wang C M, Zhang W H, Wan J M.connects phospholipid metabolism and amyloplast development in rice., 2018, 177(2): 698-712.

[17] 李景芳, 田云錄, 劉喜, 劉世家, 陳亮明, 江玲, 張文偉, 徐大勇, 王益華, 萬建民. 鳥苷酸激酶OsGK1對水稻種子發(fā)育至關(guān)重要. 中國水稻科學(xué), 2018, 32(5): 415-426.

Li J F, Tian Y L, Liu X, Liu S J, Chen L M, Jiang L, Zhang W W, Xu D Y, Wang Y H, Wan J M.The guanylate kinaseOsGK1is essential for seed development in rice.,2018, 32(5): 415-426. (in Chinese with English abstract)

[18] 于艷芳, 劉喜, 田云錄, 劉世家, 王云龍, 張文偉, 江玲, 王益華, 萬建民. 水稻粉質(zhì)胚乳突變體的表型分析及基因定位. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2018, 51(11): 2023-2037.

Yu Y F, Liu X, Tian Y L, Liu S J, Wang Y L, Zhang W W,Jiang L, Wang Y H, Wan J M. Phenotypic analysis and gene mapping of a floury and shrunken endosperm mutantin rice., 2018, 51(11): 2023-2037. (in Chinese with English abstract)

[19] Zhang C S, Lu Q, Verma D P S. Removal of feedback inhibition of Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase, a bifunctional enzyme catalyzing the first two steps of proline biosynthesis in plants.1995, 270(35): 20491-20496.

[20] Lehmann S, Funck D, Szabados L,Rentsch D. Proline metabolism and transport in plant development., 2010, 39(4): 949-962.

[21] Hu C, Delauney A J, Verma D. Bifunctional enzyme (Delta-1-pyrroline-5-carboxylate synthetase) catalyzes the 1st 2 steps in proline biosynthesis in plants., 1992, 89(19): 9354-9358.

[22] Kim G, Nam Y. A novel Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase gene of medicago truncatula plays a predominant role in stress-induced proline accumulation during symbiotic nitrogen fixation., 2013, 170(3): 291-302.

[23] Zang D, Wang C, Ji X, Wang Y C. Tamarix hispida zinc finger protein ThZFP1 participates in salt and osmotic stress tolerance by increasing proline content and SOD and POD activities., 2015, 235: 111-121.

[24] Su M, Li X, Ma X, Peng X J, Zhao A G, Cheng L Q, Chen S Y, Liu G S. Cloning two P5CS genes from bioenergy sorghum and their expression profiles under abiotic stresses and MeJA treatmen., 2011, 181(6SI): 652-659.

[25] Chu H M, Nguyen T T H, Chu H L, Le V S, Chu H H. Characteristics of the gene encoding pyrroline-5- carboxylate synthase (P5CS) in Vietnamese soybean cultivars (L. Merrill)//Proceedings of International Conference on Biology, Environment and Chemistry, 2011: 319-323.

[26] Chen J B, Yang J W, Zhang Z Y, Feng X F, Wang S M. Twogenes from common bean exhibiting different tolerance to salt stress in transgenic., 2013, 92(3): 461-469.

[27] Kim D, Shibato J, Agrawl G K, Fujihara S, Iwahashi H, Kim du H, Shim IeS, Rakwal R. Gene transcription in the leaves of rice undergoing salt-induced morphological changes (L.)., 2007, 24(1): 45-59.

[28] Wan P, Fu K, Lu F, Guo W C, Li G Q. A putative Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase involved in the biosynthesis of proline and arginine in., 2014, 71: 105-113.

[29] Bicknell L S, Pitt J, Aftimos S, Ramadas R, Maw M A, Robertso S P. A missense mutation in, encoding Delta 1-pyrroline-5-carboxylate synthase (P5CS), causes an autosomal recessive neurocutaneous syndrome., 2008, 16(10): 1176-1186.

[30] 易健明, 屈武斌, 張成崗. 實時熒光定量PCR的數(shù)據(jù)分析方法. 生物技術(shù)通訊, 2015, 26(1): 140-145.

Yi J M, Qu W B, Zhang C G. Date analysis methods of real-time fluorescent quantitative PCR., 2015, 26(1): 140-145. (in Chinese with English abstract)

[31] Wang Y, Wang C, Zheng M,Lyu J, Xu Y, Li X H, Niu M, Long W H, Wang D, Wang H Y, Terzaghi W, Wang Y H, Wan J M., a Val-tRNA synthetase regulating chloroplast ribosome biogenesis in rice, is essential for early chloroplast development., 2016, 170(4): 2110-2123.

[32] Hong Z L, Karuna L, Zhang Z M, Verma D. Removal of feedback inhibition of 1-pyrroline-5-carboxylate synthetase results in increased proline., 2000, 122(4): 1129-1136.

[33] Székely G, ábrahám E, Csépl? A, Rigó G, Zsigmond L, Csiszár J, Ayaydin F, Strizhov N, Jásik J, Schmelzer E, Koncz C, Szabados L. Duplicatedgenes ofplay distinct roles in stress regulation and developmental control of proline biosynthesis., 2008, 53(1): 11-28.

[34] Deauney A J, Verma D. Proline biosynthesis and osmoregulation in plants., 1993 4(2): 215-223.

[35] Siripornadulsil S, Traina S, Verma D, Richard T. Sayre molecular mechanisms of proline-mediated tolerance to toxic heavy metals in transgenic microalgae., 2002, 14(11): 2837-2847.

[36] Makryaleas K, Drauz K, Bommarius A. Method for the preparation of-arginine and-ornithine., 1997(5): 591-613.

[37] Kurhajec A. Orgithine aynthesis.1961(3): 168-588.

[38] Ehsanpour A A, Fatahian N. Effects of salt and proline oncallus., 2003, 73(1): 53-56.

[39] Trovato M, Mattioli R, Costantino P. Multiple roles of proline in plant stress tolerance and development., 2008, 19(4): 325-346.

Phenotypic Analysis and Gene Cloning of Rice Floury Endosperm Mutant

DU Yimo, PAN Tian, TIAN Yunlu, LIU Shijia, LIU Xi, JIANG Ling, ZHANG Wenwei, WANG Yihua*,WAN Jianmin

(,,,,;Corresponding author, E-mail: yihuawang@njau.edu.cn)

Starch is the main energy reserve of rice endosperm. The biosynthesis of starch is complex, requiring a large number of synthetic enzymes and regulators. Screening rice endosperm defective mutants and cloning the underlying geneswill lay theoretical basis for starch biosynthesis and its regulation.A stable genetic floury and shrunken endosperm mutant termed as() were obtained from the mutant library of Ningjing 3 (WT), which was induced by N-methyl-N-nitrosourea (MNU). An F2mapping population was generated by crossing themutant with Dular (anrice variety) and the gene was finally isolated. The floury seeds segregated from theheterozygous plants were used to observe the morphological features, and the physicochemical properties of the brown rice flour were analyzed. The endosperm structure was observed with a scanning electron microscopy by the semi-thin section technology. The expression of starch synthesis related genes during grain filling was determined by qRT-PCR; Immunoblotting was used to detect the accumulation of proteins related to starch synthesis.The amino acids contents of each mature endosperm were determined with the fully automatic amino acid analyzer.The 1000-grain weight and grain size were significantly reduced in. Compared with WT, the contents of total starch, amylose and total protein were signi?cantly lower in, while the lipid content was signi?cantly higher. The starch viscosity, breakdown viscosity and setback viscosity of themutant were lower than WT. The endosperm of the mutant had many single dispersed starch granules with large spaces between each other. Using 1568 recessive individuals,was narrowed down to a 252 kb region.Sequencing revealed a single base substitution in the first exon of the delta 1-pyrroline-5-carboxylate synthetase (P5CS), resulting in a conserved amino acid variation.Most of the genes related to starch synthesis were downregulated inand the protein accumulation related to starch synthase were reduced. The contents of various amino acids inrice flour were increased or decreased, the total free amino acids contents inseeds was 2.6 times higher than those in WT. Exogenous proline was applied during the germination ofseeds, and the embryonic lethal phenotype was partially recovered.encode the key rate-limiting enzyme P5CS of proline synthesis, which plays an important role in the biosynthesis and metabolism of amino acids in endosperm and affects the accumulation of starch.

floury endosperm; starch synthesis; gene cloning; delta 1-pyrroline-5-carboxylate synthetase;amino acid synthesis and metabolism

Q343.5; S511.032

A

1001-7216(2019)06-0499-14

10.16819/j.1001-7216.2019. 9058

2019-05-27；

2019-06-18。

國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(2016ZX08001006)；國家重點研發(fā)計劃資助項目(2016YFD0100101-08)；江蘇省重點研發(fā)項目(BE2018388, BE2017368)。