雷燕妮，崔嬌嬌，張小斌

(1.商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院,陜西 商洛 726000；2.商洛學(xué)院 健康管理學(xué)院, 陜西 商洛 726000)

杜仲屬杜仲科杜仲屬，又名絲綿木、絲連木、扯絲皮[1]，收錄于《中國(guó)珍稀瀕危保護(hù)植物名錄植物(第一冊(cè))》[2]，并成為國(guó)家的二級(jí)保護(hù)植物。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)以杜仲的樹(shù)皮為藥，近幾十年國(guó)內(nèi)外學(xué)者的大量研究表明杜仲葉和杜仲皮的化學(xué)成分基本一致,其中有效成分(如綠原酸)比杜仲皮中的含量要高，王亞琴[3]指出主要為木脂素類(lèi)、環(huán)烯醚萜類(lèi)、黃酮類(lèi)、氨基酸、有機(jī)酸以及其他微量元素。當(dāng)前查閱大多數(shù)文獻(xiàn)顯示杜仲對(duì)于人體肥胖、心腦血管疾病以及癌癥的治療都有一定的促進(jìn)作用，其中比較顯著的是對(duì)于機(jī)體消化道疾病的治療；研究還發(fā)現(xiàn)杜仲的次生代謝產(chǎn)物綠原酸對(duì)腫瘤的治療和防御有著顯著的作用。因此杜仲逐漸被廣泛應(yīng)用在醫(yī)療和保健品的生產(chǎn)上。杜仲為木本的植物，組織培養(yǎng)的難度比較大[4]，左春芬等[5]第一批進(jìn)行杜仲組培的研究，將杜仲幼嫩的樹(shù)枝當(dāng)外植體，對(duì)于愈傷組織有誘導(dǎo)作用，然而無(wú)法獲取再生的植株。1994年，夏啟忠與宋太偉等[6]人將杜仲實(shí)生苗的莖尖當(dāng)作外植體，可以獲取杜仲再生的植株。在這之后，相應(yīng)的報(bào)道逐漸呈現(xiàn)出來(lái)，杜仲組織培養(yǎng)技術(shù)開(kāi)始進(jìn)入初始發(fā)展階段。筆者研究用不同外源激素配比對(duì)商洛杜仲愈傷組織進(jìn)行處理，探討影響綠原酸含量的最佳激素組合。以綠原酸含量為考察指標(biāo)，通過(guò)高效液相色譜法測(cè)定，確定誘導(dǎo)杜仲愈傷組織形成的最佳外源激素和培養(yǎng)基，給杜仲離體的快速繁殖打下基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

杜仲葉采于商洛市丹江公園，并經(jīng)中國(guó)中醫(yī)研究院商洛GAP科研工程中心鑒定為杜仲科杜仲屬的葉子。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

色譜試劑(一級(jí))選擇甲醇，水是純化水，色譜純乙腈，色譜純磷酸，其他試劑均為分析純。對(duì)照品選擇綠原酸，選自中國(guó)藥品生物制品的檢定所 ,供含量測(cè)定用)。所用MS培養(yǎng)基﹙BR，選擇上海宇涵生物科技有限公司，其批號(hào)為 )；2,4-二氯苯氧乙酸 (CP，上海試四赫維化工有限公司，批號(hào):080414﹚6-芐氨基嘌呤﹙6-BA)(BR，上海伯奧生物科技有限公司，批號(hào):080212)；萘乙酸(NAA，選自上海振企化學(xué)試劑有限公司，其批號(hào)為100415)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

HPLC(Agilent 1200，配備四元泵，柱溫箱、VWD的檢測(cè)器與真空脫氣機(jī))；數(shù)控超聲波清洗機(jī)(KQ-600DB)；電子天平(Sartorius，精確度0.0001 g)；過(guò)濾器(0.45 μm)；冷凍干燥系統(tǒng)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

實(shí)驗(yàn)中采用MS培養(yǎng)基，將PH調(diào)整為6.0,分裝后再在121℃,1.06 kg·cm-2的高壓滅菌鍋下滅菌20 min，在22±1℃條件下、光照強(qiáng)度為1 500～2 000 LX、一天進(jìn)13 h的光照，形成愈傷組織，在20 d以后對(duì)誘導(dǎo)率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，對(duì)愈傷組織的生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)行觀察。

2.2 取材、消毒

實(shí)驗(yàn)前，先將杜仲嫩葉用自來(lái)水沖洗2 h，之后選用洗衣粉進(jìn)行浸泡處理，浸泡時(shí)長(zhǎng)20 min，選用清水沖洗20 min后將其置于已滅菌處理的燒杯中，向里面加入75 %(V/V)的酒精進(jìn)行殺菌處理，時(shí)長(zhǎng)2 min，完成后選用無(wú)菌水進(jìn)行沖洗，頻數(shù)3～4次，之后向里面加入0.1%wt的升汞溶液進(jìn)行浸泡處理，時(shí)長(zhǎng)為5 min，繼續(xù)重復(fù)無(wú)菌水沖洗步驟，結(jié)束之后，經(jīng)無(wú)菌濾紙吸干水分，備用。

2.3 不同植物生長(zhǎng)激素對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)效應(yīng)

選用的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑有2,4-D、6-BA和NAA，實(shí)驗(yàn)時(shí)選用的三種配方主要是上面三種。將植物的葉片作為外植體，經(jīng)過(guò)上述殺菌消毒步驟處理后將其置于超凈工作臺(tái)上切割成相同大小的小塊(5 mm×5 mm)留待備用，每瓶中放入4塊切割好的小塊。進(jìn)行30 d的接種之后，對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2.4 設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)

參照前人的單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇影響愈傷組織中綠原酸的含量多少的三個(gè)主要激素：2,4-D、6-BA和NAA，并取各自的不同水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。具體做法：準(zhǔn)確稱(chēng)取粉末9份，選擇不同濃度的2,4-D、6-BA和NAA為參試因子，以綠原酸的含量為衡量指標(biāo)，增殖培養(yǎng)基的篩選采用L9實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表布置實(shí)驗(yàn) 。

表1 正交實(shí)驗(yàn)的因素水平

2.5 色譜條件

HPLC色譜柱為HypersilC18-ODS柱(規(guī)格：250 mm×4.6 mm，5 μm)，其中乙腈-水-磷酸溶液(12∶87.9∶0.1)作為流動(dòng)相；在327 nm條件下進(jìn)行樣品的檢測(cè)；分別控制流速和柱溫為1.0 mL·min-1和25℃；一次性進(jìn)樣量控制在10 μL，選用面積外標(biāo)法測(cè)定含量。

2.6 對(duì)照品溶液的制備

對(duì)綠原酸的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行精密稱(chēng)取，稱(chēng)取2.5 mg，放置在50 mL的容量瓶之中，選用甲醇溶解定容，溶液搖勻。此時(shí)得濃度為0.050 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)綠原酸樣品，避光保存?zhèn)溆谩?/p>

2.7 供試樣品溶液的制備

杜仲葉愈傷組織60 ℃烘干至恒重，粉碎過(guò)60目篩，精密稱(chēng)取杜仲愈傷組織各0.2 g置于10 mL容量瓶中，向里面加入9 mL 50%(V/V)的甲醇，將其置于超聲波清洗機(jī)中60 min進(jìn)行提取處理，完成后提出將其置于室溫，搖勻，進(jìn)行過(guò)濾操作。將濾液定容至10 mL容量瓶中，選用微孔濾膜對(duì)樣品進(jìn)行過(guò)濾處理，此時(shí)即得目標(biāo)溶液[7]。

2.8 方法學(xué)考察

2.8.1 線性關(guān)系考察 精密量取綠原酸0.050 mg·mL-1，作為對(duì)照液1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 mL，在10 mL的容量瓶之中經(jīng)甲醇進(jìn)行稀釋?zhuān)♂尩娇潭?，混勻。將已稀釋不同濃度的?biāo)準(zhǔn)樣品溶液進(jìn)行吸取，測(cè)定。橫坐標(biāo)、縱坐標(biāo)分別是綠原酸的濃度與峰面積，將標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制完成。

2.8.2 精密度試驗(yàn) 在同份對(duì)照品中準(zhǔn)確吸取溶液，重復(fù)進(jìn)樣，頻數(shù)為5次，每次10 μL，將其置于HPLC下進(jìn)行測(cè)定并記錄下樣品的峰面積。

2.8.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 在同份對(duì)照品中準(zhǔn)確吸取溶液，在0、2、8、16、20 h分別進(jìn)樣，進(jìn)樣量10 μL，記錄色譜峰面積。

2.8.4 重復(fù)性試驗(yàn) 根據(jù)記錄供試品的溶液制備方式，在同等條件下制備5分樣液，進(jìn)樣，每份樣品10 μL，并分別記錄色譜峰面積。

2.8.5 準(zhǔn)確度考察 準(zhǔn)確度的考察選用加樣回收實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證，精密稱(chēng)取5份已經(jīng)制備好的綠原酸樣品，每份樣品中加入 0.2 g，另做一對(duì)照性試驗(yàn)，依照2.7的方法進(jìn)行樣品溶液的制備，一次10 uL的進(jìn)樣量，對(duì)色譜峰的面積進(jìn)行記錄。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 愈傷組織中綠原酸含量的測(cè)定

3.1.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別精密吸取對(duì)照品溶液、杜仲愈傷組織的同一供試品溶液進(jìn)樣，測(cè)定。從圖1、圖2可見(jiàn)圖譜。

供試品中綠源酸色譜峰與對(duì)照品色譜峰保留時(shí)間一致，并與其他峰的分離度大于1.5，達(dá)到基線分離。

3.1.2 線性關(guān)系 精密量取50 μg·mL-1L的綠原酸對(duì)照液1，2，3，4，5，6，7，8，9，10 mL，在10 mL的容量瓶之中經(jīng)甲醇進(jìn)行稀釋?zhuān)♂尩娇潭龋靹?，將液相色譜儀注入，濃度與峰面積的比值見(jiàn)圖3。

由圖3可以得出，綠原酸回歸方程為：Y=35765X-21065，R2=0.9992。結(jié)果表明綠原酸在5.0～50.0 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.1.3 精密度試驗(yàn) 精密稱(chēng)取10 μL濃度為50 μg·mL-1的綠原酸對(duì)照品溶液，重復(fù)五次，按照色譜條件優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得結(jié)果為表2。

圖1 對(duì)照品HPLC色譜

圖2 供試品HPLC色譜

圖3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

由表2可看出，綠原酸平均峰面積積分值為1808127.2，RSD為0.25%，精密度良好。

3.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 在同份對(duì)照品中準(zhǔn)確吸取溶液，在0、2、8、16、20 h分別進(jìn)樣，進(jìn)樣量10 μL，記錄色譜峰面積，測(cè)得結(jié)果如表3所示。

由表3的數(shù)據(jù)分析出，綠原酸的平均峰面積值為1708001.3，RSD為1.9%。表明供試品溶液穩(wěn)定。

3.1.5 重現(xiàn)性試驗(yàn) 依照2.7中溶液的制備方法制備五份樣品，每一份樣品選10 μL進(jìn)樣檢測(cè)，記錄色譜峰面積。結(jié)果如表4所示。

由表4可以得到，綠原酸的含量平均值1.25 mg·L-1，RSD%為1.8%。該結(jié)果顯示選用本方法有著良好的重現(xiàn)性。

3.1.6 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 選擇加樣回收實(shí)驗(yàn)，對(duì)綠原酸含量0.2 g樣品稱(chēng)取，重復(fù)稱(chēng)取五次，向里面加入一定量的綠原酸對(duì)照品進(jìn)行樣品溶液的制備。一次10 uL的進(jìn)樣量，對(duì)色譜峰的面積進(jìn)行記錄。結(jié)果見(jiàn)表5。

由表5可見(jiàn)，經(jīng)高效液相色譜方法分析綠原酸的含量，得出回收率平均值98.23%，而相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的偏差是1.11%，說(shuō)明系統(tǒng)有較好的回收率，穩(wěn)定性較強(qiáng)。

3.1.7 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果 將選用的供試品按順序進(jìn)行編號(hào)之后，依照相對(duì)應(yīng)的制備方法進(jìn)行制備處理。依次精密量取不同編號(hào)的樣品溶液10 μL，依據(jù)色譜條件的優(yōu)化結(jié)果測(cè)定進(jìn)樣，測(cè)得結(jié)果見(jiàn)表6。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

表4 重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

表5 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

極差分析 以綠原酸作為指標(biāo)時(shí)，影響因素的大小順序?yàn)椋築>C>A。則對(duì)綠原酸含量影響的激素作用為：2,4-D>6-BA>NAA。

從表6看出最佳培養(yǎng)基激素的條件為A3B3C2，即6-BA的濃度為1 mg·L-1，2,4-D的濃度1.0 mg·L-1，NAA的濃度為0.5 mg·L-1。在MS培養(yǎng)基中，激素為濃度為1 mg·L-1的6-BA、1 mg·L-1的2,4-D、0.5 mg·L-1的NAA時(shí)，將得到綠原酸的最高含量為1.58 mg·g-1。

實(shí)驗(yàn)研究查閱了大量相關(guān)文獻(xiàn)，采用正交實(shí)驗(yàn)分析法對(duì)三種激素的種類(lèi)及其濃度進(jìn)行篩選，此次試驗(yàn)經(jīng)HPLC法對(duì)愈傷組織之中的綠原酸含量進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)實(shí)施加樣回收的試驗(yàn)、系統(tǒng)適用性的試驗(yàn)與精密度試驗(yàn)等，使實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)更為準(zhǔn)確。

4 結(jié)論和討論

研究采用MS培養(yǎng)基對(duì)杜仲愈傷組織進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)高效液相色譜方法對(duì)杜仲愈傷組織之中的綠原酸含量進(jìn)行測(cè)定。測(cè)得綠原酸含量在0.05～0.5 mg·L-1范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系(Y=35765X-21065，r=0.9992)。正交試驗(yàn)結(jié)果表明：影響杜仲愈傷組織的誘導(dǎo)順序：綜合分析杜仲葉片誘導(dǎo)愈傷組織最佳培養(yǎng)基為:MS +1 mg·L-1·2,4-D + 1 mg·L-1·6-BA + 0. 5 mg·NAA，在外源激素濃度1.0 mg·L-1的6-BA、1.0mg·L-1的2,4-D、0.5 mg·L-1的NAA時(shí)，測(cè)定愈傷組織中綠原酸的含量，測(cè)得最高的綠原酸的含量達(dá)到1.58 mg·g-1。

表6 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(L9正交設(shè)計(jì))

注：K為綠原酸的計(jì)算值；R為綠原酸的極差值。

表7 綠原酸條件優(yōu)化結(jié)果