徐叢玥 林 款 李超英 茹 琴

(江漢大學武漢生物醫(yī)學研究院，湖北 武漢 430056)

血栓是多種疾病的誘發(fā)因子或并發(fā)癥，在生理病理認識方面，它與中醫(yī)的血瘀證有許多共同之處，活血化瘀療法也是近代中西醫(yī)結合研究中最活躍的領域之一[1]?，F(xiàn)有的抗血栓藥物分為抗血小板藥、抗凝劑類藥物和溶血栓藥/溶纖維蛋白類藥物，不僅價格昂貴且伴有一定的副作用，根據(jù)中國傳統(tǒng)藥食同源理念，結合大健康產(chǎn)業(yè)的相關政策，尋找具有預防血栓形成功效的動植物食品已成為研究熱點。

檸檬含有豐富的檸檬酸、檸檬烯、黃酮類以及VC等營養(yǎng)成分[2]，是一種藥食同源的水果，在《本草綱目拾遺》[3]《嶺南采藥》[4]等書著中均有其用藥記載。Sengun等[5]研究發(fā)現(xiàn)檸檬具有預防心血管疾病的功能，但目前從抗血栓方向進行的研究報道較少，僅有陳岑[6]報道通過體外誘導血小板聚集試驗發(fā)現(xiàn)，檸檬提取物具有較強的抗血小板聚集活性。

腎上腺素急性給藥加冰水應激，會引起血液黏度增高等血液流變學的變化和血管內(nèi)皮損傷，是氣滯血瘀的表現(xiàn)[7]，這種急性血瘀模型已經(jīng)被廣泛使用，而檸檬汁粉對急性血瘀模型大鼠的血液流變狀態(tài)、抗凝途徑及血管內(nèi)皮損傷的影響目前尚未見報道。試驗擬采用急性血瘀模型，以全血黏度、紅細胞沉降率、凝血四項、血栓素B2含量等為評價指標，研究檸檬汁粉體內(nèi)抗血栓的作用及機制，以期為檸檬進一步的開發(fā)應用提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

檸檬：產(chǎn)地四川安岳果；

SPF級昆明大鼠：雌性，體重(200±10) g，動物許可證號SCXK(京)2016-0006，北京維通利華實驗動物技術公司；

凝血酶原時間(prothrombin time，PT)測定試劑盒、凝血酶時間(thrombin time，TT)測定試劑盒、活化部分凝血活酶時間(鞣花酸法)(activated partial thromboplatin time，APTT)測定試劑盒、纖維蛋白原(fibrinogen，F(xiàn)IB)含量測定試劑盒、大鼠6-酮前列腺素F1α(6-keto prostaglandin F1α，6-keto-PGF1α)酶聯(lián)免疫分析試劑盒、大鼠血栓素B2(thromboxane B2，TXB2)酶聯(lián)免疫分析試劑盒、大鼠內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)酶聯(lián)免疫分析試劑盒、大鼠內(nèi)皮素1(endothelin-1，ET-1)酶聯(lián)免疫分析試劑盒：南京建成生物工程研究所；

鹽酸腎上腺素注射液：每支1 mL/mg，遠大醫(yī)藥(中國)有限公司；

阿司匹林腸溶片：25 mg/片，歐意藥業(yè)有限公司。

1.1.2 儀器與設備

高速落地冷凍離心機：J26-XP型，德國Beckman公司；

冷凍干燥機：FD-1A-50型，上海豫明儀器有限公司；

半自動凝血分析儀：SC40型，北京中勤世帝生物技術有限公司；

血液黏度分析儀：HMN-6B型，天津海邁醫(yī)用科技有限公司；

Ⅲ生化培養(yǎng)箱：SPX-150B型，天津市泰斯特儀器有限公司；

酶標儀：MULTISKAN GO型，美國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 檸檬汁粉的制備 參考周玥等[8]的方法并將離心轉(zhuǎn)速稍作調(diào)整。調(diào)整后的方法為：新鮮檸檬經(jīng)洗凈、去皮去籽、切塊后榨汁，過濾，4 000 r/min離心15 min，取上清液冷凍干燥(溫度-65 ℃，壓強11 Pa)，即得檸檬汁粉，干燥器內(nèi)貯藏備用。

1.2.2 大鼠分組及造模 30只雌性SD大鼠隨機分為5組，每組6只，體重(200±20) g，分別為正常組、模型組、陽性對照組(阿司匹林100 mg/kg)、檸檬汁粉低劑量組(150 mg/kg)和檸檬汁粉高劑量組(300 mg/kg)，連續(xù)灌胃給藥7次，早晚各1次(每天早晚8:30給藥，時間間隔12 h)，灌胃量按大鼠體重1 mL/100 g，于第3天、第5次給藥后開始復制急性血瘀模型[9-10]。

第3天下午6:00點第1次皮下注射鹽酸腎上腺素0.8 mg/kg，2 h后冰浴4 min(控制水溫在0～2 ℃)，將大鼠置于冰水中游泳，晚上8:30給第6次藥，于晚上10:00同等劑量注射第2次鹽酸腎上腺素，之后大鼠只給水飼養(yǎng)。第4天上午8:30最后一次給藥，10:00用10%水合氯醛(300 mg/kg)麻醉大鼠，于腹主動脈取血，測量相應的指標[11]。

1.2.3 全血黏度和紅細胞沉降率的測定 全血以肝素抗凝，每1 mL全血添加10～20 U肝素，血液黏度分析儀預熱后，取0.8 mL待測全血放入檢查盤中，測定血液在不同切變率下的黏度。

將血液采集到血沉管固定刻度后，輕輕顛倒2～3次，血沉管插入血沉架上使血液液面與“0”刻度平行，室溫靜置1 h，讀取上層血漿的高度。

1.2.4 凝血四項的測定 血液以體積比1∶9與抗凝劑0.109 mol/L枸櫞酸鈉混勻，輕輕顛倒3～4次混勻后，3 000 r/min 離心15 min，取上清液備用。

(1) 凝血酶原時間(PT)：50 μL待測血漿和100 μL PT試劑在37 ℃中分別預熱10 min，混勻后立刻開始計時。

(2) 活化部分凝血活酶時間(APTT)：取待測血漿50 μL，與50 μL APTT試劑混勻后在37 ℃預熱3 min，然后加入37 ℃預熱的0.025 mol/L CaCl2試劑50 μL，記錄儀器測定結果。

(3) 凝血酶時間(TT)：取待測血漿100 μL，37 ℃預熱3 min，然后加入37 ℃預熱的TT試劑100 μL，記錄儀器測定結果。

(4) 纖維蛋白原含量(FIB)：取待測血漿10 μL，與90 μL 咪唑緩沖液混勻后在37 ℃預熱3 min，然后加入37 ℃預熱的FIB試劑50 μL，記錄儀器測定結果。

1.2.5 血漿6-keto-PGF1α、TXB2、eNOS、ET-1含量的測定 各組血液在室溫下自然凝固20 min，3 000 r/min離心20 min，收集上清液，按試劑盒方法測定各組大鼠血漿6-酮前列腺素F1α(6-keto-PGF1α)、血栓素B2(TXB2)、內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(eNOS)和內(nèi)皮素-1(ET-1)的含量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗結果表示為(平均值±標準差)，數(shù)據(jù)通過SPSS 17.0和Origin分析，采用單因素方差分析顯著性。

2 結果與分析

2.1 檸檬汁粉對急性血瘀大鼠全血黏度的影響

全血黏度(whole blood viscosity，WBV)是血液最重要的流變學特性參數(shù)，是由血細胞比容、紅細胞聚集性、紅細胞變形性、紅細胞表面電荷、血漿黏度、纖維蛋白原含量以及白細胞和血小板流動性等多種因素決定的綜合性指數(shù)。全血黏度越大，血液流動性越小，腦血栓、腦供血不足、心肌梗死和心絞痛的發(fā)病與血液黏度升高有關，增高的程度可反映心肌缺血的嚴重性[12]。

由表1可知，在3種不同的切變率下，模型組大鼠的全血黏度均極顯著高于正常組的(P<0.001)，說明大鼠急性血瘀模型造模成功。與模型組相比，檸檬汁粉高劑量組的全血黏度在各切變率下均極顯著下降，而檸檬汁粉低劑量組的全血黏度雖低于模型組的，但無顯著差異。表明檸檬汁粉高劑量組可以通過改善血液流變性來抑制血栓的形成。

2.2 檸檬汁粉對急性血瘀大鼠紅細胞沉降率的影響

影響血沉速度的因素主要有血漿和紅細胞，當血漿成分或紅細胞數(shù)量與形態(tài)發(fā)生改變時，會使紅細胞間相互排斥而改變血沉速度。血漿中不對稱的大分子物質(zhì)使紅細胞表面的負電荷減少，導致紅細胞沉降加快；而紅細胞數(shù)量增多或變形、血漿黏度降低時，紅細胞下沉時受到的阻力增大使血沉減慢[13]。

表1檸檬汁粉對急性血瘀大鼠全血黏度的影響?

Table1TheeffectoflemonjuicepowderonWBVinratswithacutebloodstasis

mPa·s

? **. 與正常組相比差異極顯著(P<0.01)；##. 與模型組相比差異極顯著(P<0.01)。

圖1顯示，與正常組相比，模型組大鼠的血沉速率極顯著升高；與模型組相比，檸檬汁粉各劑量組的血沉速率極顯著降低，且高劑量組降低急性血瘀大鼠紅細胞沉降速率比低劑量組的慢。說明檸檬汁粉有抗血栓的效果。

2.3 檸檬汁粉對急性血瘀大鼠凝血四項的影響

由表2可知，與正常組相比，模型組大鼠的PT、APTT、TT時間均顯著延長，而FIB含量顯著降低。與模型組相比，無論是低劑量組還是高劑量組，檸檬汁粉干預后大鼠的凝血酶原時間(PT)延長，且高劑量組有顯著差異(P<0.01)，而低劑量組是較顯著差異(P<0.05)；而活化部分凝血活酶時間(APTT)和凝血酶時間(TT)均有延長的，但無統(tǒng)計學差異；檸檬汁粉高劑量組大鼠的纖維蛋白原含量(FIB)低于模型組的，但無顯著差異。說明檸檬汁粉主要通過外源性途徑抑制血液凝固，與模型組相比PT時間分別延長了14.32%和17.78%，具有一定的抗凝活性。

**. 與正常組相比差異顯著(P<0.01) ##. 與模型組相比差異顯著(P<0.01)

圖1 檸檬汁粉對急性血瘀大鼠血沉的影響

Figure 1 The effect of lemon juice powder on ESR in rats with acute blood stasis

表2 檸檬汁粉對急性血瘀大鼠凝血四項的影響?

? **. 與正常組相比差異顯著(P<0.01)；#. 與模型組相比差異較顯著(P<0.05)；##. 與模型組相比差異顯著(P<0.01)。

2.4 檸檬汁粉對急性血瘀大鼠6-酮前列腺素F1α和血栓素B2的影響

6-酮-PGF1α和TXB2分別是前列腺環(huán)素(PGI2)和血栓素A2(TXA2)穩(wěn)定的代謝產(chǎn)物，其含量高低可以代表PGI2和TXA2的含量高低。PGI2具有抑制血小板聚集和擴張血管的作用，而TXA2與之呈生理拮抗作用，能促進血小板的聚集和血栓的形成。動脈粥樣硬化、腦血管病變、周圍血管血栓形成及血栓性血小板減少性紫癜等疾病患者，常見6-酮-PGF1α/TXB2比值比較低[14]。

由表3可知，與正常組相比，模型組能極顯著降低6-酮-PGF1α含量，升高TXB2含量，說明急性血瘀大鼠模型造模成功。與模型組相比，阿司匹林組、檸檬汁粉低劑量組和高劑量組大鼠血清中的6-酮-PGF1α含量均極顯著升高，TXB2含量均極顯著降低，兩者比值也極顯著升高。且與阿司匹林組相比，檸檬汁粉高劑量組能極顯著升高6-酮-PGF1α含量，降低TXB2含量的效果也與陽性對照組相當。提示檸檬汁粉使TXB2含量減少，6-酮-PGF1α表達量增加，擴張血管，抑制血小板聚集，從而抑制血栓的形成。

2.5 檸檬汁粉對急性血瘀大鼠內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(eNOS)和內(nèi)皮素-1(ET-1)的影響

血管在eNOS作用下產(chǎn)生NO，其具有擴張血管和抑制血小板功能的作用，而ET-1則是血管內(nèi)皮細胞依賴性擴張受損的強大血管收縮劑[15]，可通過多種途徑導致血管功能障礙。由表4可知，與正常組相比，模型組能較顯著降低eNOS含量，升高ET-1含量，說明急性血瘀大鼠模型造模成功。與模型組相比，阿司匹林組和檸檬汁粉高劑量組能極顯著升高eNOS含量，而檸檬汁粉低劑量組能升高eNOS含量，但無顯著差異；阿司匹林組和檸檬汁粉低劑量組能較顯著降低ET-1含量，而檸檬汁粉高劑量組大鼠血清中ET-1含量比模型組的低，但無統(tǒng)計學差異。表明檸檬汁粉通過增加eNOS表達和活性水平，降低ET-1的含量來改善血管功能，從而抑制血栓的形成，且無劑量依賴關系。

表3 檸檬汁粉對急性血瘀大鼠6-酮前列腺素F1α和血栓素B2的影響?

? **. 與正常組相比差異極顯著(P<0.01)；##. 與模型組相比差異極顯著(P<0.01)；^^. 與阿司匹林組相比差異極顯著(P<0.01)。

表4檸檬汁粉對急性血瘀大鼠內(nèi)皮型一氧化氮合成酶和內(nèi)皮素-1的影響?

Table4TheeffectoflemonjuicepowderoneNOSandET-1inratswithacutebloodstasis

組別eNOS含量/(ng·mL-1)ET-1含量/(ng·L-1)正常組 10.53±0.27211.20±21.03模型組 7.49±1.30?263.66±28.28?阿司匹林組 30.13±1.07##218.13±2.52#檸檬汁粉低劑量組9.46±2.12215.76±26.94#檸檬汁粉高劑量組20.22±1.49##231.66±17.52

? *. 與正常組相比差異較顯著(P<0.05)；#. 與模型組相比差異較顯著(P<0.05)；##. 與模型組相比差異極顯著(P<0.01)。

3 結論

試驗結果表明，檸檬汁粉能降低模型組大鼠全血黏度、減緩紅細胞血沉速度，提高血液的流動性。凝血系統(tǒng)方面，檸檬汁粉只具有顯著延長PT時間的作用，對APTT、TT和FIB的影響無顯著差異，主要通過外源途徑調(diào)節(jié)凝血系統(tǒng)，抑制模型大鼠血栓的形成；血管內(nèi)皮損傷方面，檸檬汁粉能提高6-酮-PGF1α和eNOS表達量，減少模型組ET-1含量，因此推斷檸檬汁粉可能通過修復血管內(nèi)皮細胞損傷，改善血管功能，從而抑制血栓的形成。試驗還發(fā)現(xiàn)300 mg/kg檸檬汁粉能顯著降低TXB2含量，說明檸檬汁粉能通過減少TXB2釋放，抑制血小板功能，從而改善大鼠血栓形成。

今后需進一步針對檸檬汁粉的抗血栓功效成分進行深入研究；此外，試驗未檢測溶血栓相關指標，對凝血系統(tǒng)中相關凝血因子表達的影響等也有待繼續(xù)探索。