申歡歡,陽(yáng)愛(ài)國(guó),陳弟師,顏其貴
(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,四川 成都 611130;四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,四川 成都 610041)
豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)也稱豬藍(lán)耳病,是由動(dòng)脈炎病毒科動(dòng)脈炎病毒屬的豬繁殖與呼吸綜合征病毒引起的一種嚴(yán)重的病毒性傳染病。該病以引起母豬的繁殖障礙、仔豬和育成豬呼吸道癥狀及高死亡率為主要特征[1,2]。本病曾經(jīng)在歐洲的德國(guó)、荷蘭、西班牙、比利時(shí)、英國(guó)、法國(guó),美洲的墨西哥、智利,亞洲的韓國(guó)、日本都發(fā)生過(guò),僅美國(guó)2005-2010 年P(guān)RRS 就 造 成 了6.64 億美元的損失,嚴(yán)重危害世界養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展[3,4]。在中國(guó),由于對(duì)該病的認(rèn)識(shí)和防控不到位,病毒與豬體之間的相互作用促進(jìn)了病毒變異,導(dǎo)致了自2006 年以來(lái)暴發(fā)高致病性藍(lán)耳?。℉PPRRSV),HP-PRRSV 的NSP2 區(qū)出現(xiàn)30 個(gè)AA 缺失,gp5 區(qū)域也發(fā)生了變異,對(duì)中國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成很大損失,但是有研究表明NSP2 區(qū)域的缺失并不是豬高致病性藍(lán)耳病毒力增強(qiáng)的根本原因[5,6];自2013 年起我國(guó)出現(xiàn)變異株NADC30-like-PRRSV(NADC30),NADC30 NSP2 區(qū) 域 出 現(xiàn)131 個(gè)AA缺失,gp5 區(qū)域也發(fā)生了變異[7,8],進(jìn)一步加重了PRRSV 的危害,該病有可能為輸入性疾病[9,10]。NADC30 毒株與高致病性藍(lán)耳病毒株和普通藍(lán)耳病相比,在基因組學(xué)和臨床致病性等方面均呈現(xiàn)出明顯差異,揭示了我國(guó)PRRSV 流行毒株出現(xiàn)了新的變異類(lèi)型,更加加重了PRRSV 的危害[11]。
豬場(chǎng)有繁殖母豬1 000 余頭,分別于2017 年9 月份和12 月份出現(xiàn)一定量的母豬流產(chǎn)。流產(chǎn)前幾天母豬體溫升高,食欲減退或不食,部分母豬有呼吸癥狀,腹部和耳部發(fā)紺,流產(chǎn)胎兒多數(shù)為死胎,胎兒大小一致無(wú)木乃伊胎,少數(shù)活仔豬大部分于6 d 內(nèi)死亡。
病理解剖可見(jiàn)仔豬頜下淋巴結(jié),腹股溝淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)腫大有出血,心包有積液,心冠變軟,肺部組織實(shí)質(zhì)性肉變,肺部病例切片顯示為典型間質(zhì)性肺炎(圖1)。擠壓肺部切面會(huì)出現(xiàn)泡沫,腎臟有出血點(diǎn)。
根據(jù)發(fā)病情況和免疫程序首先考慮對(duì)豬場(chǎng)病料進(jìn)行豬偽狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)和豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)的檢測(cè)。應(yīng)用Primer 5.0探針對(duì)NADC30(GenBank: KP860909.1),JAX1(GenBank:EF112445.1)和CH-1a(GenBank:EF112445.1)為參考序列設(shè)計(jì)可同時(shí)鑒別NADC30,HP-PRRSV和PRRSV的引物PRRSV-F/R,PRRSV目的條帶約1 020 bp;HP-PRRSV目的條帶約940 bp;NADC30目的條帶約6 3 0 b p(P R R S V-F:TTTTGGACACCTCCTTTGATTG;PRRSV-R:TCTACGCTTGACAGG GAGCTGCTT)。PRV的檢測(cè)使用國(guó)標(biāo)引物PRV-F/R,目的條帶約220 bp(PRV-F: CAGGAGGACGAG CTGGGGCT; PRV-R: GTCCACGCC CCGCTTGAAGCT)。取疑似發(fā)病豬只心,肝臟,脾,肺和腎等組織做勻漿處理;12 000 r/min離心5 min收集勻漿上清液;參照美基生物病毒DNA/RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取病料DNA/RNA,50 μL Nuclease free water 溶解核酸。取1 μL核酸參照TAKALA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄為CDNA。PRRSV 10 μL檢測(cè)體系:0.5 μL CDNA, 10 nmol/L上下游引物各1 μL,7.5 μL Nuclease free water。擴(kuò)增條件為:98 ℃ 2 min, 98 ℃ 10 s,56 ℃ 20 s,72 ℃ 10 s(35循環(huán)),72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物5 μL用 1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行鑒定(圖2)。PRV 10 μL檢測(cè)體系:0.5 μL DNA,10 n mol/L上下游引物各1 μL,7.5 μL Nuclease free water。擴(kuò)增條件為:98 ℃ 2 min,98 ℃ 10 s,56 ℃ 15 s, 72 ℃ 10 s(35循環(huán)),72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物5 μL用 1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行鑒定。
3.2.1 細(xì)菌分離鑒定
無(wú)菌操作取發(fā)病豬心、肝、腎、脾等組織接種于含5%胎牛血清的胰蛋白大豆瓊脂(TSA)培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)36 h 可見(jiàn)直徑為1.5 mm 的圓形,光滑,表面濕潤(rùn),銀灰色的菌落。挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色和油鏡下觀察,細(xì)菌形態(tài)為短桿菌,長(zhǎng)約1 ~3 μm(圖3)。對(duì)分離細(xì)菌進(jìn)行生化鑒定:分離細(xì)菌對(duì)硫化氫、麥芽糖、甘露醇、山梨醇、黏液酸(鹽)、賴氨酸、鳥(niǎo)氨酸等反應(yīng)管呈陽(yáng)性,吲哚試驗(yàn)呈陽(yáng)性;VP 試驗(yàn)陰性和枸櫞酸鹽利用呈陰性。生化鑒定結(jié)果符合大腸桿菌的特征[12]。
圖1 肺部病理切片
圖2 PRRSV 檢測(cè)
圖3 細(xì)菌鏡檢
通過(guò)流行病學(xué)、剖檢結(jié)果和PCR 檢測(cè)可以初步判定該豬場(chǎng)為PRRSV、HP-PRRSV、NADC30 混合感染。該豬場(chǎng)24 個(gè)月前免疫過(guò)HPPRRS 疫苗,但是母豬流產(chǎn)情況并沒(méi)有得到很大的改善。也有報(bào)道免疫PRRS 后導(dǎo)致豬群感染PRRSV,這也是許多豬場(chǎng)做PRRS 免疫時(shí)的憂慮[13]。該規(guī)模化豬場(chǎng)發(fā)病豬體表發(fā)紅,有的出現(xiàn)體溫升高的情況;母豬流產(chǎn)胎兒大小差異不大,無(wú)木乃伊胎;剖檢可見(jiàn)淋巴結(jié)腫大有出血,肺部呈現(xiàn)典型間質(zhì)性肺炎;腎臟有出血點(diǎn);心包有積液但無(wú)纖維滲出。綜合以上情況初步判定可能會(huì)存在PRRSV 的感染。根據(jù)該豬場(chǎng)和NADC30 流行情況運(yùn)用Primer 5.0 設(shè)計(jì)可同時(shí)擴(kuò)增PRRSV 、HP-PRRSV、NADC30 引物;PCR 結(jié)果出現(xiàn)3 條帶大小分別為:1 020 bp、940 bp、620 bp。針對(duì)母豬流產(chǎn)情況研究室檢測(cè)了PRV 和PRRSV。檢測(cè)結(jié)果證實(shí)此規(guī)?;i場(chǎng)存在PRRSV 、HPPRRSV、NADC30 混合感染,無(wú)PRV的感染。實(shí)驗(yàn)室臟器細(xì)菌檢測(cè)結(jié)果顯示為大腸桿菌感染。該規(guī)模化豬場(chǎng)小規(guī)模流產(chǎn)診斷為:以PRRSV 、HP-PRRSV、NADC30 混合感染為主因所導(dǎo)致。
針對(duì)病死豬深埋無(wú)害化處理,對(duì)豬場(chǎng)進(jìn)行全面消毒,生活區(qū)與生產(chǎn)區(qū)分開(kāi),進(jìn)入生產(chǎn)區(qū)前要洗澡換鞋,每棟豬舍前放置消毒燒堿水,盡量減少非必要人員和物料接觸。對(duì)引進(jìn)后備豬進(jìn)行隔離檢疫;對(duì)患病豬只進(jìn)行隔離并檢測(cè)豬體情況,進(jìn)行帶豬消毒;豬舍用消毒液消毒每周兩次常態(tài)化進(jìn)行;加強(qiáng)豬舍通風(fēng)和科學(xué)飼養(yǎng)管理;優(yōu)化免疫程序并監(jiān)測(cè)豬群整體狀態(tài);及時(shí)淘汰老弱母豬。仔豬哺乳前用0.1%的高錳酸鉀擦洗母豬腹部;注意仔豬保溫和清潔。針對(duì)大腸桿菌感染于分娩前2 d 注射氧氟沙星預(yù)防處理;每天早晚各1 次。保持哺乳舍的干燥和清潔,保證仔豬保溫和干燥,可以提供保溫箱或者電熱毯。