蔡泓 盧莎 陳岳明 卓廣超 張治芬

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）是目前全世界最常見的慢性肝臟疾病，疾病譜包括單純非酒精性脂肪肝（NAFL）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、肝硬化甚至肝細(xì)胞癌。盡管NAFLD起病隱匿，但如能積極開展早篩查、早干預(yù)，則能夠獲得良好的臨床防治效果。肝臟脂質(zhì)合成代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控在NAFLD發(fā)病中起主要作用，其中脂肪酸合成酶（FAS）和固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c（SREBP-1c）蛋白表達(dá)上調(diào)，被認(rèn)為對(duì)肝脂肪變性具有重要意義。流行病學(xué)調(diào)查研究顯示，絕經(jīng)后女性NALFD發(fā)生率顯著升高[1]。絕經(jīng)是女性發(fā)生NAFLD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[2]，但其視黃醇結(jié)合蛋白4（retinol binding protein 4,RBP4）是一種新型脂肪細(xì)胞因子，被認(rèn)為可作為胰島素抵抗的標(biāo)志物[3-4]。多數(shù)臨床研究發(fā)現(xiàn)，無論成人或兒童，血清RBP4蛋白表達(dá)水平在NAFLD患者均高于健康人群[5]，但其與NAFLD之間的相關(guān)性尚未獲得一致確認(rèn)[6]。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，外周血RBP4蛋白表達(dá)水平與絕經(jīng)后女性NAFLD相關(guān)，對(duì)這一人群的NAFLD具有診斷標(biāo)志物的潛在價(jià)值[7]。本研究采用小鼠高脂飲食誘導(dǎo)及去勢(shì)模擬女性絕經(jīng)后NAFLD狀態(tài)，通過分子生物學(xué)和病理學(xué)觀察外周血清及肝組織中RBP4、FAS和SREBP-1c蛋白表達(dá)水平的改變，探討RBP4蛋白在絕經(jīng)后NAFLD發(fā)病中的意義，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 8周齡雌性SFP級(jí)C57BL/6小鼠30只，體重（16.1依0.8）g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心分籠飼養(yǎng)。

1.1.2 高脂飼料 由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，脂質(zhì)含量42%，為模擬“西方飲食”配方。對(duì)照正常飼料脂質(zhì)含量12.6%。

1.1.3 主要試劑 小鼠RBP4、FAS抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；SREBP-1c抗體購自美國GENE原TEX公司；3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）、茁-肌動(dòng)蛋白（茁-ACTIN）及HRP標(biāo)記山羊抗小鼠抗體均購自武漢塞維爾生物科技有限公司；RBP4蛋白酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒購自美國ABcam公司。

1.1.4 主要儀器 倒置相差顯微鏡（日本Nikon公司，Eclipse Ci型）；高速冷凍離心機(jī)（美國Thermo Fisher公司，micro21R型）；蛋白凝膠電泳系統(tǒng)（美國Bio-rad公司，chemidoc XRS+型）等。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及模型制備 將30只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為高脂+去勢(shì)組、高脂組和對(duì)照組3組，每組10只。高脂+去勢(shì)組：去勢(shì)后，給予42%高脂飼料；去勢(shì)組：去勢(shì)后給予正常對(duì)照飼料；對(duì)照組：實(shí)施假手術(shù)后，給予正常對(duì)照飼料。去勢(shì)手術(shù)方法如下：小鼠禁食過夜后，根據(jù)體重（0.004ml/kg）予腹腔注射10%水合氯醛注射液麻醉，取下腹陰道口正中上方1～2cm處切口，分離卵巢周圍脂肪組織后結(jié)扎卵巢周圍血管及輸卵管，切除卵巢。假手術(shù)實(shí)施如下：以同樣的方法實(shí)施麻醉并打開小鼠腹腔找到卵巢，僅切除卵巢周圍少量脂肪組織，保留雙側(cè)卵巢，切除脂肪組織體積約等同于卵巢組織。所有小鼠手術(shù)后背部注射青霉素鈉20 000U/支預(yù)防感染。術(shù)后連續(xù)觀察陰道脫落細(xì)胞涂片1周，細(xì)胞涂片提示去勢(shì)小鼠陰道上皮持續(xù)無角化狀態(tài)，動(dòng)情周期消失，證實(shí)去勢(shì)造模成功。造模后每周1次禁食10h后稱重，每4周1次禁食后尾靜脈采血，測(cè)得小鼠血漿ALT水平明顯升高、體重顯著增加，表示NAFLD造模成功。所有小鼠造模20周后斷頸處死，心臟取血。

1.2.2 體重及肝臟指數(shù)檢測(cè) 3組小鼠建模后每周禁食10h后稱重；處死后即刻摘取肝臟稱重。肝臟指數(shù)=肝臟濕重（g）/體重（g）伊100%。

1.2.3 病理學(xué)檢查 取小鼠同部位肝組織2份，1份經(jīng)10%中性甲醛液固定、脫水、石蠟包埋、切片，脫蠟后進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察肝組織形態(tài)學(xué)改變；1份于-20益凍存后行油紅O染色，光鏡下觀察肝細(xì)胞質(zhì)內(nèi)脂質(zhì)沉積情況。參照美國國立衛(wèi)生研究院NAFLD臨床研究網(wǎng)病理工作組指南進(jìn)行NAFLD活動(dòng)性積分（NAFLD activity score，NAS）評(píng)定。NAS積分（0～8分）包含下列內(nèi)容：（1）肝細(xì)胞脂肪變性：0分（＜5%）；1分（5%～33%）；2分（34%～66%）。（2）小葉內(nèi)炎癥（20倍鏡計(jì)數(shù)壞死灶）：0分，無；1分（＜2個(gè)）；2分（2～4個(gè)）；3分（＞4個(gè)）。（3）肝細(xì)胞氣球樣變：0分，無；1分，少見；2分，多見。NAS＜3分可排除NASH，NAS＞4分可診斷為NASH，介于兩者之間為NASH可能。不伴有小葉內(nèi)炎癥、氣球樣變和纖維化但肝脂肪變性＞33%者為NAFL。肝纖維化評(píng)分參照Ishak標(biāo)準(zhǔn)：S0為無纖維化；S1為部分門管區(qū)有纖維增生，有或無短的纖維隔膜；S2為大多數(shù)門管區(qū)有纖維增生，有或無短的纖維隔膜；S3為大多數(shù)門管區(qū)有纖維增生，偶見門管區(qū)以纖維橋連；S4為門管區(qū)纖維增生，同時(shí)伴有明顯的纖維橋連；S5為明顯的橋連，偶見結(jié)節(jié)；S6為可能或明確的肝硬化。

1.2.4 血清RBP4蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 采用ELISA法。處死小鼠后收集心臟血液標(biāo)本，即刻3 500r/min低溫離心10min，吸取上層血清-20益保存。集齊所有樣本統(tǒng)一交專人嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行血清RBP4蛋白水平測(cè)定。

1.2.5 肝組織RBP4蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 采用免疫組織化學(xué)染色法。取上述未染色石蠟切片以ABC法行免疫組化染色。每張切片至少3個(gè)200倍視野拍照，保持背景光一致，采用Image-Pro Plus 6.0軟件準(zhǔn)確選取棕黃色作為陽性的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)值，分析照片中陽性面積的累積光密度值（IOD）。

1.2.6 肝臟RBP4及FAS、SREBP-1c蛋白表達(dá)水平的檢測(cè) 采用Western blot法。取各組小鼠肝組織約3mm3于液氮中研碎，加入蛋白裂解混合液于冰上充分裂解。以14 000/min離心3min后取上清液。按照BCA法進(jìn)行總蛋白質(zhì)濃度定量。加入5伊蛋白上樣緩沖液，100益、5min裂解蛋白。制備十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE），每孔加蛋白樣品 3 0滋g，在 1 00V 電壓及100min的濕轉(zhuǎn)條件下將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜（NC膜）上，然后用含5豫脫脂奶粉PBS室溫封閉4益過夜。一抗室溫孵育2h，TBST洗膜3次，二抗室溫孵育1h，TBST緩沖液漂洗3次。使用ECL發(fā)光液顯影，自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)采集圖片，ImageJ軟件分析灰度值，計(jì)算目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0和Graphpad Prime 7.0統(tǒng)計(jì)軟件。正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，方差齊時(shí)多組間比較采用F檢驗(yàn)，兩兩比較采用LSD-t法，方差不齊時(shí)多組間比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組小鼠體重、肝臟指數(shù)比較 結(jié)果顯示，在第20周時(shí)與對(duì)照組相比，高脂+去勢(shì)組小鼠體重及肝臟指數(shù)均明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見表1。

表1 3組小鼠體重及肝臟指數(shù)的比較

2.2 3組小鼠肝組織HE及油紅O染色結(jié)果比較 與對(duì)照組比較，HE染色下高脂+去勢(shì)組和去勢(shì)組出現(xiàn)明顯的肝細(xì)胞空泡樣改變，組織炎癥細(xì)胞浸潤，呈典型肝脂肪變性表現(xiàn)；高脂+去勢(shì)組病變程度更重，并可見靜脈周圍、肝竇輕度纖維化表現(xiàn)。油紅O染色下見高脂+去勢(shì)組廣泛肝細(xì)胞質(zhì)內(nèi)大小不等紅色脂滴聚積，呈典型肝脂肪變性表現(xiàn)。高脂+去勢(shì)組脂肪變性、炎癥壞死灶及氣球樣變更顯著，NAS評(píng)分更高，并達(dá)到肝纖維化S0～S1級(jí)別。3組小鼠病理檢查結(jié)果見圖1（插頁），NAS比較見表2，肝臟纖維化評(píng)分見表3。

表2 3組小鼠肝臟NAS比較

表3 3組小鼠肝臟纖維化比較

2.3 3組小鼠外周血清RBP4蛋白表達(dá)水平比較ELISA結(jié)果顯示，對(duì)照組、去勢(shì)組和高脂+去勢(shì)組小鼠外周血清中RBP4蛋白表達(dá)水平分別為（7.65依0.48）、（8.70依1.67）和（13.57依1.67）mg/ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；進(jìn)一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)，高脂+去勢(shì)組血清RBP4蛋白表達(dá)水平明顯高于另外兩組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），而對(duì)照組與去勢(shì)組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 3組小鼠肝組織中RBP4蛋白表達(dá)水平比較Westernblot結(jié)果顯示，對(duì)照組、去勢(shì)組和高脂+去勢(shì)組小鼠肝組織中RBP4蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.10依0.05、0.26依0.10 和 0.38依0.21，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；進(jìn)一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)，高脂+去勢(shì)組和去勢(shì)組肝組織RBP4蛋白表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組（均P＜0.01），而前兩組之間表達(dá)水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖2。

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，抗RBP4蛋白棕褐色免疫顆粒在肝細(xì)胞中特異性廣泛表達(dá)，其他細(xì)胞類型包括膽管細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和炎癥細(xì)胞中無表達(dá)，陽性染色位于肝細(xì)胞胞質(zhì)。對(duì)照組、去勢(shì)組和高脂+去勢(shì)組小鼠肝組織中RBP4蛋白染色I(xiàn)OD值分別為41.22依6.51、93.76依10.02 和 286.93依35.33，3 者比較差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。去勢(shì)組和高脂+去勢(shì)組較對(duì)照組肝細(xì)胞RBP4蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)，尤以高脂+去勢(shì)組為著。RBP4蛋白表達(dá)水平與肝臟脂肪變程度呈一致性改變，見圖3（插頁）。

圖2 3組小鼠肝組織RBP4蛋白電泳圖

2.5 3組小鼠 FAS、SREBP-1c蛋白表達(dá)水平比較Western blot結(jié)果顯示，對(duì)照組、去勢(shì)組和高脂+去勢(shì)組小鼠肝組織中SREBP-1c蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.25依0.08、0.41依0.10 和 0.48依0.07，F(xiàn)AS 蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為 0.37依0.07、0.69依0.13 和 0.75依0.11。SREBP-1c和 FAS蛋白在3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），進(jìn)一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)高脂+去勢(shì)組和去勢(shì)組SREBP-1c和FAS蛋白表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組（均P＜0.01），但前兩組之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見圖4。

圖4 3組小鼠肝組織SREBP-1c和FAS蛋白電泳圖

3 討論

RBP4蛋白主要通過肝臟合成，其次是脂肪組織。近年來的研究認(rèn)為血清RBP4蛋白參與胰島素調(diào)控，與肥胖及糖尿病相關(guān)，并被認(rèn)為具有2型糖尿病診斷標(biāo)志物的價(jià)值[3，8]。但是RBP4蛋白表達(dá)水平與NAFLD的關(guān)系尚未明確[6，9]。本研究團(tuán)隊(duì)的前期研究發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)后NAFLD女性患者較健康對(duì)照者外周血清RBP4蛋白水平明顯升高，具有NAFLD診斷標(biāo)志物的價(jià)值，但缺乏組織學(xué)證據(jù)。在本實(shí)驗(yàn)中，筆者利用對(duì)雌性C57BL/6小鼠實(shí)施高脂飲食和去勢(shì)手術(shù)的干預(yù)，成功模擬女性絕經(jīng)后NAFLD疾病狀態(tài)。結(jié)果顯示，在去勢(shì)雌性小鼠中，當(dāng)肝臟出現(xiàn)輕度脂肪變性，即病理學(xué)檢查中發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積增加，但尚無明顯炎癥反應(yīng)時(shí)，即有肝RBP4蛋白表達(dá)上調(diào)，且其表達(dá)水平隨著肝脂肪變性的程度加重而上升。表明肝臟RBP4蛋白水平不僅是NAFLD的敏感診斷指標(biāo)，也能夠在一定程度上反映NAFLD的疾病嚴(yán)重程度。進(jìn)一步對(duì)比小鼠肝臟和外周血清RBP4蛋白表達(dá)水平，筆者發(fā)現(xiàn)RBP4蛋白在這兩者中的表達(dá)改變呈一致性，提示血清RBP4蛋白能夠較好地反應(yīng)肝組織RBP4蛋白表達(dá)水平，由此認(rèn)為血清RBP4蛋白水平亦能夠較好地反映肝NAFLD的發(fā)生、發(fā)展情況。這一結(jié)果與前期臨床研究結(jié)果一致，為血清RBP4蛋白具有在絕經(jīng)后女性中NAFLD診斷標(biāo)志物這一價(jià)值提供了可信證據(jù)。

Xia等[10]發(fā)現(xiàn)RBP4蛋白可特異性激活SREBP-1c并上調(diào)其下游基因FAS的表達(dá)，從而影響肝臟脂質(zhì)合成代謝。SREBP-1c蛋白活化是肝細(xì)胞合成TG的關(guān)鍵步驟，激活的SREBP-1c蛋白可在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控FAS蛋白，后者是乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A合成內(nèi)源性長鏈脂肪酸的關(guān)鍵酶。筆者觀察到，脂肪變性的肝組織SREBP-1c和FAS蛋白表達(dá)水平均明顯高于正常對(duì)照，與同一樣本中RBP4蛋白表達(dá)改變一致；但隨著肝脂肪變性的進(jìn)一步加重，SREBP-1c和FAS蛋白的表達(dá)并未相應(yīng)上調(diào)，呈現(xiàn)出與RBP4蛋白是分離趨勢(shì)。提示NAFLD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，RBP4蛋白參與其中部分調(diào)控途徑。

目前關(guān)于性激素與RBP4蛋白表達(dá)關(guān)系的研究較少，部分臨床研究數(shù)據(jù)顯示在男性中，睪酮水平與血清RBP4蛋白水平呈正相關(guān)[11-12]。Li等[13]的臨床研究發(fā)現(xiàn)，肥胖女性人群中血清RBP4蛋白水平與雌激素濃度呈負(fù)相關(guān)。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)無論是否肥胖，女性血清RBP4蛋白表達(dá)水平都與循環(huán)雌激素呈負(fù)相關(guān)[14]。這一現(xiàn)象在本實(shí)驗(yàn)中獲得進(jìn)一步證實(shí)。在同周齡小鼠中，去勢(shì)小鼠肝臟和血清中RBP4蛋白水平均高于接受假手術(shù)的對(duì)照組，提示絕經(jīng)狀態(tài)可能上調(diào)女性RBP4蛋白的表達(dá)。但考慮到絕經(jīng)狀態(tài)涉及到多種性激素的改變，包括雌激素水平下降、睪酮水平相對(duì)上升等，因此尚不能明確單一激素改變對(duì)絕經(jīng)后女性血清RBP4蛋白表達(dá)水平的調(diào)控作用，本研究團(tuán)隊(duì)將在進(jìn)一步研究中探討各性激素成分對(duì)RBP4蛋白調(diào)控的分子機(jī)制。

綜上所述，RBP4蛋白在去勢(shì)雌性小鼠模型NAFLD的發(fā)生和發(fā)展過程中表現(xiàn)出良好的肝脂肪變性病情的相關(guān)性。結(jié)合相關(guān)臨床研究，血清RBP4蛋白可能成為絕經(jīng)后女性NAFLD診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，具有良好的應(yīng)用前景。