黃亞 宿懷予 范秀 周榮 廖昌軍

摘要：探討甘露飲中6種有效成分（綠原酸、麥角甾苷、抽皮苷、黃琴苷、甘草酸、熊果酸）最佳提取工藝條件及含量測(cè)定方法。優(yōu)化提取溶劑，通過正交試驗(yàn)法考察料液比、提取時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)甘露飲提取工藝的影響。采用Syneronis C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm），流動(dòng)相乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）梯度洗脫（0～5mm，5% A;5～40min，5%～20% A;40～60min，20%～50% A;60～80min，50%～90% A;80～90.1min，90%～5% A;90.1～100min，5%A），流量1.0mL/min，柱溫35℃，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm，進(jìn)樣量20μL的色譜條件對(duì)甘露飲提取物中6種有效成分進(jìn)行含量測(cè)定。最佳提取工藝條件是：60%乙醇為提取溶劑，料液比1：4，提取時(shí)間為1h，提取次數(shù)為1次。綠原酸、麥角甾苷、抽皮苷、黃芩苷、甘草酸、熊果酸分別在4.80～80.00，10.00～100.00，24.00～400.00，30.00～500.00，6.00～100.00，3.60～60.00μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r²≥0.9995）。平均加樣回收率在96.12%～101.82%，RSD在1.72%～2.92%。該提取工藝穩(wěn)定可行，HPLC法能簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確地測(cè)定甘露飲提取物中6種有效成分的含量。

關(guān)鍵詞：甘露飲;正交試驗(yàn);綠原酸;麥角甾苷;柚皮苷;黃芩苷;高效液相色譜

中圖分類號(hào)：R580 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1674-5124（2019）06-0081-07

收稿日期：2018-11-12;收到修改稿日期：2018-12-20

基金項(xiàng)目：德陽(yáng)市科技局支撐計(jì)劃（2016SZ033）

作者簡(jiǎn)介：黃亞（1988-），女，四川成都市人，主管藥師，碩士，主要從事臨床藥學(xué)研究。

通信作者：廖昌軍（1981-），男，四川自貢市人，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，碩士，主要從事藥物分析研究工作。

0 引言

甘露飲出自《太平惠民和劑局方·卷六》，由生地黃、熟地黃、麥冬、天冬、石解、積殼、茵陳、黃芩、批把葉、甘草組成，具有滋陰生津，清熱解毒，祛濕和中的功效[1]，目前臨床廣泛用于放射性口腔炎、復(fù)發(fā)性口腔黏膜潰瘍、慢性咽炎、慢性淺表性胃炎、濕熱陽(yáng)痿、角結(jié)膜干燥癥等[2-3]。甘露飲中多種成分相輔相成、協(xié)同作用是其藥理作用的重要基礎(chǔ)，而各種潛在活性成分的含量與臨床治療效果密切相關(guān)。綠原酸是茵陳的有效成分之一，具有清除體內(nèi)自由基、抗氧化、抗菌、抗病毒和保肝利膽等作用[47。麥角甾苷是地黃中苯乙醇苷類成分的代表。柚皮苷為積殼中黃酮類成分之一，具有抗氧化、抗變態(tài)反應(yīng)、抑制胃腸道平滑肌作用[5]。黃芩苷是黃芩的指標(biāo)性成分，具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗癌等藥理作用[6-7]。甘草酸是甘草中最主要的活性成分，具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等作用[8]。熊果酸是批把葉中有效成分，具有保肝、消炎、抗腫瘤、調(diào)血脂、免疫雙向調(diào)解等藥理作用。在國(guó)內(nèi)外研究中分別關(guān)于綠原酸、麥角甾苷、柚皮苷、黃芩苷、甘草酸和熊果酸的含量提取及測(cè)定方法有相關(guān)報(bào)道[9-15]，而甘露飲中多種代表性活性成分的提取及同時(shí)定量，國(guó)內(nèi)外尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)采用了正交試驗(yàn)法，以6種有效成分綠原酸、麥角甾苷、柚皮苷、黃芩苷、甘草酸和熊果酸的含量為指標(biāo)，對(duì)甘露飲的提取工藝進(jìn)行研究，優(yōu)選出最佳提取工藝，同時(shí)建立了HPLC法測(cè)定6種有效成分的含量，為完善甘露飲質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)和臨床用藥提供依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 儀器

1260高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫科技有限公司）;烘箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）;XW-80A型旋渦混合器（上海青浦滬西儀器廠）;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)IKA）;CP225D型電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）;粉碎機(jī)（吉首市中誠(chéng)制藥機(jī)械廠）。

1.2 材料

每批甘露飲處方藥材包括生地黃15g、熟地黃15g、麥冬15g、天冬15g、石斛15g、積殼10g、茵陳10g、黃芩10g、批把葉10g、甘草6g（均購(gòu)自四川博仁藥業(yè)有限公司，批號(hào)分別為171001，180201，180401，180301，171001，180101，180401，180302，180301，180201，均符合2010年版《中國(guó)藥典））和《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》有關(guān)規(guī)定）;綠原酸、麥角甾苷、柚皮苷、黃芩苷、甘草酸和熊果酸對(duì)照品（成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為180302，180213，180119，180221，180105，180626，純度均≥99%）;甲醇、乙腈為色譜純（Fisher），磷酸為色譜純（成都市科隆化學(xué)試劑有限公司），乙醇為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Syncronis C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm），流動(dòng)相乙腈（A）-0.1磷酸水溶液（B）梯度洗脫（0～5min，5% A;5～40min，5%～20% A;40～60min，20%～50% A;60～80min，50%～90% A;80～90.1min，90%～5% A：90.1～100min，5%A），流量1.0mL/min，柱溫35℃，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm，進(jìn)樣量20μL。

2.2 混合對(duì)照品溶液制備

精密稱取綠原酸對(duì)照品5.0mg，麥角甾苷對(duì)照品5.0mg，柚皮苷對(duì)照品40.0mg，甘草酸對(duì)照品10.0mg，用70%乙腈定容至10mL。精密稱取黃芩苷對(duì)照品10.0mg，熊果酸對(duì)照品5.0mg，用甲醇定容至5mL量瓶中，作為單個(gè)對(duì)照品貯備液，分別吸取上述6種單個(gè)對(duì)照品貯備液1.6，2.0，1.0，2.5，1.0，1.2mL于10mL量瓶中，70%乙腈定容至刻度，即得綠原酸、麥角甾苷、柚皮苷、黃芩苷、甘草酸和熊果酸（質(zhì)量濃度分別為80，100，400，500，100，60μg·mL^-1）混合對(duì)照品貯備液，冷藏備用。

2.3 供試品溶液制備

按處方量稱取相應(yīng)量的甘露飲中藥材，粉碎過10目篩。稱取甘露飲粗粉，用60%乙醇提取，料液比1：4，提取時(shí)間為1h，提取次數(shù)為1次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至粘稠狀后，烘干得浸膏。精密稱取浸膏0.1g，加入70%乙腈定容至10mL，即得。

2.4 系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)

分別取混合對(duì)照品溶液和供試品溶液按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果綠原酸、麥角甾苷、柚皮苷、黃芩苷、甘草酸及熊果酸的保留時(shí)間分別為14.2，25.8，27.8，32.7，51.3，74.7min，供試品中其他成分不干擾樣品測(cè)定，如圖1所示。

2.5 線性關(guān)系考察

精密吸取2.2項(xiàng)混合對(duì)照品貯備液0.3，0.75，1.5，3，4mL定容至5n正量瓶中，70%乙腈稀釋至刻度，即得系列濃度的對(duì)照品溶液，取混合對(duì)照品貯備液和系列濃度的對(duì)照品溶液按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表1，可知6種有效成分在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取2.2項(xiàng)混合對(duì)照品溶液4n止至5 mL量瓶中，70%乙腈定容至刻度，按2.1項(xiàng)下色潛條件連續(xù)進(jìn)樣5次，結(jié)果綠原酸、麥角甾苷、柚皮苷、黃芩苷、甘草酸、熊果酸峰面積的RSD分別為2.67%，2.89%，0.18%，0.21%，0.33%，1.19%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

按處方量稱取相應(yīng)量的甘露飲中藥材，按2.3項(xiàng)方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別于0，3，6，9，12，24 h測(cè)定，結(jié)果綠原酸、麥角甾苷、柚皮苷、黃芩苷、甘草酸、熊果酸峰面積的RSD分別為3.00%，2.87%，1.60%，0.84%，3.23%，0.98%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

按處方量稱取相應(yīng)量的甘露飲中藥材，共6份，按2.3項(xiàng)方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果綠原酸、麥角甾苷、柚皮苷、黃芩苷、甘草酸、熊果酸峰面積的RSD分別為1.89%，2.67%，1.08%，0.24%，2.64%，3.01%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收試驗(yàn)

精密稱取甘露飲浸膏0.05g，共9份，分別置于9個(gè)5mL量瓶中，用70%乙腈定容，分別按已知含有量的80%、100%、120%3個(gè)水平加入混合對(duì)照品溶液，每個(gè)水平3份，按2_1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率，見表2。結(jié)果綠原酸、麥角甾苷、柚皮苷、黃琴苷、甘草酸、熊果酸的加樣回收率平均值在96.12%～101.82%，RSD在1.72%～2.92%。表明該方法回收率良好。

2.10 甘露飲提取工藝優(yōu)化

2.10.1 提取溶劑的選擇

按處方量稱取相應(yīng)量的甘露飲中藥材，粉碎過10目篩。稱取甘露飲粗粉，分別采用純水、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇各500mL，連續(xù)提取2次，每次2h，提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后噴霧干燥。分別取干燥后粉末0.1g，加入70%乙腈定容至10mL，按2.1項(xiàng)色譜條件分別測(cè)定干粉中綠原酸、麥角甾苷、柚皮苷、黃芩苷、甘草酸、熊果酸含量。結(jié)果表明60%乙醇為提取溶劑所得干粉中六種有效成分含量均較高，本試驗(yàn)選擇60%乙醇作為提取溶劑，進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化工藝研究。

2.10.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)為影響因素，實(shí)驗(yàn)因素水平見表30每個(gè)因素選擇3個(gè)水平進(jìn)行L₉（3⁴）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以甘露飲中綠原酸、麥角甾苷、柚皮苷、黃芩苷、甘草酸和熊果酸的提取率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定提取干燥后樣品中6種有效成分峰面積，計(jì)算提取率，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果見表4，方差分析見表5。提取率=樣品峰面積際準(zhǔn)品峰面積×100%。

由表4可知序號(hào)1效果最優(yōu)，得到最優(yōu)條件是料液比1：4、提取時(shí)間1h、提取次數(shù)1次。方差分析結(jié)果表明提取時(shí)間對(duì)熊果酸、甘草酸、柚皮苷、綠原酸的提取含量影響顯著;黃芩苷的提取含量受料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)的影響相當(dāng);提取時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)麥角甾苷的提取含量影響不顯著。料液比、提取時(shí)間對(duì)甘草酸的提取含量有顯著影響：料液比1：8、提取時(shí)間為1h得到甘草酸含量最多，即序號(hào)4為最優(yōu);提取次數(shù)對(duì)綠原酸含量有顯著影響：提取次數(shù)為1次，綠原酸含量最多，即第3因素下1水平為最優(yōu)方法。液料比、提取時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)熊果酸、黃芩苷、抽皮苷、麥角甾苷提取含量影響并不顯著。

綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最佳提取工藝條件是：甘露飲提取溶劑為60%乙醇，料液比1：4、提取時(shí)間為1h，提取次數(shù)為1次。

2.10.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)篩選出來(lái)的最佳提取工藝制備3批噴霧干燥供試品，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果3批供試品中綠原酸平均含量為8.56μg/g（RSD=2.52%）;麥角甾苷平均含量為16.85μg/g（RSD=2.88%）;黃芩苷平均含量為266.46μg/g（RSD=2.65%）;柚皮苷平均含量為173.86μg/g（RSD=2.08%），甘草酸平均含量為14.33μg/g（RSD=2.52%），熊果酸平均含量為14.85μg/g（RSD=3.00%）。6種有效成分含量RSD均在3%以內(nèi)，表明工藝穩(wěn)定可行。

3 結(jié)束語(yǔ)

試驗(yàn)考察了甲醇、乙腈、緩沖鹽種類和濃度對(duì)樣品分離的影響，最后確認(rèn)乙腈和0.1磷酸溶液進(jìn)行梯度洗脫后，各色譜峰分離度好，保留時(shí)間適中，基線穩(wěn)定，綠原酸、黃芩苷、甘草酸和熊果酸峰型和分離度均較好，而麥角甾苷與柚皮苷由于自身化學(xué)性質(zhì)和方劑中含量差異的影響，能實(shí)現(xiàn)基線分離。經(jīng)過方法學(xué)考察試驗(yàn)，本文建立的含量檢測(cè)方法準(zhǔn)確、可靠，重復(fù)性好，可用于同時(shí)測(cè)定甘露飲中多種物質(zhì)的含量，為甘露飲質(zhì)量控制及綜合評(píng)價(jià)提供了借鑒。

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（編輯：徐柳）