謝 群 胡 強 劉丹丹 山 超 楊 靖 張瑞瑞

黑色素瘤是1種具有高度侵襲性和轉(zhuǎn)移性的惡性腫瘤[1]。

水通道蛋白家族(aquaporins，AQPs)是水和小溶質(zhì)運輸?shù)谋粍油ǖ?。近年研究顯示，AQPs與不同類型疾病的發(fā)生有關(guān)，且AQPs在血管生成、細胞遷移和腫瘤生長中起重要作用[2-3]。研究證據(jù)表明，AQP1和AQP3參與皮膚角質(zhì)形成細胞和內(nèi)皮細胞等的遷移[4]。此外，AQP1和AQP3在不同類型的腫瘤中具有比在相應(yīng)的正常組織中相對更高的表達水平[5]。本研究通過對80例接受手術(shù)治療的黑色素瘤患者癌組織中AQP1和AQP3蛋白水平進行檢測，旨在探討兩者與黑色素瘤的潛在關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2015年1月至2016年8月于湖北文理學(xué)院附屬襄陽市中心醫(yī)院整形美容科經(jīng)病理學(xué)初次確診的黑色素瘤患者80例，診斷標準依據(jù)美國抗癌聯(lián)合會黑色素瘤指南第八版[6]。所有患者均經(jīng)我科手術(shù)治療，黑色素瘤和癌旁組織均置于-80 ℃冰箱儲存?；颊咧形荒挲g為47歲，年齡32～64歲，平均年齡為(48.3±8.6)歲；男性55例，女性25例；Ⅰ期42例，Ⅱa期20例，Ⅱb期13例，Ⅲ期5例；高分化41例，中分化29例，低分化10例。納入標準：①手術(shù)治療前未接受其他治療；②知曉本研究目的，并同意參與者；③最終配合研究人員完成隨訪者。排除標準：①已接受放化療治療者；②知曉研究目的后明確拒絕參與本研究者；③隨訪過程中的失訪者。本項目經(jīng)醫(yī)院倫理會批準。

1.2 術(shù)后隨訪

術(shù)后對80例黑色素瘤患者進行30個月電話隨訪，隨訪日期截止至2019年2月，記錄患者的生存時間。隨訪終點為：①30個月內(nèi)死亡；②30個月隨訪結(jié)束。

1.3 免疫組織化學(xué)法檢測及蛋白定量

所有組織樣品均用4%甲醛固定，而后對樣品進行脫水，石蠟包埋，切片。將切片室溫封閉1 h(5%血清)，加入單克隆抗體AQP1和AQP3，堿性磷酸酶二抗4 ℃孵育(抗體購于Abcam公司)。分別加入鏈霉親和素-過氧化物酶和二氨基聯(lián)苯胺恒溫顯色封片。應(yīng)用ImagePro Plus對免疫組化結(jié)果進行分析，并按陽性細胞百分比及陽性細胞染色強弱評分(x×y)，x代表陽性細胞百分比：x=0，無陽性細胞；x=1，陽性細胞為1%～10%；x=2，陽性細胞為11%～50%；x=3，陽性細胞為51%～80%，x=4陽性細胞所占比例達81%以上。y代表陽性細胞染色強弱：y=0，陰性；y=1，弱陽性；y=2，中度陽性；y=3，強陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 黑色素瘤AQP1和AQP3免疫組織化學(xué)結(jié)果

與癌旁組織相比，黑色素瘤組織中AQP1和AQP3蛋白免疫組化評分均顯著增高(P<0.05)，見表1。

表1 AQP1和AQP3蛋白的免疫組化評分

2.2 AQP1和AQP3蛋白免疫組化評分與黑色素瘤預(yù)后

共11例患者在30個月隨訪期間死亡。與低AQP1組相比，高AQP1組患者生存率顯著降低(χ2=5.241，P=0.022，圖1-A)；與低AQP3組相比，高AQP3組患者生存率顯著降低(χ2=8.384，P=0.004，圖1-B)。

圖1 AQP1和AQP3蛋白免疫組化評分與黑色素瘤預(yù)后的分析

2.3 黑色素瘤組織AQP1和AQP3蛋白免疫組化評分與臨床病理特征的相關(guān)性

依據(jù)AQP1和AQP3蛋白免疫組化評分中位數(shù)(AQP1：9分；AQP3：6分)，將80例患者分為高、低組。黑色素瘤組織中AQP1和AQP3蛋白免疫組化評分在患者不同年齡和性別間均無顯著差異(P>0.05)，而分期越晚和分化程度越低患者的AQP1和AQP3免疫組化評分越高，見表2。且AQP1和AQP3水平與分期(AQP1：γ=0.543，P=0.001；AQP3：γ=0.562，P=0.002)和分化程度(AQP1：γ=0.516，P=0.002；AQP3：γ=0.497，P=0.007)呈顯著線性關(guān)聯(lián)，見表3。

表2 AQP1和AQP3免疫組化評分與黑色素瘤臨床病理特征的關(guān)系/例

表3 AQP1和AQP3免疫組化評分與黑色素瘤臨床病理特征的相關(guān)性分析

3 討論

黑色素瘤最主要的特征是瘤體不受限制的生長及早期轉(zhuǎn)移，具有高度侵襲性，但其相關(guān)機制尚不清楚。數(shù)據(jù)顯示，其發(fā)病率在過去二十年間呈持續(xù)增高趨勢。雖然大多數(shù)黑素瘤病例可接受手術(shù)切除原發(fā)腫瘤病灶，但該病的轉(zhuǎn)移形式多樣且患者預(yù)后不良[7]。此外，腫瘤細胞對治療又具有高度抵抗性，最近報道指出，免疫抑制療法在約60%的晚期黑色素瘤患者治療中顯示對疾病進程控制效果較差[8]，因此迫切需要找尋基于新靶標的更為有效的治療策略。

近年研究發(fā)現(xiàn)，在皮膚組織真皮層中存在AQP蛋白家族。值得關(guān)注的是，在AQP蛋白家族中，AQP1和AQP3已在多個腫瘤中被證實參與腫瘤細胞的遷移與增殖[2-3,5]。Saadoun等[9]經(jīng)皮下注射黑色素瘤細胞后，缺乏AQP1的小鼠由于腫瘤內(nèi)新生血管形成受損而表現(xiàn)出腫瘤生長減弱，當(dāng)從AQP+/+和AQP-/-小鼠中提取并培養(yǎng)主動脈內(nèi)皮細胞時，與AQP+/+內(nèi)皮細胞相比，AQP-/-內(nèi)皮細胞對趨化性刺激的遷移活性較低。Korany等[10]發(fā)現(xiàn)，AQP3通過水和甘油轉(zhuǎn)運調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細胞的遷移和增殖，并最終促進皮膚傷口愈合；此外，他們還發(fā)現(xiàn)由于皮膚表皮水合作用受損，缺乏AQP3的小鼠傷口愈合被延遲。上述研究均提示，皮膚中AQP1和AQP3表達在黑色素瘤生物學(xué)進展，特別是在腫瘤轉(zhuǎn)移與侵襲等中有重要作用，進而影響患者預(yù)后。本研究通過運用免疫組織化學(xué)技術(shù)對80例經(jīng)手術(shù)治療的黑色素瘤組織標本內(nèi)AQP1和AQP3水平進行檢測，并對兩者水平與患者預(yù)后間的關(guān)系進行分析。

本次研究我們發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，黑色素瘤組織中AQP1和AQP3蛋白免疫組化評分均顯著增高；且分期越晚和分化程度越低的患者，其AQP1和AQP3免疫組化評分越高；相關(guān)性分析進一步提示，AQP1和AQP3水平與黑色素瘤高分期和低分化程度呈顯著線性關(guān)聯(lián)。上述研究提示，黑色素瘤患者癌組織中AQP1和AQP3的增高與患者腫瘤發(fā)展程度加深有緊密關(guān)系，且我們的研究結(jié)果與前期Saadoun等[9]和Korany等[10]的結(jié)果一致，AQP1和AQP3參與黑色素瘤細胞的惡性進展。上述發(fā)現(xiàn)在30個月的隨訪完成后得到了進一步的證實，組織中高AQP1與高AQP3患者的生存率均顯著低于低AQP1與低AQP3者。我們的研究結(jié)果提示，對黑色素瘤患者組織中AQP1和AQP3蛋白定量對預(yù)后評估具有一定意義。然而，本研究有如下不足：①本研究尚缺乏一定的基礎(chǔ)研究，對干擾黑色素瘤細胞系中AQP1和AQP3基因表達是否對細胞的生物學(xué)功能產(chǎn)生影響有待進一步分析；②關(guān)于外周血清中AQP1和AQP3蛋白的定量檢測對黑色素瘤診斷和預(yù)后評估價值仍有待進一步探討；③后期仍需加大樣本量并擴大患者來源(我國的不同地區(qū))以明確我們的研究結(jié)果。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)黑色素瘤癌組織中AQP1和AQP3表達增高與患者預(yù)后不良密切關(guān)聯(lián)。