楊麗萍 羅慶豐 高 玟 孫正魁 李江龍 梁璟慧 王烈亮

乳腺癌是我國(guó)女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，本研究應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)改良根治術(shù)后乳腺癌患者的PD1蛋白表達(dá)情況，探討PD1/PDL1信號(hào)表達(dá)情況與乳腺癌臨床病理特征和相關(guān)分子表型的關(guān)系，為乳腺癌患者的合理治療選擇做出有益的探索。

1 材料與方法

1.1 一般資料

江西省腫瘤醫(yī)院2013年5月至2016年5月收治117例乳腺癌患者，經(jīng)病理檢查確診為浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌，均為女性，年齡32～68歲，平均年齡(50.8±2.6)歲。

1.2 主要試劑

PD1購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，克隆號(hào)MRQ-22,為工作液，參考滴度為1∶200。

1.3 標(biāo)本采集與處理

117例乳腺癌標(biāo)本經(jīng)過(guò)病理檢查證實(shí)為浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌，檢測(cè)腫瘤PD1表達(dá)采用MaxvisionTM免疫組化法，按照PD1試劑盒的操作說(shuō)明進(jìn)行，具體步驟：①4 μm連續(xù)切片，裱于涂有APES的載玻片上，70 ℃烤片2 h;②二甲苯脫蠟2次，5個(gè)梯度酒精脫水；③3%H2O2室溫孵育30 min；④pH 6.0檸檬酸溶液中，微波熱修復(fù)抗原5 min，保溫10 min，自然冷卻；⑤PBS洗,3 min×2次；⑥滴加PD1抗體100 μl，置4 ℃冰箱12 h；⑦室溫復(fù)溫1 h，PBS沖洗3 min×2次；⑧滴加Maxvision二抗抗體，室溫孵育1 h；⑨PBS沖洗3 min×2次；⑩DAB光鏡下顯色，出現(xiàn)棕色顆粒，停止顯色，蘇木精復(fù)染，封片。

1.4 判定標(biāo)準(zhǔn)

PD1在細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色顆粒沉著者為陽(yáng)性。PD1染色結(jié)果根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞 所占百分率進(jìn)行半定量分析[1]，PD1根據(jù)顯色癌細(xì)胞的比例記分：<1%為陰性，>1%者為陽(yáng)性。陽(yáng)性對(duì)照為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司的肺癌組織PD1蛋白陽(yáng)性組織片，陰性對(duì)照：PBS代替一抗。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行四格表卡方檢驗(yàn)和R×C行列表檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果

117例浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者PD1陽(yáng)性表達(dá)率為23.1%。PD1陽(yáng)性表達(dá)率與乳腺癌脈管浸潤(rùn)和腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況呈顯著性相關(guān)(P<0.05)，與患者年齡、組織學(xué)分級(jí)、腫瘤大小、腫瘤分子表型的ER、PR、CerBb-2的陽(yáng)性結(jié)果及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)情況無(wú)顯著性相關(guān)(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 117例乳腺癌PD1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

乳腺癌是女性高發(fā)腫瘤，根據(jù)2017年癌癥統(tǒng)計(jì)中心數(shù)據(jù)，其排在女性腫瘤發(fā)病率的首位。三陰性乳腺癌的治療效果較差，免疫治療是近期乳腺癌規(guī)范治療中的研究熱點(diǎn)[2]。國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展表明PD1/PDL1信號(hào)在腫瘤免疫治療中的作用在抗腫瘤免疫中，通常遵循腫瘤特異性T細(xì)胞活化、T細(xì)胞增殖、腫瘤浸潤(rùn)和T細(xì)胞記憶應(yīng)答加強(qiáng)的步驟。研究表明，腫瘤細(xì)胞以及腫瘤微環(huán)境中的APCs表達(dá)的PDL-1均可經(jīng)PD-1/PDL-1信號(hào)通路抑制腫瘤抗原特異性T細(xì)胞的活化，下調(diào)T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤免疫應(yīng)答[3]。本研究檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞的PD-1表達(dá)與其臨床病理特征和其他相關(guān)分子表型的關(guān)系，為乳腺癌患者選擇免疫治療指標(biāo)提供理論依據(jù)。

PD-1(programmed death-1)最初是在凋亡的T細(xì)胞雜交瘤中得到的，由于其和細(xì)胞凋亡相關(guān)而被命名為程序性死亡-1基因，通過(guò)其配體形成PDL-1/PD-1通路發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。PDL-1(B7-H1)屬于B7家族，具有IgV和IgC樣區(qū)、跨膜區(qū)及胞漿區(qū)尾部，PDL-1與其T細(xì)胞上的受體PD1相互作用，在免疫應(yīng)答的負(fù)性調(diào)控方面發(fā)揮著重要作用；該分子具有廣泛的組織表達(dá)譜，在一些腫瘤細(xì)胞系上有較高的表達(dá)，許多研究均表明其與腫瘤的免疫逃逸機(jī)制相關(guān)[4]。腫瘤部位的微環(huán)境可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞上的PDL-1的表達(dá)，且表達(dá)廣泛，表達(dá)的PDL-1有利于腫瘤的發(fā)生和生長(zhǎng)，誘導(dǎo)抗腫瘤T細(xì)胞的凋亡[5]。轉(zhuǎn)染PDL-1基因的P815腫瘤細(xì)胞系在體外可抵制特異性CTL的裂解，將其接種小鼠體內(nèi)后具有更強(qiáng)的致瘤性和侵襲性。這些生物學(xué)特性均可通過(guò)阻斷PDL-1而逆轉(zhuǎn)。敲除PD1基因的小鼠，阻斷PDL-1/PD-1通路，則接種腫瘤細(xì)胞不能形成腫瘤。在許多人類腫瘤組織中均可檢測(cè)到PDL-1蛋白的表達(dá)，且許多癌組織較正常組織中的PDL-1表達(dá)水平明顯上調(diào)。在乳腺癌、胃癌、腸癌[5]、食管癌、卵巢癌、宮頸癌等人類腫瘤組織中檢測(cè)到PDL-1蛋白的表達(dá)，且PDL-1的表達(dá)水平和患者的臨床及預(yù)后緊密相關(guān)[6]。本研究中發(fā)現(xiàn)PDL-1蛋白的表達(dá)與乳腺癌的脈管浸潤(rùn)和淋巴結(jié)浸潤(rùn)密切相關(guān)，提示腫瘤組織表達(dá)PDL-1蛋白能夠促使癌細(xì)胞的免疫逃逸，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。本研究顯示PD1表達(dá)與CerBb-2、ER與PR表達(dá)無(wú)關(guān)，在不同的乳腺癌亞型中無(wú)明顯差異，但是與乳腺癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)，這與Muenst的研究結(jié)果一致，PD1是預(yù)后不良的因素。

國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展表明PD1/PDL1信號(hào)在腫瘤免疫治療中的作用在抗腫瘤免疫中，通常遵循腫瘤特異性T細(xì)胞活化、T細(xì)胞增殖和T細(xì)胞記憶應(yīng)答加強(qiáng)的步驟。研究表明，腫瘤細(xì)胞以及腫瘤微環(huán)境中的APCs表達(dá)的PDL-1均可經(jīng)PD-1/PDL-1信號(hào)通路抑制腫瘤抗原特異性T細(xì)胞的活化，下調(diào)T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤免疫應(yīng)答。PDL-1單抗能有效抑制局部腫瘤生長(zhǎng)；阻斷PD-1/PDL-1信號(hào)可以促進(jìn)腫瘤抗原特異性T細(xì)胞的增殖，發(fā)揮殺傷腫瘤細(xì)胞的作用；阻斷腫瘤細(xì)胞上相關(guān)PDL-1信號(hào)可上調(diào)浸潤(rùn)C(jī)D8+T細(xì)胞IFN-γ的分泌，表明PD-1/PDL-1信號(hào)通路的阻斷在以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答為目的的腫瘤免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用，特別是在基底細(xì)胞樣乳腺癌[7]；與本研究發(fā)現(xiàn)有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的乳腺癌PD1表達(dá)降低相一致，為乳腺癌的設(shè)計(jì)個(gè)體化綜合治療提供依據(jù)。