譚長(zhǎng)安 程 靜

宮頸癌是一種常見的婦科惡性腫瘤，每年新增宮頸癌病例接近百萬，且有顯著年輕化的趨勢(shì)[1]。尋找理想的腫瘤標(biāo)志物，能促進(jìn)該病的早期診治、預(yù)后評(píng)估及指導(dǎo)個(gè)體化治療，從而改善患者的預(yù)后[2]。現(xiàn)代研究顯示宮頸癌的形成并非只由基因突變本身導(dǎo)致，表觀遺傳學(xué)修飾及其后調(diào)控基因表達(dá)水平的變化都可導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生[3]。而隨著功能基因組學(xué)的發(fā)展，非編碼轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的研究與檢測(cè)得到了廣泛應(yīng)用。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過200個(gè)堿基的非編碼RNA(ncRNA)，其可在RNA 聚合酶Ⅱ的催化作用下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄與剪切修飾，但是不編碼蛋白[4-5]。lncRNA參與細(xì)胞功能及機(jī)體代謝過程，與胚胎發(fā)育、蛋白質(zhì)編碼基因調(diào)控、細(xì)胞增殖凋亡、干細(xì)胞的分化、腫瘤細(xì)胞的放化療敏感性等都有一定的相關(guān)性[6-7]。lncRNA可影響結(jié)直腸癌、乳腺癌、肝癌[8]、非小細(xì)胞肺癌[9]等腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移侵襲等生物學(xué)過程。已有學(xué)者研究顯示7%的lncRNA與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，lncRNA的異常表達(dá)能抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、克隆形成能力[10-11]。但是都為從單個(gè)lncRNA分析，沒有從組學(xué)方面進(jìn)行綜合分析。本文具體探討了宮頸癌外周血中的長(zhǎng)鏈非編碼RNA表達(dá)及其臨床意義，希望為宮頸癌的臨床早期診斷和預(yù)后判斷提供新的標(biāo)志物。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選擇2015年2月到2018年1月在我院經(jīng)病理學(xué)確診的宮頸癌患者71例為病例組，選擇同期在門診進(jìn)行常規(guī)體檢的健康婦女71例為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：臨床與檢測(cè)資料完整；病例組檢測(cè)高危型人乳頭瘤病毒陽性，宮頸癌臨床分期為ⅠB～ⅡA；對(duì)照組宮頸薄層細(xì)胞學(xué)檢測(cè)高危型人乳頭瘤病毒陰性；年齡20～60歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并感染性疾病以及肝、腎疾病患者；妊娠與哺乳期婦女；合并內(nèi)分泌疾病、自身免疫性疾病患者。病例組中年齡最小24歲，最大54歲，平均年齡(46.39±2.22)歲；平均體重指數(shù)(22.88±1.47)kg/m2；平均病程(4.11±1.84)年。對(duì)照組中年齡最小22歲，最大56歲，平均年齡(46.11±1.48)歲；平均體重指數(shù)(22.32±2.48)kg/m2。2組入選者的年齡、體重指數(shù)對(duì)比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。此項(xiàng)研究是經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者簽署知情同意書。

1.2 外周血樣本的制備

抽取2組入選者的靜脈血各4 ml置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管內(nèi)，于取血后2 h內(nèi)進(jìn)行淋巴細(xì)胞分離。將血液樣本混勻后，3 500 r/min離心10 min，加入2倍體積的無菌PBS混合，然后加入室溫平衡的8 ml淋巴細(xì)胞分離液中，以1 500 r/min離心20 min后，取中層的白細(xì)胞。再于-4 ℃下10 000 r/min離心5 min后于-80 ℃冰箱保存。

1.3 基因芯片分析

使用Trizol試劑提取2組外周血的總RNA，采用甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)RNA完整性，使用AgilentRNA 6000 Nano Kit檢測(cè)組織總RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)為260 nm和280 nm時(shí)的吸光度(A)值，比值為1.80～2.10者納入研究。逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用Cy3-dCTP標(biāo)記對(duì)照組，Cy5-dCTP標(biāo)記病例組。選用晶芯4×180k lncRNA V3.0檢測(cè)芯片(博奧生物有限公司)，實(shí)驗(yàn)步驟參考芯片實(shí)驗(yàn)過程說明，實(shí)驗(yàn)過程由公司協(xié)助完成。采用LuxScan3．0圖像分析軟件對(duì)芯片圖像進(jìn)行分析，以差異為4倍的標(biāo)準(zhǔn)來確定差異表達(dá)基因。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

本研究對(duì)芯片檢測(cè)的差異表達(dá)基因進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證，故選用GAPDH作為內(nèi)參照，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，最終得到的比值為樣品待測(cè)基因的相對(duì)值。在NCBI上查詢lncRNA編號(hào)，下載得到lncRNA序列，利用primer3軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，有大連TAKARA公司合成，引物序列見表1。

表1 lncRNA引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

選擇SPSS 22.00軟件對(duì)本研究的計(jì)量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)報(bào)告采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤，對(duì)比為t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 芯片體系情況

在本研究的芯片體系中，寡核苷酸芯片的外標(biāo)、內(nèi)標(biāo)等陽性對(duì)照信號(hào)正常，陰性對(duì)照檢測(cè)為陰性；漏點(diǎn)率不超過0.3%，平均背景值與噪音值較低，檢測(cè)體系可靠，無影響數(shù)據(jù)的污染。

2.2 表達(dá)差異分析

與對(duì)照組相比，病例組患者外周血中有差異表達(dá)基因12個(gè)，其中表達(dá)下調(diào)的基因有9個(gè)，下調(diào)倍數(shù)為(11.43±1.48)；表達(dá)上調(diào)的基因有3個(gè)，上調(diào)倍數(shù)為(7.43±1.22)。見表2。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證結(jié)果對(duì)比

隨機(jī)挑選了4個(gè)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證，其檢測(cè)結(jié)果與芯片檢測(cè)的結(jié)果是一致的。見表3。

3 討論

宮頸癌在我國已成為一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問題，在女性生殖道腫瘤中高居第一位，并且發(fā)病率呈逐年上升且年輕化趨勢(shì)[12]。當(dāng)前該病診治的最迫切的要求是缺乏早期診斷和判斷預(yù)后的可靠指標(biāo)。在組成人類基因組的幾十億個(gè)堿基對(duì)中，只有1%～2%的DNA序列可編碼成蛋白質(zhì)，而非蛋白質(zhì)編碼序列占絕大多數(shù)。其中80%的基因組序列能夠被轉(zhuǎn)錄成RNA，不過lncRNA占據(jù)基因組序列的50%左右[13]。

表2 癌外周血中的長(zhǎng)鏈非編碼RNA表達(dá)差異分布

表3 實(shí)時(shí)熒光定量RCR驗(yàn)證結(jié)果對(duì)比

lncRNA是調(diào)控非編碼RNA中的一種，為不具有編碼蛋白質(zhì)功能的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。lncRNA具有空間和時(shí)間特異性，可在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，參與機(jī)體基因轉(zhuǎn)錄激活與干擾、基因組印跡、X染色體失活、染色質(zhì)修飾與重塑、核內(nèi)運(yùn)輸、X染色體失活等多種生物學(xué)過程的調(diào)控，可在腫瘤發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮重要作用[14-15]?；蛐酒夹g(shù)是當(dāng)前研究lncRNA表達(dá)的主要技術(shù)之一，具有覆蓋全面、靈敏、準(zhǔn)確、高效的特點(diǎn)[16]。有學(xué)者對(duì)12例腎癌組織及其癌旁正常組織進(jìn)行差異表達(dá)譜分析，得到916個(gè)差異表達(dá)的lncRNAs，且上調(diào)的lncRNAs比下調(diào)的lncRNAs顯著減少[17]。本研究采用的4×180k lncRNA V3.0檢測(cè)芯片是目前涵蓋lncRNA序列最全面的芯片之一，不但包括眾多l(xiāng)ncRNA數(shù)據(jù)庫最新版本，還包括當(dāng)前最新的848條中等長(zhǎng)度的非編碼RNA。本研究芯片檢測(cè)結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，病例組患者外周血中有差異表達(dá)基因12個(gè)，其中表達(dá)下調(diào)的基因有9個(gè)，下調(diào)倍數(shù)為(11.43±1.48)；表達(dá)上調(diào)的基因有3個(gè)，上調(diào)倍數(shù)為(7.43±1.22)。當(dāng)前有研究顯示lncRNA可能調(diào)控著人乳頭瘤病毒的致癌過程，可降低或增強(qiáng)致癌過程中調(diào)控靶基因、靶蛋白的表達(dá)，從而阻斷或促進(jìn)病變進(jìn)展[18]。還有學(xué)者應(yīng)用基因芯片技術(shù)對(duì)12例宮頸癌癌灶及其相應(yīng)癌旁組織樣本進(jìn)行l(wèi)ncRNAs差異分析，發(fā)現(xiàn)14個(gè)lncRNAs表達(dá)顯著下調(diào)，18個(gè)lncRNAs表達(dá)顯著上調(diào)[19]。

當(dāng)前腫瘤治療面臨的挑戰(zhàn)主要是發(fā)現(xiàn)癌癥異常表達(dá)的特定基因，并明確這些差異基因的功能。近些年發(fā)現(xiàn)的與宮頸癌促癌作用相關(guān)的lncRNAs主要有H19、EBIC、Linc-P21等[20]，與宮頸癌抑癌作用有關(guān)的lncRNAs主要有XLOC_010588等，改變其表達(dá)水平對(duì)宮頸癌的增殖、侵襲等生物學(xué)行為有顯著的影響[21]。本研究隨機(jī)挑選了4個(gè)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證，其檢測(cè)結(jié)果與芯片檢測(cè)的結(jié)果是一致的。KLF2、KLF6可共同調(diào)控EN02基因的表達(dá)，該基因定位于12號(hào)染色體，其為一種低氧應(yīng)力蛋白，也為一種糖酵解酶的二聚體，可以通過增加無氧代謝提高腫瘤細(xì)胞對(duì)低氧環(huán)境的耐受性，其過度表達(dá)與惡性腫瘤的預(yù)后有顯著相關(guān)性[22]。KLF8、KLF3可參與調(diào)控人類核仁素基因，其產(chǎn)物為核仁磷酸蛋白，可參與核糖體的合成和成熟過程，主要位于核仁中密集的原纖維區(qū)域[23-24]。有研究表明核仁素可通過減弱視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因、p53基因的功能而減弱細(xì)胞的凋亡過程，從而在宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展過程中起到調(diào)控作用[25]。同時(shí)本研究的基因差異表達(dá)譜與相關(guān)報(bào)道重合率較低，主要的原因可能在于本研究采用的樣本為外周血，而非組織樣本，且選擇的年齡比較集中。不過本研究也有一定的局限性，本研究為小樣本的研究，存在一定的研究偏倚，將在下一步進(jìn)行深入分析。

總之，lncRNAs基因芯片是檢測(cè)宮頸癌外周血差異表達(dá)基因的一種高通量、高效、快速的檢測(cè)手段，KLF2、KLF6、KLF8、KLF3可能是潛在的基因治療靶點(diǎn)。