張建林 吳 韋 林見敏

結(jié)直腸癌是1種常見惡性腫瘤，在我國發(fā)病率和病死率中，結(jié)直腸癌已經(jīng)上升到第四位[1]。由于結(jié)直腸癌發(fā)病隱匿，患者在就診時往往已經(jīng)屬于進展期，預(yù)后比較差，治療結(jié)直腸癌的主要方法是結(jié)直腸癌根治術(shù)[2]。近年來，微小RNA成為腫瘤分子研究領(lǐng)域的重點，微小RNA參與腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移、凋亡、增殖、多藥耐藥等過程。已有報道顯示在多種腫瘤中，微小RNA-192表達異常。體外細胞實驗表明，微小RNA-192能夠抑制結(jié)直腸癌細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲[3-4]。在正常組織和結(jié)直腸癌組織中，微小RNA-192存在表達差異。本文對微小RNA-192在Ⅱ、Ⅲ期結(jié)直腸癌組織中表達與術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)性進行探究，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取我院2017年1月至2018年12月的130例進行結(jié)直腸癌根除術(shù)的Ⅱ、Ⅲ期患者的新鮮標本。所有患者明確研究目的，簽署知情同意書?；颊咝g(shù)前沒有進行放化療治療。所有患者臨床資料完整。排除炎性腸病患者、家族性息肉患者、多原發(fā)癌患者?；颊咝g(shù)后12個月內(nèi)進行腸鏡檢查。術(shù)后每3個月或者半年，進行一次腹盆腔影像學檢查以及癌胚抗原檢測。75例患者術(shù)后進行輔助化療，使用5-氟尿嘧啶。依據(jù)影像學檢查、病理活檢、腸鏡檢查或者二次手術(shù)病理學結(jié)果，3年內(nèi)沒有發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的81例，作為未轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)組，3年內(nèi)發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的有49例，作為轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)組。選取無癌細胞的癌旁組織，作為對照組，共50例患者。所有標本術(shù)后放置于液氮中。患者從采取結(jié)直腸癌根除術(shù)進行治療后，到第一次轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的時間，為無復(fù)發(fā)生存時間。

1.2 方法

使用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、高速冷凍式離心機、實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)儀、紫外分光光度儀等材料和儀器。①將液氮中的標本進行研磨，使用Trizol試劑盒，提取標本中的總RNA。嚴格按照試劑盒的要求進行操作。對獲得的總RNA檢測吸光度，使用紫外分光光度儀。對于A260和A280的比值超過1.8的樣本，檢測miRNA。檢測RNA的完整性，采用1%瓊脂糖凝膠電泳的方式[5]。②配置反轉(zhuǎn)錄體系20 μl。使用無RNA酶雙蒸水、酶混合物、緩沖液、反轉(zhuǎn)錄酶、混合引物等，在37 ℃條件下一小時，在95 ℃條件下5 min，迅速冷卻后，在-80 ℃的冰箱中保存。③使用Primer 5.0軟件，對微小RNA-192和內(nèi)參U6引物進行上下游設(shè)計[6]。下游引物使用試劑盒中Uni-miR qPCR Primer，嚴格按照操作說明，在94 ℃條件下，預(yù)變性10 cm，94 ℃下的14 s，60 ℃下25 s，依次進行40次循環(huán)。設(shè)置3個反應(yīng)復(fù)孔，取每個待測樣本的平均值。使用內(nèi)參U6，對微小RNA-192相對表達量進行標準化處理。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 未轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)組患者和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)組患者的一般情況

未轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)組患者的一般情況，包括年齡、性別、腫瘤位置、脈管癌栓、分化程度、術(shù)前CEA、N分期、TNM分期、術(shù)后輔助化療、T分期，與轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)組患者相比，兩組數(shù)據(jù)沒有明顯差異(P>0.5)，沒有統(tǒng)計學意義，見表1。

2.2 微小RNA-192在結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中的表達

130例進行結(jié)直腸癌根除術(shù)的Ⅱ、Ⅲ期患者，微小RNA-192相對表達量為0.25±0.09，無癌細胞的癌旁組織的對照組，微小RNA-192相對表達量為0.58±0.10，結(jié)直腸癌患者的微小RNA-192相對表達量，明顯低于癌旁組織的對照組，兩組存在明顯差異(P<0.05)，具有統(tǒng)計學意義。未轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)組結(jié)直腸癌患者，腫瘤組織中微小RNA-192的相對表達量為0.33±0.08，轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)組結(jié)直腸癌患者，腫瘤組織中微小RNA-192的相對表達量為0.12±0.02，轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)組明顯低于未轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)組，兩組存在明顯差異(P<0.05)，具有統(tǒng)計學意義。

表1 未轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)組患者和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)組患者的一般情況比較(例，%)

2.3 微小RNA-192表達與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系

根據(jù)130例結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中的微小RNA-192表達情況，將患者分為低表達組，以及高表達組。低表達組有35例，高表達組有95例。結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中的微小RNA-192表達，與患者的性別、年齡、腫瘤位置、脈管癌栓、分化程度、N分期、TNM分期、T分期無明顯關(guān)系(P>0.05)，但與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有明顯差異(P<0.05)，見表2。

2.4 微小RNA-192表達與患者預(yù)后的關(guān)系

微小RNA-192低表達組患者有35例，術(shù)后復(fù)發(fā)22例，占62.86%，微小RNA-192高表達組患者有95例，術(shù)后復(fù)發(fā)26例，占27.37%，微小RNA-192低表達組患者的術(shù)后復(fù)發(fā)率，明顯高于微小RNA-192高表達組患者，兩組存在明顯差異(P<0.05)，具有統(tǒng)計學意義。低表達組患者術(shù)后中位無復(fù)發(fā)生存時間為(14.1±1.2)個月，高表達組患者術(shù)后的中位無復(fù)發(fā)生存時間為(18.6±2.1)個月，兩組數(shù)據(jù)存在明顯差異(P<0.05)，具有統(tǒng)計學意義。Ⅱ期患者的無復(fù)發(fā)生存率，微小RNA-192低表達患者和高表達患者沒有明顯差異(P>0.05)，無統(tǒng)計學意義。Ⅲ期患者的無復(fù)發(fā)生存率，微小RNA-192低表達患者和高表達患者，存在明顯差異(P<0.05)，有統(tǒng)計學意義。根據(jù)Cox比例風險模型分析，影響結(jié)直腸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的獨立危險因素，有微小RNA-192表達和腫瘤分期。

表2 微小RNA-192表達與結(jié)直腸癌組織臨床病理特征的關(guān)系(例，%)

3 討論

臨床上治療Ⅱ、Ⅲ期結(jié)直腸癌的主要方式是根治性手術(shù)切除，但術(shù)后的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率仍然比較高，影響患者的生存。微小RNA是1種小分子單鏈非編碼RNA，含有22-26個堿基，能夠與相應(yīng)的mRNA靶基因互補匹配，從而對該靶基因的轉(zhuǎn)錄翻譯進行抑制，也可以與其他蛋白組成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體[7-8]。微小RNA在細胞遷移、凋亡、分化、增殖，以及組織生長中發(fā)揮著重要的作用。在多種腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移、發(fā)展和進展中，微小RNA也發(fā)揮著生物學作用[9-10]。在正常腎臟、肝臟、結(jié)直腸等組織中，微小RNA-192均有表達。腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中，微小RNA-192通過調(diào)控相關(guān)的蛋白、靶基因，從而發(fā)生作用。有認為微小RNA-192對同源異形盒2，與鋅指E-盒結(jié)合的表達的調(diào)控，調(diào)節(jié)E-鈣黏蛋白，從而調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲[11]。也有認為通過p53作用，在結(jié)直腸癌細胞增殖的過程中，微小RNA-192發(fā)揮作用，使用癌細胞停滯在G1和G2期[12]。本次研究顯示，相比癌旁組織，微小RNA-192在患者的腫瘤組織中低表達(P<0.05)，未轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)組的表達高于轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)組(P<0.05)，提示結(jié)直腸癌腫瘤組織中，微小RNA-192低表達，并且可能與術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)。結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中的微小RNA-192表達，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)，提示在結(jié)直腸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中，微小RNA-192發(fā)揮著重要的作用。本次研究中，轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的患者，微小RNA-192低表達的無復(fù)發(fā)生存時間，比高表達的短，提示微小RNA-192與結(jié)直腸癌患者術(shù)后無復(fù)發(fā)生存時間有密切的關(guān)系。低表達組的術(shù)后復(fù)發(fā)率明顯高于高表達組，進一步顯示了微小RNA-192與患者術(shù)后復(fù)發(fā)的相關(guān)性，低表達微小RNA-192會促進術(shù)后復(fù)發(fā)[13-14]。腫瘤分期、微小RNA-192表達，是影響患者無復(fù)發(fā)生存時間的獨立危險因素，因此對腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測，可以采用微小RNA-192作為1個參考指標[15]。

綜上所述，在Ⅱ、Ⅲ期結(jié)直腸癌組織中，微小RNA-192低表達，微小RNA-192與結(jié)直腸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有密切的關(guān)系。