張建林 吳 韋 林見敏
結(jié)直腸癌是1種常見惡性腫瘤,在我國(guó)發(fā)病率和病死率中,結(jié)直腸癌已經(jīng)上升到第四位[1]。由于結(jié)直腸癌發(fā)病隱匿,患者在就診時(shí)往往已經(jīng)屬于進(jìn)展期,預(yù)后比較差,治療結(jié)直腸癌的主要方法是結(jié)直腸癌根治術(shù)[2]。近年來(lái),微小RNA成為腫瘤分子研究領(lǐng)域的重點(diǎn),微小RNA參與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、凋亡、增殖、多藥耐藥等過(guò)程。已有報(bào)道顯示在多種腫瘤中,微小RNA-192表達(dá)異常。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明,微小RNA-192能夠抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲[3-4]。在正常組織和結(jié)直腸癌組織中,微小RNA-192存在表達(dá)差異。本文對(duì)微小RNA-192在Ⅱ、Ⅲ期結(jié)直腸癌組織中表達(dá)與術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)性進(jìn)行探究,現(xiàn)報(bào)告如下。
選取我院2017年1月至2018年12月的130例進(jìn)行結(jié)直腸癌根除術(shù)的Ⅱ、Ⅲ期患者的新鮮標(biāo)本。所有患者明確研究目的,簽署知情同意書?;颊咝g(shù)前沒有進(jìn)行放化療治療。所有患者臨床資料完整。排除炎性腸病患者、家族性息肉患者、多原發(fā)癌患者。患者術(shù)后12個(gè)月內(nèi)進(jìn)行腸鏡檢查。術(shù)后每3個(gè)月或者半年,進(jìn)行一次腹盆腔影像學(xué)檢查以及癌胚抗原檢測(cè)。75例患者術(shù)后進(jìn)行輔助化療,使用5-氟尿嘧啶。依據(jù)影像學(xué)檢查、病理活檢、腸鏡檢查或者二次手術(shù)病理學(xué)結(jié)果,3年內(nèi)沒有發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的81例,作為未轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)組,3年內(nèi)發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的有49例,作為轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)組。選取無(wú)癌細(xì)胞的癌旁組織,作為對(duì)照組,共50例患者。所有標(biāo)本術(shù)后放置于液氮中?;颊邚牟扇〗Y(jié)直腸癌根除術(shù)進(jìn)行治療后,到第一次轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的時(shí)間,為無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間。
使用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、高速冷凍式離心機(jī)、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)儀、紫外分光光度儀等材料和儀器。①將液氮中的標(biāo)本進(jìn)行研磨,使用Trizol試劑盒,提取標(biāo)本中的總RNA。嚴(yán)格按照試劑盒的要求進(jìn)行操作。對(duì)獲得的總RNA檢測(cè)吸光度,使用紫外分光光度儀。對(duì)于A260和A280的比值超過(guò)1.8的樣本,檢測(cè)miRNA。檢測(cè)RNA的完整性,采用1%瓊脂糖凝膠電泳的方式[5]。②配置反轉(zhuǎn)錄體系20 μl。使用無(wú)RNA酶雙蒸水、酶混合物、緩沖液、反轉(zhuǎn)錄酶、混合引物等,在37 ℃條件下一小時(shí),在95 ℃條件下5 min,迅速冷卻后,在-80 ℃的冰箱中保存。③使用Primer 5.0軟件,對(duì)微小RNA-192和內(nèi)參U6引物進(jìn)行上下游設(shè)計(jì)[6]。下游引物使用試劑盒中Uni-miR qPCR Primer,嚴(yán)格按照操作說(shuō)明,在94 ℃條件下,預(yù)變性10 cm,94 ℃下的14 s,60 ℃下25 s,依次進(jìn)行40次循環(huán)。設(shè)置3個(gè)反應(yīng)復(fù)孔,取每個(gè)待測(cè)樣本的平均值。使用內(nèi)參U6,對(duì)微小RNA-192相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。
未轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)組患者的一般情況,包括年齡、性別、腫瘤位置、脈管癌栓、分化程度、術(shù)前CEA、N分期、TNM分期、術(shù)后輔助化療、T分期,與轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)組患者相比,兩組數(shù)據(jù)沒有明顯差異(P>0.5),沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見表1。
130例進(jìn)行結(jié)直腸癌根除術(shù)的Ⅱ、Ⅲ期患者,微小RNA-192相對(duì)表達(dá)量為0.25±0.09,無(wú)癌細(xì)胞的癌旁組織的對(duì)照組,微小RNA-192相對(duì)表達(dá)量為0.58±0.10,結(jié)直腸癌患者的微小RNA-192相對(duì)表達(dá)量,明顯低于癌旁組織的對(duì)照組,兩組存在明顯差異(P<0.05),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。未轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)組結(jié)直腸癌患者,腫瘤組織中微小RNA-192的相對(duì)表達(dá)量為0.33±0.08,轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)組結(jié)直腸癌患者,腫瘤組織中微小RNA-192的相對(duì)表達(dá)量為0.12±0.02,轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)組明顯低于未轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)組,兩組存在明顯差異(P<0.05),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
表1 未轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)組患者和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)組患者的一般情況比較(例,%)
根據(jù)130例結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中的微小RNA-192表達(dá)情況,將患者分為低表達(dá)組,以及高表達(dá)組。低表達(dá)組有35例,高表達(dá)組有95例。結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中的微小RNA-192表達(dá),與患者的性別、年齡、腫瘤位置、脈管癌栓、分化程度、N分期、TNM分期、T分期無(wú)明顯關(guān)系(P>0.05),但與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有明顯差異(P<0.05),見表2。
微小RNA-192低表達(dá)組患者有35例,術(shù)后復(fù)發(fā)22例,占62.86%,微小RNA-192高表達(dá)組患者有95例,術(shù)后復(fù)發(fā)26例,占27.37%,微小RNA-192低表達(dá)組患者的術(shù)后復(fù)發(fā)率,明顯高于微小RNA-192高表達(dá)組患者,兩組存在明顯差異(P<0.05),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。低表達(dá)組患者術(shù)后中位無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間為(14.1±1.2)個(gè)月,高表達(dá)組患者術(shù)后的中位無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間為(18.6±2.1)個(gè)月,兩組數(shù)據(jù)存在明顯差異(P<0.05),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Ⅱ期患者的無(wú)復(fù)發(fā)生存率,微小RNA-192低表達(dá)患者和高表達(dá)患者沒有明顯差異(P>0.05),無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Ⅲ期患者的無(wú)復(fù)發(fā)生存率,微小RNA-192低表達(dá)患者和高表達(dá)患者,存在明顯差異(P<0.05),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析,影響結(jié)直腸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,有微小RNA-192表達(dá)和腫瘤分期。
表2 微小RNA-192表達(dá)與結(jié)直腸癌組織臨床病理特征的關(guān)系(例,%)
臨床上治療Ⅱ、Ⅲ期結(jié)直腸癌的主要方式是根治性手術(shù)切除,但術(shù)后的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率仍然比較高,影響患者的生存。微小RNA是1種小分子單鏈非編碼RNA,含有22-26個(gè)堿基,能夠與相應(yīng)的mRNA靶基因互補(bǔ)匹配,從而對(duì)該靶基因的轉(zhuǎn)錄翻譯進(jìn)行抑制,也可以與其他蛋白組成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體[7-8]。微小RNA在細(xì)胞遷移、凋亡、分化、增殖,以及組織生長(zhǎng)中發(fā)揮著重要的作用。在多種腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移、發(fā)展和進(jìn)展中,微小RNA也發(fā)揮著生物學(xué)作用[9-10]。在正常腎臟、肝臟、結(jié)直腸等組織中,微小RNA-192均有表達(dá)。腫瘤發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中,微小RNA-192通過(guò)調(diào)控相關(guān)的蛋白、靶基因,從而發(fā)生作用。有認(rèn)為微小RNA-192對(duì)同源異形盒2,與鋅指E-盒結(jié)合的表達(dá)的調(diào)控,調(diào)節(jié)E-鈣黏蛋白,從而調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲[11]。也有認(rèn)為通過(guò)p53作用,在結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的過(guò)程中,微小RNA-192發(fā)揮作用,使用癌細(xì)胞停滯在G1和G2期[12]。本次研究顯示,相比癌旁組織,微小RNA-192在患者的腫瘤組織中低表達(dá)(P<0.05),未轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)組的表達(dá)高于轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)組(P<0.05),提示結(jié)直腸癌腫瘤組織中,微小RNA-192低表達(dá),并且可能與術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)。結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中的微小RNA-192表達(dá),與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05),提示在結(jié)直腸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中,微小RNA-192發(fā)揮著重要的作用。本次研究中,轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的患者,微小RNA-192低表達(dá)的無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間,比高表達(dá)的短,提示微小RNA-192與結(jié)直腸癌患者術(shù)后無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間有密切的關(guān)系。低表達(dá)組的術(shù)后復(fù)發(fā)率明顯高于高表達(dá)組,進(jìn)一步顯示了微小RNA-192與患者術(shù)后復(fù)發(fā)的相關(guān)性,低表達(dá)微小RNA-192會(huì)促進(jìn)術(shù)后復(fù)發(fā)[13-14]。腫瘤分期、微小RNA-192表達(dá),是影響患者無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,因此對(duì)腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè),可以采用微小RNA-192作為1個(gè)參考指標(biāo)[15]。
綜上所述,在Ⅱ、Ⅲ期結(jié)直腸癌組織中,微小RNA-192低表達(dá),微小RNA-192與結(jié)直腸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有密切的關(guān)系。