歐陽樂軍 馬銘賽 陳梓洛 黃嘉玲 布梁灝 陳自銀 李莉梅

(廣東石油化工學(xué)院生物工程學(xué)院，茂名 525000)

近年來，隨著越來越多物種全基因組測序的完成，人類已逐步邁進(jìn)后基因組時(shí)代——功能基因組時(shí)代。后基因組時(shí)代面臨的一個(gè)重大挑戰(zhàn)是，如何從大量基因組數(shù)據(jù)庫中獲得特定基因的功能和相應(yīng)的應(yīng)用價(jià)值信息，而基因定點(diǎn)編輯技術(shù)恰恰是解決這一難題的有力工具[1]。2013年，基因定點(diǎn)編輯技術(shù)CRISPR/Cas9被研究人員報(bào)道，該基因編輯體系只需設(shè)計(jì)一個(gè)sgRNA就可對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行定點(diǎn)編輯，具有操作簡單、成本低、效率高等特點(diǎn)，成為新一代最受歡迎的基因編輯技術(shù)[2]。相比傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，CRISPR/Cas9技術(shù)表達(dá)載體插入位點(diǎn)與基因編輯的位點(diǎn)不同，外源插入質(zhì)粒待基因編輯完成后，可在后代配子形成過程中染色體分離時(shí)而被去除，編輯后不留下轉(zhuǎn)基因的痕跡，無須引入外源基因，因而生物安全性高，無轉(zhuǎn)基因爭議，應(yīng)用前景廣闊[3～4]。但怎樣快速篩選獲得不含外源轉(zhuǎn)化元件的基因編輯后代是一個(gè)關(guān)鍵技術(shù)問題[5]。

本研究創(chuàng)造性的將擬南芥種皮特異性啟動(dòng)子At2S3與熒光篩選標(biāo)記基mCherry組裝進(jìn)植物基因組定點(diǎn)編輯的CRISPR載體pHDE中，以擬南芥as1為靶基因[6]，構(gòu)建一種帶有熒光篩選標(biāo)記且可在轉(zhuǎn)化后代中實(shí)現(xiàn)Cas9等外源轉(zhuǎn)化元件有效分離剔除的基因安全、高效編輯體系，并在擬南芥進(jìn)行驗(yàn)證研究，為建立一種更為生態(tài)安全、更高編輯效率的CRISPR/Cas9技術(shù)體系提供借鑒與參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

DH5α感受態(tài)細(xì)胞(鼎國MCC001)、GV3101農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞(鼎國)、pHDE基礎(chǔ)載體(本實(shí)驗(yàn)室保存)、含mCherry與啟動(dòng)子的載體pHDE-mCherry質(zhì)粒由加州大學(xué)圣地亞哥分校趙云德教授提供。高保真PFU酶、DNA Marker、限制性內(nèi)切酶BsaⅠ購置NEB中國公司。本實(shí)驗(yàn)所有引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建

1.2.1.1 靶位點(diǎn)的選擇及引物序列

根據(jù)CRISPRscan找到目標(biāo)基因as1的高評(píng)分靶點(diǎn)為目標(biāo)序列。利用rgenome評(píng)估高評(píng)分靶點(diǎn)的脫靶情況，運(yùn)用SnapGene軟件進(jìn)行載體構(gòu)建分析，運(yùn)用Primer Premier 5軟件進(jìn)行引物分析；運(yùn)用DNAMAN軟件進(jìn)行序列分析(表1)。

表1 研究所用引物信息

1.2.1.2 重組質(zhì)粒pHDE-At2S3-mCherry的構(gòu)建

以含有所要擴(kuò)增目的基因的質(zhì)粒pHDE-mCherry為模板，分別擴(kuò)增種皮特異性啟動(dòng)子(At2S3)和熒光篩選標(biāo)記基因(mCherry)，以上述At2S3和mCherry的PCR產(chǎn)物為模板，用At2S3啟動(dòng)子的正向引物IDP-F和mCherry反向引物mCherry-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢驗(yàn)并切膠回收得到At2S3+mCherry的片段。將此片段與酶切后的pHDE質(zhì)粒進(jìn)行重組。熱擊法轉(zhuǎn)化大腸桿菌、菌落PCR驗(yàn)證，將陽性質(zhì)粒送樣測序驗(yàn)證，具體載體構(gòu)建方法參照歐陽樂軍等[7]。載體構(gòu)建各元件組成如圖1所示。

圖1 pHDE-At2S3+mCherry-as1重組質(zhì)粒示意圖Fig.1 Schematic representation of recombinant plasmid pHDE-At2S3+mCherry-as1

1.2.1.3 重組質(zhì)粒pHDE-At2S3-mCherry-as1的構(gòu)建

PCR擴(kuò)增as1-gRNA，切膠回收后與酶切過的pHDE-At2S3-mCherry質(zhì)粒進(jìn)行重組。熱擊法轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，對(duì)陽性重組質(zhì)粒測序驗(yàn)證。

1.2.2 工程菌的制備及擬南芥轉(zhuǎn)化

采用凍融法，將測序正確的重組質(zhì)粒pHDE-At2S3-mCherry-as1轉(zhuǎn)進(jìn)農(nóng)桿菌，并進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，制備工程菌液。經(jīng)花序浸染法浸泡擬南芥的花苞，收集轉(zhuǎn)化后的種子，通過580 nm波長下的熒光顯微鏡篩選帶有紅色熒光的種子，種植培育獲得T1代轉(zhuǎn)化植株。

1.2.3as1基因編輯效率鑒定

在目標(biāo)基因as1的兩個(gè)靶序列上下游設(shè)計(jì)鑒定引物as1-GT1與as1-GT2，對(duì)挑選出的T1代紅色熒光種子培育的植株用PCR儀(ABI Veriti 96)進(jìn)行PCR及測序鑒定，PCR引物見表1，PCR反應(yīng)條件(PrimeSTAR Max DNA Polymerase)為94℃預(yù)變性4 min，40個(gè)循環(huán)(94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 450 s)，最后72℃延伸2 min。因兩個(gè)target的靶序列設(shè)計(jì)將使目標(biāo)基因as1模板從中間大片段敲除，純合突變只能擴(kuò)增得到一個(gè)小片段，雜合突變將得到大小兩個(gè)片段，而野生型只能擴(kuò)增出一個(gè)大片段。

1.2.4 Cas9外源轉(zhuǎn)化元件的分離鑒定

以表達(dá)載體上的Cas9序列設(shè)計(jì)Cas9鑒定引物(表1)，以T1代帶紅色熒光種子與T2無熒光種子后代植株基因組為模板，擴(kuò)增Cas9序列，擴(kuò)增反應(yīng)程序同1.2.3，擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行電泳鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建結(jié)果及分析

2.1.1 重組質(zhì)粒pHDE-At2S3-mCherry的構(gòu)建

限制性內(nèi)切酶BsaⅠ酶切后載體pHDE與At2S3-mCherry進(jìn)行連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α后菌落PCR鑒定,陽性克隆擴(kuò)增出800 bp左右的特異性片段，大小與At2S3-mCherry片段大小相符。提取鑒定結(jié)果為陽性的菌液質(zhì)粒，測序結(jié)果正確，證明重組載體pHDE-At2S3-mCherry構(gòu)建成功。PCR及測序鑒定結(jié)果如圖2所示。

圖2 重組質(zhì)粒pHDE-At2S3-mCherry構(gòu)建PCR A.At2S3的PCR擴(kuò)增；B.篩選標(biāo)記基因mCherry的PCR擴(kuò)增；C.At2S3+mCherry的片段PCR擴(kuò)增；D.陽性菌落PCR驗(yàn)證Fig.2 PCR amplification of pHDE-At2S3-mCherry A.PCR amplification of the 35S promoter; B.PCR amplification of mCherry; C.PCR amplification of At2S3+mCherry fragment; D.PCR verification of Positive colony

圖3 目的片段as1-gRNA片段的PCR擴(kuò)增 1.DNA標(biāo)準(zhǔn)品；2.為擴(kuò)增后的目的片段Fig.3 PCR amplification of the as1-gRNA 1.DNA standard; 2.PCR amplification of target fragments

圖4 重組質(zhì)粒PCR驗(yàn)證 1.DNA標(biāo)準(zhǔn)品；2～3.重組質(zhì)粒PCR；4.陰性對(duì)照；5.陽性對(duì)照Fig.4 PCR verification of recombinant plasmid 1.DNA standard; 2～3.PCR amplification of recombinant plasmid; 4.Negative control; 5.Positive control

2.1.2 重組質(zhì)粒pHDE-At2S3+mCherry-as1的構(gòu)建

將線性化的載體與PCR擴(kuò)增得到的as1片段組裝，重組質(zhì)粒經(jīng)熱擊法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，質(zhì)粒PCR鑒定后，選擇陽性質(zhì)粒送樣測序(圖3～4)。測序結(jié)果顯示as1片段成功插入，pHDE-At2S3+mCherry-as1載體構(gòu)建成功。

2.2 擬南芥轉(zhuǎn)化及突變體鑒定結(jié)果

采用花序浸染法浸泡擬南芥的花苞，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化成功后的T1代種子在熒光顯微鏡下具有紅色熒光(圖5:A)，挑選有熒光的種子培育得到T1代植株，Cas9 PCR鑒定結(jié)果為陽性(圖8)。隨機(jī)提取部分植株基因組進(jìn)行as1的PCR檢測，17顆T1代植株中共有7株轉(zhuǎn)化后代可以擴(kuò)增出一條小帶的純合突變，純合突變的比率達(dá)到41%(圖6)，與野生型相比，突變性狀明顯(圖5:C,D)，與已知的as1突變體性狀相同。將擴(kuò)增得到的純合突變小帶回收送樣至上海生工廣州測序部測序，結(jié)果與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)預(yù)期的編輯效果完全一致，在兩個(gè)target間成功編輯了405 bp大小的堿基(圖7)。圖中標(biāo)記位置為前后兩個(gè)target的PAM位置前3個(gè)堿基處，在此中間的405 bp堿基序列被成功敲除。

2.3 外源轉(zhuǎn)化元件在純合突變體中的分離鑒定

從純合突變的的T1代種子中篩選出不帶熒光的種子，培育得到T2代植株，提取基因組對(duì)外源Cas9等轉(zhuǎn)化元件進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果擴(kuò)增不到Cas9序列，說明不帶熒光的種子后代已不含有外源Cas9轉(zhuǎn)化元件(圖9)，

圖5 擬南芥突變體與野生型的表型比較 A.熒光種子和野生型種子;B.擬南芥野生型幼苗；C～D.突變純合體幼苗Fig.5 The Phenotypic comparison of Arabidopsis mutants and wild type A.Fluorescent seeds and Wild seeds; B.The Arabidopsis wild-type seedling; C-D.Themutant homozygotes seedling

圖6 T1代植株中純合突變PCR鑒定 M.DNA標(biāo)準(zhǔn)品； 1～17.T1代植株，純合突變：3～5、7、9、12、13；雜合突變：1、2、8、10-11、16；18.野生型對(duì)照Fig.6 PCR identification of mutant in T1 plants M.DNA standard；1-17.Homozygous mutation of T1 generation plants; 3-5、7、9、12、13；Heterozygous mutation of T1 generation plants; 1,2,8,10-11,16；18.Wild-type

圖7 純合突變測序結(jié)果圖Fig.7 The sequencing result of homozygous mutation

圖8 T1代植株中Cas9基因PCR鑒定圖 M.DNA標(biāo)準(zhǔn)品；1～2.陽性與陰性對(duì)照；3～8.T1代純合編輯植株Fig.8 PCR identification of Cas9 in T1 plants M.DNA standard；1-2.Positive and negative control; 3-8.Homozygous mutation of T1 generation plants

圖9 T2代植株Cas9基因PCR鑒定圖 M.DNA標(biāo)準(zhǔn)品；1.野生型；2～16.T2代純合編輯植株Fig.9 Identification of target genes knockout in T2 plants M.DNA standard; 1.Wild-typecontrol; 2-16.Homozygous mutation of T2 generation plants

3 討論

CRISPR/Cas9技術(shù)與傳統(tǒng)植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)相比，具有更明顯的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值與優(yōu)勢。一是傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)具有插入位點(diǎn)的隨機(jī)性與不確定性，易產(chǎn)生其他內(nèi)源基因破壞、外源基因沉默等現(xiàn)象，使基因的精確修飾與改造效率低下；其次是CRISPR/Cas9技術(shù)體系在完成對(duì)靶標(biāo)基因的遺傳編輯之后通過后代配子形成過程中染色體的分離而去除，在編輯后代中不留下轉(zhuǎn)基因的痕跡，無須引用外源基因，生物安全性高，特別是隨著CRISPR/Cas9技術(shù)的進(jìn)一步成熟，其所具有的優(yōu)勢得到進(jìn)一步顯現(xiàn)。應(yīng)用范圍也將越來越廣泛，對(duì)于任何物種的基因組定點(diǎn)編輯都將成為可能[8～10]。

本研究通過設(shè)計(jì)兩對(duì)sgRNA，使其同時(shí)識(shí)別基因靶序列，提高靶標(biāo)識(shí)別特異性，在T1代中獲得純合突變子的概率高達(dá)40%以上。同時(shí)，通過將種皮特異性啟動(dòng)子At2S3和mCherry熒光蛋白偶聯(lián)在載體中，在熒光顯微鏡特定波長的照射下，利用熒光蛋白所發(fā)出的特殊熒光，實(shí)現(xiàn)對(duì)突變體的可視化篩選，提高篩選效率。最后特異性的利用CRISPR/Cas9技術(shù)體系在完成對(duì)靶標(biāo)基因的遺傳編輯之后通過后代配子形成過程中染色體的分離而去除，在編輯后代中不留下轉(zhuǎn)基因的痕跡，無須引用外源基因，生物安全性高的特點(diǎn)，應(yīng)用外源轉(zhuǎn)化元件中帶有熒光蛋白的標(biāo)記特性，先篩選帶有熒光的種子，提高獲得轉(zhuǎn)化后代陽性植株比例，隨后從純合突變中挑選不帶熒光的轉(zhuǎn)化后代，將外源轉(zhuǎn)化元件實(shí)現(xiàn)成功分離，獲得不帶有Cas9等轉(zhuǎn)化元件的基因編輯后代，這種通過可視化熒光篩選標(biāo)記來快速判斷種子中是否含有CRISPR/Cas9表達(dá)系統(tǒng)的方法簡單易行，準(zhǔn)確率高，對(duì)基因編輯事件的初步檢測只需要進(jìn)行簡單的PCR分析即可，極大的提高了工作效率。本研究構(gòu)建的一種帶有可視化篩選標(biāo)記的大片段基因編輯方法，為有性繁殖作物基因編輯后代中獲得無外源轉(zhuǎn)化元件的新種質(zhì)資源提供了一種全新的技術(shù)參考，具有一定的創(chuàng)新性[11～12]。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為一種有效的基因編輯工具，具有操作簡單，高效性和特異性等其他基因編輯工具所不具備的優(yōu)勢[13～16]。研究人員可以有效的針對(duì)不同基因進(jìn)行編輯，深入研究基因功能，還可一次編輯多個(gè)基因，對(duì)于多基因控制的信號(hào)通路中互作機(jī)制等基礎(chǔ)科學(xué)問題研究以及多基因調(diào)控的農(nóng)林作物重要經(jīng)濟(jì)、農(nóng)藝性狀遺傳改良具有十分明顯的應(yīng)用價(jià)值[17～18]。想要更好的實(shí)現(xiàn)對(duì)CRISPR/Cas9的應(yīng)用，研究人員還面臨如何減少脫靶現(xiàn)象的發(fā)生以及進(jìn)一步提高基因編輯效率？隨著CRISPR/Cas9的廣泛應(yīng)用與深入開展，科技工作者一定可以更好的利用CRISPR/Cas9技術(shù)為人類的生產(chǎn)生活服務(wù)[19～20]。