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        響應(yīng)面法優(yōu)化樺菌芝三萜超聲提取工藝

        2019-11-15 02:21:52黑育榮陳勝發(fā)彭修娟楊新杰
        陜西農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019年9期
        關(guān)鍵詞:實驗

        黑育榮, 陳勝發(fā), 彭修娟,楊新杰

        (1.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院, 陜西 楊凌 712100;2.陜西國際商貿(mào)學(xué)院,陜西 咸陽 712046; 3.陜西中醫(yī)藥大學(xué),陜西 咸陽 712046)

        樺菌芝 [Pyropolyporusfomentarius(L. ex Fr.)]又名木蹄、多寄生于樺樹及櫟樹的樹干上,樺菌芝的藥用活性之一是抗癌,民間治療子宮癌、食道癌、胃癌多有應(yīng)用[1,2,3]。目前對樺菌芝的研究,主要集中在樺菌芝多糖的抗癌作用機制[4],樺菌芝的另一抗癌活性成分為三萜類成分[5],對樺菌芝的三萜類成分的研究較少。筆者實驗通過響應(yīng)曲面分析法優(yōu)化樺,菌芝三萜類成分的超聲提取工藝,給樺菌芝三萜的研究和開發(fā)提供依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        C2H5OH、濃H2SO4、HClO4、冰CH3COOH、醋酸酐、香草醛等(均為分析純)。樺菌芝(野生);齊墩果酸對照品(110709-201607,中國藥品生物制品檢定所);

        1.2 儀器

        YP20002型電子天平,KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器,DHG-9023A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱,HH-2型電熱恒溫水浴鍋,SHZ-D(ш)型循環(huán)水用真空泵,UPT-I-10T型超純水機,UV-1901型紫外可見分光光度計。

        1.3 試驗方法

        1.3.1 超聲提取樺菌芝三萜 準(zhǔn)確稱取樺菌芝粉末,置錐形瓶內(nèi),以設(shè)定濃度的乙醇溶液和料液比,設(shè)定超聲溫度、時間,進行提取,過濾得提取液,測定濾液中樺菌芝三萜的含量,并計算三萜的得率。

        1.3.2 對照品溶液的配制 稱取適量齊墩果酸對照品,加入一定體積的甲醇,配制成0.1953 mg·mL-1的對照品溶液。

        1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以齊墩果酸為標(biāo)準(zhǔn)品,采用香草醛-冰醋酸-高氯酸顯色,以可見分光光度法測定總?cè)坪縖6],分別吸取0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL的對照品溶液,分揮干,加入0.2mL 5%香草醛冰乙酸和0.8mL高氯酸,60℃水浴中反應(yīng)15 min,冰水浴冷卻, 加冰乙酸定容到5 mL,同法作為空白,測定550 nm處的吸光度值。以齊墩果酸(mg)x為橫坐標(biāo),吸光度值(A)y為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

        1.3.4 樺菌芝三萜含量測定 準(zhǔn)確量取樣品液1 mL,置25 mL具塞試管中,揮干溶劑按香草醛-冰醋酸-高氯酸顯色法顯色,平行測定3次。

        1.3.5 單因素實驗 分別考察50%,60%,70%,80%,90%的乙醇濃度,在40℃、50℃、60℃、70 ℃、80℃的條件下超聲,分別設(shè)定10 min、15 min、20 min、25 min、30 min的超聲時間,以1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30的料液比,對樺菌芝提取液中三帖類物質(zhì)含量的影響。

        1.3.6 響應(yīng)面優(yōu)化 分別以乙醇濃度、溫度,時間和料液比為因素,以三萜得率為響應(yīng)值,以Box-Benhnken的原理,進行響應(yīng)面分析。

        1.3.7 分析數(shù)據(jù) 用Design-Expert.8.0.6.1軟件分析數(shù)據(jù)

        2 結(jié)果與分析

        2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

        如圖1,回歸方程為:Y =8.8208X + 0.1157,R2=0.9998。

        圖1 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

        2.2 單因素實驗結(jié)果

        2.2.1 乙醇濃度對三萜得率的影響 由圖2中可以看出,乙醇濃度為50%~70%之間,三萜得率隨著濃度增加逐漸增大,當(dāng)濃度增大到70%時三萜得率最大。因此,最佳醇乙濃度為70%。

        圖2 乙醇濃度對三萜得率的影響

        2.2.2 提取溫度對三萜得率的影響 從圖3可知,隨著溫度的升高三萜得率逐漸增大。溫度達到70℃時,三萜得率增加至最大。由70℃到80℃,三萜得率呈下逐漸下降。過高溫度可能會對三萜的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞從而影響提取率。經(jīng)分析得出:提取溫度應(yīng)選擇70℃。

        2.2.3 提取時間對三萜得率的影響 從圖4可以看出,在10~15 min,三萜得率緩慢增加,時間為15 min時增加至最高值,而在15~30 min之間,三萜得率呈現(xiàn)逐漸減少的趨勢,可以得出,提取時間控制在15 min左右較為適宜。

        圖3 提取溫度對三萜得率的影響

        圖4 提取時間對三萜得率的影響

        2.2.4 料液比對三萜得率的影響 從圖5可以看出,料液比為1∶15時三萜得率最大,故本次實驗的料液比控制在1∶15。

        圖5 料液比對三萜得率的影響

        2.3 響應(yīng)面法實驗結(jié)果

        2.3.1 響應(yīng)面法實驗設(shè)計 按照單因素實驗結(jié)果,根據(jù)Box-Benhnken中心組合實驗設(shè)計的原理,進行4因素3水平實驗,見表1。

        表1 實驗因素及水平

        2.3.2 回歸模型方程建立與方差分析 以樺菌芝提取液中三帖得率為指標(biāo),依據(jù)Box-Behnken響應(yīng)曲面法超聲提取樺菌芝三萜的工藝優(yōu)化,得到設(shè)計的29組實驗結(jié)果,見表2。

        表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計及數(shù)據(jù)處理

        應(yīng)用軟件Design-Expert.8.0.6.1進行分析,得到回歸模型方程:

        R1=-29.02533+0.47512A+0.31737B+0.32043C+0.37260D-3.25×10-4AB+1.00×10-5AC-1.5×10-3AD-5.50×10-4BC+4.2×10-3CD+6×10-3CD-3.0675×10-3A2-2.505×10-3B2-0.01247×C2-0.021720D2

        回歸分析結(jié)果見表3。

        表3 回歸模型的方差分析

        通過表2數(shù)據(jù)分析可知,此模型的F值是2.99,方程的“Prob> F”數(shù)值小于0.05,表明相應(yīng)因素對響應(yīng)值影響顯著。從回歸方程的方差與分析結(jié)果看出,該方程的失擬項特別小,說明方程對實驗的擬合情況良好。通過以上實驗數(shù)據(jù)及結(jié)果分析均可表明該模型用于優(yōu)化三萜類物質(zhì)的提取工藝是非??煽康?。

        2.3.3 響應(yīng)面法分析 應(yīng)用Design-Expert.8.0.6.1軟件繪制乙醇濃度、超聲提取溫度、超聲提取時間、料液比等因素交互作用對樺菌芝提取液三萜類物質(zhì)含量影響的響應(yīng)曲面圖和等值線圖,結(jié)果詳見圖6,續(xù)圖6。

        圖6 提取液中三萜類物質(zhì)含量各因素交互作用影響的響應(yīng)面與等值線

        續(xù)圖6 提取液中三萜類物質(zhì)含量各因素交互作用影響的響應(yīng)面與等值線

        根據(jù)Design-Expert 8.0.6.1 Trial軟件對模型方程計算得到:乙醇濃度70.33%、提取溫度在69.67℃,提取時間15.20 min料液比為1∶14.98理論值為3.97%。

        2.3.4 驗證 應(yīng)用到實際生產(chǎn)中工藝設(shè)定為:乙醇濃度70%、超聲提取溫度70℃、超聲提取時間15 min料液比為1∶15。在此條件下,平行實驗三次,實際測得樺菌芝三萜得率為3.87%,相比模型的提取率降低了約0.09%左右。由此證明,筆者實驗所得最優(yōu)提取工藝實用可行。

        3 結(jié)論

        以乙醇濃度、超聲溫度、超聲時間、料液比四個因素進行單因素水平實驗,然后通過Box-Behnken原理設(shè)計,建立出模型,對實驗結(jié)果進行分析,得到超聲提取樺菌芝三帖最優(yōu)工藝條件:乙醇濃度70%,超聲溫度70℃,超聲時間15 min,料液比1∶15。在最佳工藝條件下重復(fù)平行實驗,實驗結(jié)果樺菌芝三萜平均取率為3.87%。筆者試驗的理論數(shù)據(jù)可以為實際的樺菌芝三萜提取工藝優(yōu)化和工業(yè)生產(chǎn)所參考。

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