李 靜，楚 渠，王瑞嫻，彭云武，梁嘉俊，凌 君，孟 剛

(1.安康學(xué)院 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物科技學(xué)院 , 陜西 安康 725000; 2.安康學(xué)院 陜西省蠶桑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 安康 725000)

安康位于秦巴山區(qū)腹地，野生資源豐富，是陜西主要的蠶桑生產(chǎn)區(qū)域，具有豐富的蠶桑種質(zhì)資源。野桑蠶與家蠶同屬于鱗翅目昆蟲，是家蠶的祖先種，是培育家蠶優(yōu)良種的重要基因資源和科學(xué)研究的寶貴材料[1, 2]。筆者單位長期以來從事野桑蠶種質(zhì)的發(fā)現(xiàn)、保存和育種工作，野桑蠶的遺傳特性、親緣關(guān)系分析有利于該種質(zhì)資源開發(fā)與利用的開展。昆蟲線粒體DNA(mtDNA)是昆蟲遺傳多樣性和系統(tǒng)進(jìn)化研究的重要分子標(biāo)記，進(jìn)化速率是核基因組的5～10倍，無重復(fù)序列且在遺傳過程中不發(fā)生基因重組、倒位、易位等變異，具有嚴(yán)格的母性遺傳特性[3, 4]。細(xì)胞色素氧化酶I亞基(cytochrome oxidase subunit I, COI)是線粒體DNA中重要的蛋白編碼基因，具有進(jìn)化速率適中、保守性強(qiáng)、堿基變異豐富等特點(diǎn)[5]，可作為種屬系統(tǒng)進(jìn)化研究的良好標(biāo)記，被廣泛引用于種質(zhì)鑒定[6]、種群遺傳結(jié)構(gòu)分析和分子系統(tǒng)發(fā)育分析。

利用線粒體序列研究野桑蠶聚類關(guān)系，一方面可以在分子水平上了解桑蠶的進(jìn)化關(guān)系，另一方面有助于發(fā)掘秦巴山區(qū)豐富的野桑蠶種質(zhì)資源，在蠶品種鑒定、種質(zhì)改良和遺傳育種上具有指導(dǎo)意義。筆者研究對1份安康野桑蠶線粒體COI基因及其兩端側(cè)翼序列進(jìn)行了測序比較了其與石泉縣野桑蠶的堿基差異；在此前研究基礎(chǔ)上獲得包括5份安康野桑蠶在內(nèi)的17份中國野桑蠶、2份日本野桑蠶及31份家蠶線粒體相應(yīng)序列[2, 7, 8]，分析了單位點(diǎn)多態(tài)性和安康野桑蠶的聚類關(guān)系，從分子水平上探討安康野桑蠶與不同地理來源野桑蠶及與家蠶的親緣關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 樣本

野桑蠶樣本采自陜西省安康市，命名為akc20R2。另外，根據(jù)本單位此前的研究和 GenBank(https://www. ncbi.nlm.nih.gov/nuccore)數(shù)據(jù)庫，獲得來源于安康漢陰縣、嵐皋縣、漢濱區(qū)及石泉縣(AY301620.2和GU966591.1)等地5份野桑蠶線粒體序列。從GneBank中獲得11份國內(nèi)野桑蠶、2份日本野桑蠶和31份家蠶(Bombyx mori)，以及天蠶(Antheraea yamamai)、柞蠶(Antheraea pernyi)和黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)等相應(yīng)的線粒體序列。

1.2 線粒體基因組提取和序列擴(kuò)增

采用酚-氯仿法抽提蟲體全基因組，該方法獲得的為細(xì)胞核基因組和線粒體基因組的混合物。野桑蠶蛹體用雙蒸水反復(fù)清洗3次后，晾干，置研缽中，液氮冷卻后迅速研磨至粉末，加入DNA抽提緩沖液(EDTA 0.1 mol·L-1，Tris-HCl 0.1mol·L-1，SDS 5 g·L-1)3 mL，消融后轉(zhuǎn)入5 mL潔凈離心管中，加入蛋白酶k(30 unit·mg-1，Sigma)至終濃度為150 μg·mL-1，置50℃水浴箱中消化3～5 h(每30 min混勻1次)。消化后的懸液按酚-氯仿法抽提DNA，紫外分光光度計(jì)檢測質(zhì)量。取1μL樣品經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，基因組條帶應(yīng)位于TransPlus2000 DNA Marker指示劑5 000 bp條帶之上，且電泳條帶清晰明亮。基因組樣本置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物

根據(jù)已登錄的野桑蠶線粒體序列(GU966629.1)，針對目的片段設(shè)計(jì)簡并引物。上游引物為5’-TGGTGCAGGAACAGGATGAAC-3’，下游引物為5’-GAGACCADTACTTGCTTTCAG-3’，預(yù)計(jì)產(chǎn)物長度為1 962 bp。引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR擴(kuò)增體系為50 μL，含總DNA模板(20 ng·μL-1) 1.0 μL，ddH2O 35.0 μL，10×緩沖液5.0μL，MgCl2(25mmol·L-1) 5μL，dNTPs(2.5 mmol·L-1) 2.0 μL，上下游引物(2 μmol·L-1)0.5 μL，高保真聚合酶(5 u·μL-1)1 μL；反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4 min，94℃變性 40 sec，52℃退火40 sec，72℃延伸1 min，共32個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min，結(jié)束反應(yīng)。

1.4 產(chǎn)物回收和測序

PCR產(chǎn)物采用1.20%(w/v)的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，切取目的條帶，利用OMIGA膠回收試劑盒(OMIGA Gel Extraction Kit，美國)回收和純化核酸片段，操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。回收獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)檢測合格之后，各選3份送交上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測序。

1.5 序列分析

使用Bioedit軟件包逐條校對測序峰圖，去除兩端載體序列及機(jī)讀錯(cuò)誤之后導(dǎo)出序列。利用Clustalx軟件進(jìn)行核酸序列的同源性比對和相似性分析；DnaSP6.0(Rozas et al., 2017)檢測單倍型和多態(tài)性位點(diǎn), 計(jì)算核苷酸多樣性(Pi)和單倍型(haplotype)多樣度(Hd)。MEGA7.0(Tamura et al.,2007)構(gòu)建進(jìn)化樹，構(gòu)建方法為鄰接法(neighbour-joining method, NJ)，(neighbor-joining)，參數(shù)設(shè)置為Bootstrap=1000，Poisson model，gaps/missing處理方式為pairwise deletion。

2 結(jié)果

2.1 序列擴(kuò)增和凝膠電泳

凝膠電泳檢測基因組抽提效果，在DNA marker對應(yīng)的5 000 bp以上位置有單一條帶，表明基因組質(zhì)量可滿足后續(xù)研究。利用線粒體特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果在預(yù)計(jì)的目的位置(1 962 bp)出現(xiàn)明亮、單一的條帶(圖1)，表明成功抽提出野桑蠶線粒體序列，且設(shè)計(jì)合成的特異性引物可擴(kuò)增出目的序列片段?；厥諗U(kuò)增產(chǎn)物，轉(zhuǎn)入克隆質(zhì)粒并擴(kuò)大培養(yǎng)，收集質(zhì)粒送交測序，獲得擴(kuò)增片段的核酸序列。

圖1 基因組抽提和線粒體目的序列擴(kuò)增檢測

2.2 序列比對和核酸多態(tài)性分析

去除序列兩端載體序列及機(jī)讀錯(cuò)誤之后，獲得長度為1 873 bp的序列，將其進(jìn)行blast比對，結(jié)果表明該序列與數(shù)據(jù)庫中野桑蠶線粒體序列的一致性(identity)最高，且其中包含一段線粒體COI編碼序列。將克隆所得序列與GenBank中的石泉縣野桑蠶序列(AY301620.2和GU966591.1)進(jìn)行比對，結(jié)果表明，其與石泉野桑蠶序列在163、203、213等48個(gè)核苷酸位點(diǎn)上表現(xiàn)差異。

從GenBank和文獻(xiàn)報(bào)道中獲得16份中國、日本野桑蠶相應(yīng)的線粒體序列。位點(diǎn)多態(tài)性分析表明，17份中國野桑蠶在67個(gè)位點(diǎn)上存在堿基差異，平均核苷酸差異為25.596，核苷酸多樣度為0.01368；2份日本野桑蠶在10個(gè)位點(diǎn)上存在差異，平均核苷酸差異為10.000，核苷酸多樣度為0.00534(表1，表2)。與國內(nèi)四川、江蘇等地的野桑蠶相比，山東青州、陜西安康的野桑蠶有更為豐富的多態(tài)性單位點(diǎn)，同時(shí)安康野桑蠶在群體內(nèi)表現(xiàn)出較高的相似性(表2)。

2.3 遺傳進(jìn)化分析

針對野桑蠶及家、野桑蠶兩者之間的進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行了聚類分析，其中包括本次克隆所得序列在內(nèi)的6份安康野桑蠶線粒體相應(yīng)序列(圖3)。結(jié)果表明，家蠶與野桑蠶總體上分別聚為兩大類群。與家蠶相比，野桑蠶具有顯著的遺傳多樣性，表現(xiàn)為野桑蠶進(jìn)化樹枝長度存在顯著差異，而家蠶不同品種之間的進(jìn)化樹枝長度較短。野桑蠶按照中國、日本各自聚為2大枝。6份安康野桑蠶總體上形成兩個(gè)聚類，一是漢陰縣、嵐皋縣、漢濱區(qū)及akc20R2與山東青州在同一枝下聚類，其中本次樣本與嵐皋縣、山東青州親緣關(guān)系較近，漢濱區(qū)和漢陰縣樣本與家蠶親緣關(guān)系最為接近，在進(jìn)化樹上分別聚類為兩個(gè)小的亞群；二是來源于安康石泉縣的兩份野桑蠶與四川、江蘇、湖北等地的野桑蠶表現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系，聚集為一大類群(圖3)。

圖2 克隆序列與石泉2份野桑蠶線粒體相應(yīng)序列的聯(lián)配比對

種類序列數(shù)目計(jì)算長度單倍型數(shù)多態(tài)位點(diǎn)數(shù)平均核苷酸差異單倍型多樣度核苷酸多樣度中國野桑蠶171873176725.5961.0000.01368日本野桑蠶2187321010.0001.0000.00534

表2野桑蠶COI序列中具有單體型特征的位點(diǎn)

圖3 野桑蠶線粒體COI序列的聚類分析

Ws指野桑蠶(wild silkworm)。akHanyin指安康市漢陰縣；akNangao指安康市嵐皋縣；akHanbin指安康市漢濱區(qū)。實(shí)心圓指本研究中克隆所得序列，實(shí)心三角指文獻(xiàn)報(bào)道或GenBank中的野桑蠶序列。

3 討論

關(guān)于家蠶的起源，長期以來有多起源假說和單起源假說的爭論[7]?；诰€粒體的研究，魯成等推理出家蠶是從不同的地域和時(shí)期進(jìn)化獨(dú)立進(jìn)化而來[3, 9～14]。筆者研究克隆了一份安康野桑蠶長度為1 873 bp的線粒體片段序列，序列比對表明其與石泉縣2份野桑蠶序列存在48處位點(diǎn)差異；聚類分析表明該野桑蠶與與嵐皋縣、山東青州親緣關(guān)系較近，且與家蠶聚為大的類群，顯示其與家蠶親緣關(guān)系較近；綜合與18份不同地域來源的野桑蠶、31份家蠶線粒體相應(yīng)序列的聚類分析，表明6份安康野桑蠶可分為兩大類，其一是石泉縣2份野桑蠶與湖南、四川、江蘇、湖北等地野桑蠶聚為一大類群，與家蠶親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，其二是包括本次研究在內(nèi)的4份安康野桑蠶及山東青州野桑蠶與家蠶聚為一大類群，與家蠶親緣關(guān)系較近，顯示出秦巴地區(qū)野桑蠶復(fù)雜多樣的遺傳特性。