鄒麗華，劉晉萍，張 浩，童媛媛，唐 躍

1 材料與方法

1.1 實驗耗材及試劑 膜式氧合器（Terumo baby Fx05，日本 Terumo 公司），雙頭滾壓泵（德國 St?ckert公司），氣管導(dǎo)管（美國Covidien公司），HTK液（批號：1208621，德國kohler化學(xué)制藥公司），20 G中心靜脈導(dǎo)管（中國深圳益必達公司）。Alda-1（25 mg，美國Sigma公司），為ALDH2特異性激動劑，經(jīng)心肌灌注旁路給藥，劑量為 8 mg／kg［4］。

1.2 實驗動物及分組 新西蘭白兔15～20周齡，體重2～3.5 kg，經(jīng)動物倫理委員會批準（2013-4-150-GZR），由阜外醫(yī)院動物實驗中心提供。21只新西蘭白兔隨機分CPB不停跳組（C組，n＝7）、停跳組（CA 組，n＝7）、Alda-1組（CAA 組，n＝7）。 另21只新西蘭白兔作為供血兔，用作CPB管路預(yù)充，盡管新西蘭兔存在血型，但抗原性較弱，因此同一品種的兔血不會發(fā)生溶血反應(yīng)［5］。所有動物術(shù)前禁食6 h，禁飲 2 h。

1.3 建立新西蘭兔CPB模型 新西蘭兔入室稱重，耳緣靜脈置管開放靜脈通路，2.5%戊巴比妥鈉3～4 ml進行麻醉誘導(dǎo)后，經(jīng)口氣管插管（3.5#）行機械通氣，設(shè)定氧濃度35%，通氣量1 L／min，潮氣量約 35～40 ml、呼吸頻率 30～35 次／min、吸呼比1∶1.5。切開右腹股溝，右股動脈22 G套管針穿刺置管持續(xù)監(jiān)測動脈血壓，監(jiān)測心電圖（electrocardiography，ECG）、心率。16 G套管針置入右腋動脈，用于CPB動脈灌注。中心靜脈導(dǎo)管（20 G）置入左腋動脈，尖端位于主動脈根部作為停搏液灌注管路。正中開胸暴露右心房，切開右心房，插入帶側(cè)孔的靜脈插管（16 Fr）作為靜脈引流，調(diào)整靜脈插管位置，確保引流通暢后7-0尼龍線固定。若操作中發(fā)現(xiàn)實驗兔存在左腋動脈解剖變異或置管失敗導(dǎo)致出血，則立即止血后正中開胸，經(jīng)主動脈根部置入22 G套管針并荷包縫合。

CPB管路預(yù)充液由50 ml新西蘭白兔新鮮全血、5 ml復(fù)方電解質(zhì)注射液（勃脈力）、10 ml琥珀酰明膠、5 ml碳酸氫鈉注射液組成，實驗兔全身肝素化（400 IU／kg）且ACT＞480 s后開始CPB，維持流量100～ 120 ml／（kg·min），PaO2100 ～ 300 mm Hg，PaCO235～45 mm Hg。C組行常規(guī)CPB且心臟不停跳，CA組及CAA組進行CPB及心臟停跳處理，即肛溫降至30℃后阻斷升主動脈，灌注4℃ HTK液，劑量為 40 ml／kg，灌注起始壓力控制在 80～100 mm Hg，灌注維持壓力為40～60 mm Hg，灌注時間4～5 min，吸走右心房HTK液避免回收至儲血室引起血液稀釋，心臟停跳后表面覆蓋冰屑。CPB期間肛溫維持在28℃左右，緩慢復(fù)溫至30℃后開放主動脈，阻斷時間為120 min。開放主動脈后行全流量輔助循環(huán)，時間約60 min，復(fù)溫至直腸溫36℃以上調(diào)整CPB流量，生命體征平穩(wěn)后停機，實驗觀察至心臟恢復(fù)灌注120 min（CPB實驗流程見圖1）。

圖1 兔CPB實驗流程示意圖

1.4 監(jiān)測指標及取材 在CPB開始前（T1）、阻斷前（T2）、阻斷 120 min（T3）、開放后 5 min（T4）、停機后（T5）五個時點采集股動脈全血3 ml行血氣分析及心肌型肌酸激酶同功酶（MB isoenzyme of creatine kinase，CKMB）檢測。血樣在4℃下4000 rpm離心15 min，取上清液于-20℃冰箱保存。經(jīng)心尖置入左心室測壓管，連接生理多導(dǎo)儀（RM-6000型）監(jiān)測心功能，記錄三組動物實驗終點時左室壓力形成最大速率（+dP／dtmax）、最小速率（-dP／dtmin）、左室收縮末壓（left ventricular end systolic pressure，LVESP）、左室舒張末壓（left ventricular end diastolic pressure，LVEDP）。

實驗兔在測定心功能后，取左心室心肌組織于-80℃冰箱保存。采用比色法檢測ALDH2活性［2］，采用免疫印跡法（Western blot）檢測心肌組織4-HNE、MDA的表達，采用酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測ALDH2、氧化型與還原型谷胱甘肽（GSH／GSSG）、蛋白羰基（protein carbonyl，PC）、血清 CKMB 含量。

1.5 統(tǒng)計方法 計量資料以均數(shù)±標準差表示，計數(shù)資料以例數(shù)（百分比）表示。單因素方差分析用于三組間比較，兩兩比較采用LSD法。血清CKMB采用紅細胞比容進行校正，采用重復(fù)測量ANOVA進行分析。數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0進行統(tǒng)計分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料 所有實驗兔均完成CPB模型建立，三組間實驗兔的年齡、體重、CPB時間不存在統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；CA組和CAA組間降溫時間、復(fù)溫時間、最低肛溫、開放后室顫發(fā)生率無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。 見表 1。

表1 實驗動物的基礎(chǔ)資料（n＝7）

2.2 ALDH2含量及活性 ALDH2含量 C組為（45.93±2.86） μg／ml，CA 組為（44.89±5.38）μg／ml，CAA 組為（43.54±6.50）μg／ml，三組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異（F＝0.379，P＝0.690）。 ALDH2 活性 C組為（2.85±0.33）U／mg，三組間比較存在統(tǒng)計學(xué)差異（F＝16.706，P＜0.001），CA 組較 C 組明顯減低（P＜0.001），CAA 組較 CA 組明顯增加（P＜0.001）。見圖2。

消防用水儲存于生產(chǎn)新水水池內(nèi)，同時采取保證消防水不做他用的措施。廠區(qū)內(nèi)大多為丁、戊類單層廠房，根據(jù)規(guī)范要求設(shè)置室內(nèi)外消火栓給水系統(tǒng)，水池出水可滿足消防供水壓力。從消防水池設(shè)消防給水管網(wǎng)至廠區(qū)。

圖2 心肌ALDH2活性

2.3 醛類及心肌氧化應(yīng)激指標 CA組較C組心肌4-HNE及MDA含量明顯增加（P＜0.001）。Alda-1的應(yīng)用使心肌醛類明顯下降，CAA組與CA組相比存在統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.005），表明心肌 ALDH2活化加強4-HNE、MDA的清除（圖3A-B）。

氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione，GSSG）為谷胱甘肽（glutathione，GSH）氧化反應(yīng)生成產(chǎn)物，GSH／GSSG可反映心肌氧化應(yīng)激水平。GSH／GSSG CA組較C組明顯減少（P＝0.007）表明心肌缺血再灌注期間GSH消耗增加，CAA組較CA組明顯增加（P＝0.028），表明Alda-1激活A(yù)LDH2后氧化應(yīng)激得以改善（圖4）。

2.4 心肌損傷指標 三組間不同時點CKMB存在統(tǒng)計學(xué)差異［重復(fù)測量方差分析（ANOVA）：F＝25.402，P＜0.001］，時間與分組不存在交互效應(yīng)（F＝2.614，P＝ 0.057），三組間 CKMB 存在統(tǒng)計學(xué)差異（F＝5.271，P＝0.016），CKMB 水平 CA 組顯著高于C組（P＝0.006），Alda-1減輕 CKMB 釋放，CAA組CKMB水平顯著低于CA組（P＝0.028）（圖5）。

PC為心肌細胞氧化應(yīng)激損傷指標，本研究發(fā)現(xiàn)CA組與C組相比PC水平明顯升高（P＝0.007），CAA組 PC水平較 CA組明顯降低（P＝0.012）（圖 6）。

圖3 4-HNE及MDA表達

圖4 GSH／GSSG水平

圖5 不同時點血清CKMB水平

圖6 三組心肌蛋白PC比較

2.5 心功能指標 停機后dp／dtmaxCA組較C組降低（P＝0.032），Alda-1改善心肌收縮功能，CAA 組dp／dtmax較 CA 組明顯增加（P＝0.040），三組間 dp／dtmin無顯著統(tǒng)計學(xué)差異（圖7）。心率和平均動脈壓、LVEDP、LVESP在三組間無統(tǒng)計學(xué)差異（見表2）。

圖7 三組心功能變化比較

表2 血流動力學(xué)及心功能指標（n＝7，±s）

表2 血流動力學(xué)及心功能指標（n＝7，±s）

項目 C組 CA組 CAA組 P值平均動脈壓（mm Hg） 80±9 78±10 83±10 0.697心率（次／min） 220±10 200±16 207±25 0.149 LVEDP（mm Hg） 10.9±2.8 10.4±3.4 10.6±2.8 0.964 LVESP（mm Hg） 95.9±12.3 92.6±10.1 93.7±14.1 0.880 dp／dtmax（mm Hg／s） 1076±117 748±115 1059±425 0.045 dp／dtmin（mm Hg／s） -921±125 -581±88 -651±37 0.184

3 討 論

CPB心臟手術(shù)期間主動脈的阻斷與開放使得心肌難以避免缺血再灌注損傷，目前多種心肌保護液應(yīng)用于臨床，但世界各地心肌保護策略迥異，如何優(yōu)化CPB心肌保護策略仍是臨床關(guān)注的重要問題［6］。陳燕等在HTK液中添加依布硒啉，發(fā)現(xiàn)依布硒啉可明顯減輕心肌的氧化應(yīng)激，保護心肌線粒體結(jié)構(gòu)，防止早期凋亡事件發(fā)生［7］。氧化應(yīng)激過程中產(chǎn)生的ROS可直接或間接損傷脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、DNA等［8-9］，不飽和脂肪酸在ROS作用下發(fā)生過氧化反應(yīng)生成有毒醛類，4-HNE占脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的95%。醛類物質(zhì)可加合到蛋白質(zhì)、DNA等大分子物質(zhì)，進而引起后者結(jié)構(gòu)、功能變化，此外醛類物質(zhì)還可作為自由基的第二信使發(fā)揮毒性作用［1］。研究表明，有毒醛類與心肌抗氧化能力減弱、心功能損傷顯著相關(guān)［10-11］。

ALDH2為醛類氧化的關(guān)鍵酶，可將醛類氧化生成無活性乙酸排出體外，進而起到解毒作用。心肌ALDH2活性與低溫、毒性醛類以及個體差異有關(guān)。大鼠Langendorff離體心臟灌流模型中觀察到，缺血心肌的ALDH2活性在4℃低溫下持續(xù)下降，1 h后為缺血前60%～70%，2 h后下降至缺血前的20%～30%，心臟恢復(fù)常溫且血供恢復(fù)1 h后ALDH2活性才上升至缺血前水平［2］。其次，有毒醛類既作為ALDH2底物，又是ALDH2強有效的抑制劑，可使ALDH2活性完全缺失。此外，ALDH2具有基因多態(tài)性，全世界ALDH2突變基因攜帶率約8%，而亞洲人則高達40%，表現(xiàn)為ALDH2活性缺失或下降，飲酒后出現(xiàn)紅臉效應(yīng)［12］。研究發(fā)現(xiàn)攜帶ALDH2突變基因的紫紺型先天性心臟病患兒，心肌GSH含量代償性增加［13］。

Alda-1為ALDH2特異性激活劑，它暴露ALDH2酶解作用的關(guān)鍵部位，同時部分封堵ALDH2底物結(jié)合的通道，使其免受醛類對其活性的反向抑制而始終保持活性。Alda-1還可糾正突變型酶結(jié)合位點的結(jié)構(gòu)異常，恢復(fù)突變型ALDH2的活性。研究證實其可通過提高ALDH2活性減輕心肌缺血損傷［4］。

本研究發(fā)現(xiàn)心肌缺血再灌注后GSH／GSSG下降，可能與缺血再灌注期間氧化應(yīng)激水平增強，抗氧化物質(zhì)GSH耗竭有關(guān)。Alda-1通過激活A(yù)LDH2，加強醛類的清除，減輕心肌氧化應(yīng)激，改善抗氧化能力，GSH／GSSG明顯升高。氧化應(yīng)激過程中，ROS通過氧化修飾氨基酸殘基形成PC，從而損傷蛋白功能，這些氨基酸包括蘇氨酸、脯氨酸、賴氨酸和精氨酸，因而蛋白PC可作為氧化應(yīng)激損傷指標［12］。既往研究發(fā)現(xiàn)，4-HNE加合產(chǎn)物的形成伴隨蛋白PC化水平的增加，離體研究亦證實缺血期間心肌蛋白PC 水平迅速增加［2，14］。 本研究發(fā)現(xiàn)，ALDH2 活化后PC化水平明顯下降。

綜上所述，CPB期間心肌ALDH2活化可加強毒性醛類清除，增強心肌的抗氧化損傷能力，減輕心肌的氧化應(yīng)激水平，改善心肌收縮功能。