曹秀廷 王兆芬

(青海省第四人民醫(yī)院重癥醫(yī)學科，西寧市 810000，電子郵箱：1907028184@qq.com)

結核病是由結核分枝桿菌感染引起的慢性疾病，其死亡率居單一病原體感染的疾病之首。近年來，肺結核的發(fā)病率呈逐年升高趨勢，據世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計報告，我國肺結核的發(fā)病率居世界第3位，而且，隨著耐藥病菌的出現(xiàn)，該疾病已對人類生命安全造成重大威脅[1]。目前，人體抗結核感染相關的免疫機制尚未完全闡明，研究證實αβ T淋巴細胞及巨噬細胞在結核感染中發(fā)揮重要作用，γδ T淋巴細胞在結核桿菌感染的免疫調控中亦發(fā)揮重要作用[2]。Vδ2+T淋巴細胞作為γδ T淋巴細胞的主要亞群，不僅具有先天免疫細胞的特征，亦具有適應性免疫的特征，可通過分泌不同功能的細胞因子調節(jié)機體的免疫應答，但目前有關Vδ2+T淋巴細胞在結核病中相關調控機制的研究相對較少[3]。本研究探討肺結核患者外周血及支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中Vδ2+T淋巴細胞的比例及血清相關細胞因子的水平，以期為結核病的防治提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年2月至2017年2月在我院就診的肺結核患者82例作為研究對象。納入標準：(1)年齡21～65歲；(2)均為新發(fā)確診患者；(3)所有研究對象均知曉本研究目的，簽訂知情同意書。排除標準：(1)有自身免疫性疾病、心腦血管等嚴重疾病者；(2)有糖尿病、高血壓等并發(fā)癥者；(3)臨床資料不全者。其中活動性肺結核患者37例(活動性肺結核組)，潛伏性肺結核患者45例(潛伏性肺結核組)?；顒有苑谓Y核組男性25例，女性12例，年齡21～62(41.23±5.67)歲，體質指數(shù)18.25～24.18(22.05±2.13)kg/m2，吸煙或有吸煙史者20例；潛伏性肺結核組男性30例，女性15例，年齡24～65(42.12±6.35)歲，體質指數(shù)18.50～24.33(22.25±1.95)kg/m2，吸煙或有吸煙史者28例。另選取同期健康體檢者40名作為健康組，其中男性25例，女性15例，年齡22～63(40.95±5.52)歲，體質指數(shù)18.33～24.25(21.89±1.88)kg/m2，吸煙或有吸煙史者21例。3組研究對象體質指數(shù)、性別、年齡及吸煙情況差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，具有可比性。本研究獲得本院倫理委員會批準同意。

1.2 診斷標準 健康組患者無結核病臨床癥狀，相關影像學檢查均無結核病征象，結核菌素皮膚試驗(tuberculin skin test，TST)結果為陰性。潛伏性肺結核組患者診斷標準：(1)與肺結核人群有密切接觸；(2)TST檢測陽性；(3)患者無明顯臨床癥狀，影像學檢查呈陰性?；顒有苑谓Y核患者診斷標準：(1)有咳嗽、出血癥狀；(2)影像學檢查顯示肺部陰影；(3)TST檢測陽性。

1.3 實驗方法

1.3.1 標本采集：(1)血清標本采集：采集所有研究對象入院次日清晨或體檢當日清晨空腹外周靜脈血3 mL，置于枸櫞素鈉抗凝管中，一部分血標本以3 500 r/min離心后取上清，另一部分標本加入磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)以1 ∶1比例稀釋后轉入預先裝有3 mL淋巴細胞分離液的15 mL離心管中，600 r/min離心15 min，棄上清以10 mL PBS重懸后400 r/min離心8 min，采用RPMI 1640(美國Gibco公司，批號：20171204)重懸調整細胞密度為2.5×109個細胞/L。(2)BALF標本收集：采用2%利多卡因對肺結核患者咽部進行霧化麻醉，經咽部插入BF-F260型纖維支氣管鏡(日本奧林巴斯公司)，進入氣管支氣管后通過細的硅膠管注入2%利多卡因2 mL對肺部病灶進行局部麻醉，通過硅膠管分3次注入150 mL 37℃無菌生理鹽水，采用負壓法回吸灌洗液，記錄回吸的灌洗液總量，灌洗液回收率超過40%為標本收集成功。BALF經雙層紗布過濾并采用生理鹽水洗滌兩次后，以RPMI 1640重懸調整細胞密度為2.5×109個細胞/L備用。

1.3.2 Vδ2+T淋巴細胞百分率測定：取1.3.1獲取的外周血或BALF細胞懸液100 μL，用含1% 牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)的PBS洗滌兩次后，加入Vδ2+T的熒光抗體藻紅蛋白抗人T淋巴細胞抗原受體Vδ2+(T cell receptor Vδ2+，TCRVδ2+)(美國BD Bioscience公司，批號：2018020901)和CD3+T的CD3-APC熒光單克隆抗體(美國BD Bioscience公司，批號：2018012603)，于4℃條件下避光孵育30 min，再次以含1% BSA的PBS溶液洗滌兩次后加入100 μL 1%的多聚甲醛溶液重懸，于CytomicsTMFC500流式細胞儀(美國Beckman公司)，采用CXP儀器操控軟件采集前向和側向散射光信號，并采用配套軟件CXP 2.2對實驗數(shù)據進行處理分析，以Vδ2+T淋巴細胞占總淋巴細胞CD3+T淋巴細胞的百分數(shù)作為Vδ2+T淋巴細胞的相對水平。

1.3.3 血清相關細胞因子檢測：采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫法檢測血清γ干擾素(interferon,IFN-γ)、白細胞介素(interleukin,IL)4、IL-10水平，儀器為Multiskan FC型酶標儀(美國Thermo Scientific公司)，檢測試劑盒均購自美國R&D Systems公司(批號分別為CAA31639，P05112，P22301)。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較方差分析,兩組間比較采用LSD-t法；計數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 3組研究對象外周血Vδ2+T淋巴細胞占總淋巴細胞百分比比較 健康組、潛伏性肺結核組、活動性肺結核組患者外周血Vδ2+T淋巴細胞占總淋巴細胞百分比分別為(8.67±0.56)%、(7.05±0.45)%、(5.54±0.42)%，組間差異有統(tǒng)計學意義(F=408.385，P<0.001)；其中活動性肺結核組和潛伏性肺結核組患者外周血Vδ2+T淋巴細胞占總淋巴細胞百分比均低于健康組(均P<0.05)。見圖1。

圖1 3組研究對象外周血Vδ2+ T淋巴細胞流式圖(示例)

2.2 活動性肺結核組和潛伏性肺結核組患者BALF中Vδ2+T淋巴細胞占總淋巴細胞百分比比較 活動性肺結核組BALF中Vδ2+T淋巴細胞占總淋巴細胞百分比為(1.92±0.21)%，低于潛伏性肺結核組的(3.35±0.30)%(t=24.470，P<0.001)。見圖2。

圖2 兩組患者BALF中Vδ2+ T淋巴細胞流式圖(示例)

2.3 3組研究對象血清IFN-γ、IL-4、IL-10水平比較 潛伏性肺結核組和活動性肺結核組患者血清IFN-γ、IL-4、IL-10水平均高于健康組，活動性肺結核組患者血清IL-4、IL-10水平均高于潛伏性肺結核組(均P<0.05)。見表1。

表1 各組患者外周血IFN-γ、IL-4、IL-10水平比較(x±s，ng/L)

注：與健康組比較，aP<0.05；與潛伏性肺結核比較，bP<0.05。

3 討 論

γδ T淋巴細胞是于1986年發(fā)現(xiàn)的一類特殊T淋巴細胞，約占T淋巴細胞的1%～5%，其表面主要表達由γ和δ鏈組成的多樣性T淋巴細胞受體，具有與αβ T淋巴細胞相似的免疫功能，但又有其獨特特點，主要表現(xiàn)為無主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex，MHC)限制識別抗原，無須細胞提呈，兼有天然免疫和適應性免疫，具有殺傷和調節(jié)的雙重功能[4]。γδ T淋巴細胞主要分為Vδ1+T淋巴細胞和Vδ2+T淋巴細胞兩個亞群，其中Vδ2+T淋巴細胞是外周血的主要γδ T淋巴細胞亞群，在正常生理狀態(tài)下占γδ T淋巴細胞的50%～90%。Vδ2+T淋巴細胞能夠產生輔助性T淋巴細胞(helper T cell，Th)1、Th2、細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic lymphocyte，CTL)等多種類型的細胞因子，在腫瘤免疫和感染免疫中均發(fā)揮不同的免疫作用，同時能夠向αβ T淋巴細胞提呈抗原并與刺激信號協(xié)同促進αβ T淋巴細胞的增殖分化[5]。

目前，γδ T淋巴細胞的生物學活性及在機體不同疾病中所發(fā)揮的作用尚未完全清楚。李元元等[6]研究表明，慢性乙型肝炎病毒感染患者外周血及肝臟內Vδ2+T淋巴細胞亞群的百分比較健康人下降，與肝臟炎癥分級、纖維化程度及HBV DNA載量呈負相關，但Vδ1+T淋巴細胞并無明顯變化，說明炎癥環(huán)境對Vδ2+T淋巴細胞具有一定影響，Vδ2+T淋巴細胞數(shù)量下降與慢性乙型肝炎病情的發(fā)展有一定的關系。Rei等[7]指出，γδ T淋巴細胞能夠招募免疫抑制性骨髓T淋巴細胞，抑制抗腫瘤反應，增強血管新生，參與腫瘤進程。馬俊等[8]研究表明，肝癌患者外周血中Vδ2+T淋巴細胞所占比例低于健康人，導致其對腫瘤細胞的殺傷作用和免疫清除作用降低可能是導致肝癌發(fā)病的原因之一。本研究結果顯示，活動性肺結核患者和潛伏性肺結核患者外周血Vδ2+T淋巴細胞占總淋巴細胞的百分比低于健康對照組，且活動性肺結核患者外周血和BALF中Vδ2+T淋巴細胞占總淋巴細胞的百分比低于潛伏性肺結核患者(均P<0.05)，提示Vδ2+T淋巴細胞在結核感染進程可能發(fā)揮重要作用，其水平下降可能使機體免疫反應降低，導致機體無法清除病原體。

以往研究表明肺結核患者Th1/Th2比例失衡所致細胞因子發(fā)生變化可能是影響結核病進展的機制之一[9]。IFN-γ是調控免疫細胞活化、對結核感染起抵抗作用的Th1型細胞因子；IL-10和IL-4屬于多功能的Th2型細胞因子，在結核分枝桿菌的免疫逃逸和潛伏感染中發(fā)揮重要作用[10]。Chen等[11]研究表明，在靈長類動物中Vδ2+T淋巴細胞能夠識別結核桿菌，在感染早期細胞的增殖分化能夠產抗結核桿菌的細胞因子IFN-γ，減緩肺組織病變進程，同時能夠產生IL-12，增強CD4/CD8 Th1型細胞的免疫反應，增強機體對結核病的抵抗能力。本研究結果顯示，活動期和潛伏期肺結核患者血清IFN-γ、IL-10、IL-4水平均高于健康人，且活動性肺結核患者IL-10、IL-4水平均高于潛伏性肺結核患者(均P<0.05)，與張錫林等[12]研究結果相似。結合本研究結果的潛伏期肺結核患者外周血及BALF中Vδ2+T淋巴細胞的百分比相對高于活動期患者，血清IL-10和IL-4水平低于活動期患者，筆者認為Vδ2+T淋巴細胞在感染初期可以啟動機體免疫反應，調控相關細胞因子分泌，進而發(fā)揮抗結核桿菌感染的作用；而隨著病原菌的不斷刺激，Vδ2+T淋巴細胞過度活化，F(xiàn)asL誘導凋亡，其調控相關細胞因子分泌的作用減弱，導致IL-10和IL-4過度分泌，機體免疫平衡失調，肺結核病情加重。

綜上所述，肺結核患者外周血Vδ2+T淋巴細胞所占比例降低，IFN-γ、IL-10、IL-4水平升高；IL-10和IL-4可能參與肺結核的發(fā)生發(fā)展過程，其分泌可能受到Vδ2+T淋巴細胞的調節(jié)。