張克賢，孫勇民，黃艷玲，張軼斌

（天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學院，天津300300）

市場在售含果汁產(chǎn)品是果汁與其它原料和水的調(diào)和物。果汁一般用成熟的水果為原料經(jīng)過物理方法如壓榨、離心等得到的汁液狀產(chǎn)品，稱其為純果汁或100%果汁[1]。如橙汁飲料是由純橙汁加入了糖、甜味劑、酸味料、香料、水等成分。純橙汁加入的量值決定了該產(chǎn)品的質(zhì)量[2-5]，因此需要建立方便準確的檢測方法，對果汁類產(chǎn)品進行產(chǎn)品質(zhì)量控制[6-8]。

GB/T 16771-1997《橙、柑、橘汁及其飲料中果汁含量的測定》國家標準，采用的果汁含量的測定方法較復雜并且花費時間較長，它通過測定純果汁或者含果汁飲料中可溶性固形物、鉀、總磷、氨基酸態(tài)氮、L-脯氨酸、總D-檸檬酸、總黃酮共7 種組分的實測值計算果汁含量[9-12]。

近年來，國內(nèi)外資料發(fā)表了對柑橘等果實和果汁中類黃酮的成分進行了較詳細的分析研究[13-15]。特別是光電二極管陣列檢測器高效液相色譜儀和高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用儀等儀器測定柑橘果實中類黃酮的成分同時能夠?qū)崿F(xiàn)定性和定量[16-19]，例如高效液相色譜法同時測定柑橘果實中柚皮素-7-β 蕓香糖苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、香風草苷、柚皮素、橙皮素、甜橙黃酮、川皮苷和桔黃酮10 種類黃酮并且分別對各個組分定性和定量。類黃酮成分是柑橘果實及其壓榨液中固有的成分，其具有量值穩(wěn)定性[20-22]。在調(diào)和果汁產(chǎn)品時其與純果汁加入量相關(guān)，其他成分如糖、甜味劑、酸味料、香料、水等成分可以調(diào)和不具有量值穩(wěn)定性。由于類黃酮成分可以進行分離、定性和定量，因此通過光電二極管陣列檢測器高效液相色譜儀測定果汁飲料中橙汁含量成為可能。

本試驗用光電二極管陣列檢測器高效液相色譜儀測定純橙汁中類黃酮成分之一新橙皮苷，外標法定量。配制不同含量純橙汁的果汁飲料，測定新橙皮苷含量，建立橙汁含量計算公式。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料

純橙汁：天津山海關(guān)飲料有限公司提供。

新橙皮苷（純度98%）：北京百靈威科技有限公司；乙腈、冰乙酸、甲醇（均為色譜純）：天津星馬克科技發(fā)展有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20AD 型島津高效液相色譜儀（帶有Essentia SIL-16 型二極管陣列檢測器，SPD-M20A 型自動進樣器，二元泵，島津Shim-Pak GIST C18（250 mm×4.6 mm，5 um）反相色譜柱和LabSolutions Essentia 工作站）：日本島津株式會社；QP-01 型流動相過濾裝置：天津津騰科技有限公司；0.45 μm 水型和溶劑型濾膜：北京海成世潔過濾器材有限公司；KQ-100VDV 型雙頻數(shù)控超聲波清洗器：江蘇省昆山市超生儀器有限公司；[0.45μm（水系）和0.45 μm（有機系）]針筒式濾膜過濾器：天津市精拓儀器科技有限公司；注射器：鄭州康佳醫(yī)療器械有限公司；5804r 型高速離心機：德國艾本德公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準溶液的配制

用精度0.1 mg 的電子天平稱取新橙皮苷0.025 5 g于50.00 mL 容量瓶中加入甲醇溶解并定容。該定容物為500 mg/L 的新橙皮苷儲備液，根據(jù)標準曲線需要逐級稀釋成 5、10、15、20 mg/L 不同濃度的使用液。

1.3.2 標準曲線的繪制

將新橙皮苷儲備液進行不同濃度梯度稀釋成使用液并進行過濾，在相同條件下進行色譜分析，以新橙皮苷標準品濃度為橫坐標，以濃度對應峰面積為縱坐標作標準曲線，得到回歸方程。未知樣經(jīng)過色譜分析，通過峰面積利用標準曲線求出濃度。

1.3.3 樣品制備

將純橙汁用超純水配成10%～80%樣品分別移取25 mL 于50 mL 容量瓶中用乙腈定容成50 mL，同樣配制原液。經(jīng)超聲脫氣后移取5 mL～7 mL 于10 mL 離心試管中，離心5 min，取上層清液經(jīng)0.45 μm 針筒式濾膜過濾器過濾后，備用。

1.3.4 儀器條件確定

優(yōu)化后的色譜條件為：以島津Shim-Pak GIST C18（250 mm×4.6 mm，5 μm） 反相色譜柱為分析柱，0.2%乙酸水溶液和乙腈作為流動相，流速為1.0 mL/min，進樣30 μL，梯度洗脫，梯度洗脫程序見表1，柱溫40 ℃，DAD 檢測器在190 nm～800 nm 檢測新橙皮苷化合物，色譜圖見圖1。

表1 流動相梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure for mobile phase

圖1 標樣新橙皮苷HPLC 色譜圖Fig.1 Chromatogram of standard new hesperidin HPLC

1.3.5 標樣新橙皮苷的光譜圖

將制備的標樣儲備液按照儀器條件進行掃描和檢測，利用二極管檢測器在190 nm～800 nm 范圍的檢測功能，得到紫外-可見光光譜圖，顯示各個波長吸收峰。

1.4 橙汁含量計算

原果汁純品進樣30 μL，得到原果汁純品的新橙皮苷HPLC 峰面積，記為S純，根據(jù)標準曲線計算出原果汁中的新橙皮苷含量C純。利用同一批次原果汁純品配置的濃度為 10%、20%、30%、40%、50 %、60 %的橙汁樣品，依次進樣30 μL，分別得到各個配制不同濃度樣品的 HPLC 峰面積 S10、S20、S30、S40、S50、S60，同樣計算新橙皮苷濃度 C10、C20、C30、C40、C50、C60。以稀釋樣新橙皮苷濃度除以純樣新橙皮苷濃度得到配制橙汁含量公式。

圖2 標樣新橙皮苷的光譜圖Fig.2 Spectrogram of standard new hesperidin

式中：Xi 表示橙汁含量，%；Pi表示稀釋樣新橙皮苷含量，mg/L；P純表示純樣新橙皮苷含量，mg/L；Si表示稀釋樣新橙皮苷HPLC 峰面積；S純表示純樣新橙皮苷HPLC 峰面積。

當測定中使用同一新橙皮苷標準曲線時可以簡化算式用新橙皮苷HPLC 峰面積直接計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 新橙皮苷紫外最大吸收波長

標樣新橙皮苷的光譜圖見圖2，標樣新橙皮苷190 nm～400 nm 紫外吸收波長圖見圖3，標樣新橙皮苷260、272、280 nm 和 290 nm 的 HPLC 色譜圖見圖4。

圖3 標樣新橙皮苷190 nm～400 nm 紫外吸收波長圖Fig.3 UV absorption wavelength of standard hesperidin 190 nm-400 nm

圖4 標樣新橙皮苷HPLC 色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of standard new hesperidin

測定新橙皮苷紫外最大吸收波長的方法是使用二級管陣列檢測器同時檢測成分的色譜和紫外光譜。測定標樣新橙皮苷，光譜顯示出紫外最大吸收波長280 nm；截取190 nm～400 nm 波長的紫外吸收光譜圖，同樣選擇 260、272、280 nm 和 290 nm 的 HPLC 色譜圖，列出 260、272、280 nm 和 290 nm 波長檢測出 HPLC色譜圖對應的強度值如圖4 和表2。兩種方法顯示新橙皮苷紫外最大吸收波長為280 nm。

表2 不同波長檢測出色譜圖對應的強度值Table 2 Different wavelengths to detect the corresponding intensity values of excellent spectra

2.2 高效液相色譜儀的儀器精密度

高效液相色譜儀的儀器精密度即整機性能用定性和定量的重復性確定。為使分析結(jié)果準確，確保分析數(shù)據(jù)的可靠性，對高效液相色譜儀進行測量重復性驗證，計算相對標準偏差。JJG705-2014《液相色譜儀檢定規(guī)程》計量標準，規(guī)定了定性重復性測量結(jié)果的RSD≤1.0%；定量測量重復性測量結(jié)果的RSD≤3.0%。保留時間和峰面積重復性測定結(jié)果符合標準，滿足本試驗方法的要求見表3。

表3 保留時間和峰面積重復性結(jié)果Table 3 Retention time and peak area reproducibility results

2.3 新橙皮苷定性

將純橙汁和乙腈1 ∶1（體積比）混合，經(jīng)過離心、超聲脫氣和過濾后，轉(zhuǎn)移到自動進樣器樣品瓶中，用相同條件處理新橙皮苷儲備液并轉(zhuǎn)移到自動進樣器樣品瓶中進行HPLC 色譜分析。純橙汁中新橙皮苷定性采用保留時間和樣品中加入新橙皮苷基準物，峰增高的方法完成定性見圖5、圖6 和圖7。

圖5 標樣新橙皮苷的HPLC 色譜圖Fig.5 HPLC chromatogram of standard new hesperidin

圖6 樣品橙汁的HPLC 色譜圖Fig.6 HPLC chromatogram of sample orange juice

圖7 樣品橙汁加入標樣新橙皮苷的HPLC 色譜圖Fig.7 HPLC chromatogram of sample orange juice added with standard new hesperidin

保留時間18.6 min 的色譜峰是新橙皮苷，純橙汁加入新橙皮苷內(nèi)標物該峰明顯增高，由此定性該峰為樣品中新橙皮苷色譜峰。

2.4 新橙皮苷標準曲線的繪制

用1.3.1 配制的500 mg/L 的新橙皮苷儲備液，采用逐級稀釋法分別稀釋配制5、10、15、20 mg/L 的標準液，線性回歸法做新橙皮苷標準曲線見圖8。

圖8 新橙皮苷標準曲線Fig.8 Standard curve of new hesperidin

由圖8 可知，在濃度5 mg/L～20 mg/L 范圍內(nèi)，以橙皮苷濃度及峰面積繪制標準曲線，y=4 857.5x-7 601.5，回歸系數(shù)為0.997 1。

2.5 配制不同濃度樣品的回收率試驗

將配制不同濃度的橙汁樣品分別處理出6 個樣品，分別測定并獲取新橙皮苷HPLC 峰面積，計算空白加標回收率，標準偏差和相對標準偏差。不同濃度的橙汁樣品測定回收率試驗結(jié)果見表4。

表4 不同濃度的橙汁樣品測定回收率試驗結(jié)果Table 4 Test results of recovery rate of orange juice with different concentrations

續(xù)表4 不同濃度的橙汁樣品測定回收率試驗結(jié)果Continue table 4 Test results of recovery rate of orange juice with different concentrations

由表4 可知，測定橙汁樣品結(jié)果的回收率為98.52%～102.04%，相對標準偏差（RSD）為0.69%～3.08%，該方法的分析結(jié)果精密度較好，用該方法測定橙汁含量由較高可靠性。

2.6 國標方法與本方法檢測橙汁含量結(jié)果

根據(jù)國標GB/T 16771-1997《橙、柑、橘汁及其飲料中果汁含量的測定》，對配制的不同濃度的橙汁樣品，檢測了可溶性固形物、鉀、總磷、氨基酸態(tài)氮、L-脯氨酸、總D-異檸檬酸和總黃酮7 個指標的實測值計算橙汁含量的測試結(jié)果。同時對以上橙汁樣品進行本方法測定并獲取新橙皮苷HPLC 峰面積計算出橙汁含量，每個樣品重復測定5 次取平均值，同配制含量進行比較，并計算相對誤差見表5。兩種測試方法結(jié)果相對誤差在0.67%～3.66%之間，準確度較高。

表5 國標方法與本方法檢測果汁含量Table 5 National standard method and this method for detecting fruit juice content

3 結(jié)論

本試驗利用高效液相色譜法測定橙汁含量，通過確定檢測器波長280 nm，選擇橙汁中類黃酮成分之一新橙皮苷做定量基準峰，測定結(jié)果精密度較好回收率為98.52%～102.04%，相對標準偏差（RSD）為0.69%～3.08%，準確度較高相對誤差在0.67%～3.66%之間。

高效液相色譜法測定橙汁含量方法與國標方法相比較，前處理簡單，樣品只需經(jīng)離心、過濾即可檢測，高效快速，整個檢測過程僅需約2.5 h。采用高效液相色譜方法分析橙汁含量簡便快速，結(jié)果準確可靠。