盛亞男 王長(zhǎng)遠(yuǎn),2 張 舒 富天昕 馮玉超 秦海波

(1. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319； 2. 黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 大慶 163319)

綠豆又名青小豆，為藥食兩用作物[1]，具有較高的藥用價(jià)值和良好的保健功能[2-3]。目前，綠豆的加工以傳統(tǒng)淀粉制品為主，造成了綠豆資源的浪費(fèi)。近年來(lái)，越來(lái)越多學(xué)者開(kāi)始關(guān)注綠豆蛋白[4]及膳食纖維[3]、抗性淀粉[5]、酚類(lèi)物質(zhì)[6]、黃酮類(lèi)化合物[7]等功能成分的開(kāi)發(fā)。

植物是酚類(lèi)物質(zhì)的主要來(lái)源。目前對(duì)植物中的酚類(lèi)物質(zhì)已有較多研究，Dueas等[8]采用液相色譜技術(shù)測(cè)得西班牙產(chǎn)蕓豆的酚類(lèi)物質(zhì)總量為279.68 μg/g；García-Lafuente等[9]采用化學(xué)方法測(cè)得西班牙產(chǎn)紫色蕓豆的總酚含量為13.41 mg；冉軍艦等[10]采用超聲波輔助纖維素酶法對(duì)蘋(píng)果中的多酚進(jìn)行提取，將其純度由原來(lái)的0.67%提高至41.65%；王靜等[11]研究了用熱浸法對(duì)花生殼中多酚類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行提取，其提取率為5.66 mg/g；李銀平等[12]研究了微波提取葡萄籽多酚，最佳工藝條件下的提取液總酚含量為96.25 mg/g；伊文峰等[13]研究了超臨界萃取油茶中多酚的方法，總酚提取率達(dá)46.76%。程安瑋等[14]比較了4種豆類(lèi)中多酚、類(lèi)黃酮含量及抗氧化活性。

試驗(yàn)擬對(duì)綠豆多酚提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并研究提取物的抗氧化活性，以期為綠豆功能性食品、藥品的開(kāi)發(fā)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

綠豆：市售；

無(wú)水乙醇、沒(méi)食子酸、福林酚試劑等：分析純，天津市春盛化學(xué)試劑有限公司；

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氰化鉀等：分析純，遼寧泉瑞試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

高速粉碎機(jī)：ZK-300B型，德清拜杰電氣有限公司；

干燥箱：DHG-9240A型，蘇州奧峰烘箱制造有限公司；

分光光度計(jì)：723A型，上海精密科學(xué)儀器有限制造公司；

恒溫水浴鍋：DK-S24型，上海雙旭電子有限公司；

高速離心機(jī)：VL-220B型，長(zhǎng)沙湘儀有限責(zé)任公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理 綠豆清洗后烘干至恒重，粉碎，過(guò)70目篩，得綠豆粉，于冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 根據(jù)文獻(xiàn)[15]修改如下：稱(chēng)取20 mg沒(méi)食子酸于100 mL容量瓶中定容，分別取0.00，0.05，0.10，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00 mL沒(méi)食子酸溶液并加水至1 mL，隨即各加入2 mol/L福林酚試劑0.5 mL混勻，于暗處放置5 min，然后加入20% Na2CO3溶液2.0 mL 后加蒸餾水并定容至25 mL，充分混勻后于室溫靜置1 h。以蒸餾水為空白對(duì)照，于760 nm下測(cè)吸光度值。以沒(méi)食子酸濃度為橫坐標(biāo)(mg/mL)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，線(xiàn)性回歸方程為y=91.4x+0.017(R2=0.995 6)。

1.2.3 綠豆多酚提取量的測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)[16]修改如下：取800 μL提取液于25 mL具塞試管中，加水定容至1 mL，加入0.5 mL福林酚試劑混勻，放置暗處反應(yīng)5 min，然后加入20% Na2CO3溶液2 mL并定容至25 mL，混勻后于室溫靜置1 h。測(cè)定樣品的吸光度值，并代入沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算多酚含量。

1.2.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

(1) 料液比：稱(chēng)取4 g綠豆粉于250 mL具塞三角瓶中，分別按料液比1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25 (g/mL)與體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇混合，50 ℃下提取2 h，考察料液比對(duì)多酚提取量的影響。

(2) 提取時(shí)間：稱(chēng)取4 g綠豆粉于250 mL具塞三角瓶中，按料液比1∶15 (g/mL)與體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇混合，50 ℃下分別提取0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 h，考察提取時(shí)間對(duì)多酚提取量的影響。

(3) 提取溫度：稱(chēng)取4 g綠豆粉于250 mL具塞三角瓶中，按料液比1∶15 (g/mL)與體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇混合，分別于30，40，50，60，70 ℃下提取2 h，考察提取溫度對(duì)多酚提取量的影響。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以多酚提取量為響應(yīng)值，以料液比、提取時(shí)間、提取溫度為因變量進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化綠豆多酚提供工藝參數(shù)。

1.2.6 超氧陰離子自由基清除能力測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)[17-18]修改如下：取Tris-HCl緩沖液(pH 8.2) 4.5 mL于具塞試管中，25 ℃恒溫水浴鍋保溫20 min。取出后立即加入綠豆多酚提取液1.0 mL及3 mmol/L鄰苯三酚溶液(25 ℃水浴鍋中預(yù)熱5 min)0.3 mL，搖勻后放入水浴鍋內(nèi)反應(yīng)5 min。結(jié)束后加入8 mol/L HCl溶液1 mL終止反應(yīng)，于330 nm處測(cè)定吸光度值，以蒸餾水代替鄰苯三酚測(cè)得吸光度值，按式(1)計(jì)算超氧陰離子自由基清除率。

(1)

式中：

E——自由基清除能力，%；

A0——空白對(duì)照吸光值；

A1——加入提取液后吸光值。

1.2.7 亞硝酸根離子清除能力測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)[19]修改如下：取綠豆多酚提取液2 mL于具塞試管中，加入0.005 mg/mL 亞硝酸鈉溶液1 mL，于37 ℃水浴鍋反應(yīng)30 min后加入0.4%對(duì)氨基苯磺酸溶液1 mL，搖勻靜置5 min。隨即加入0.2%鹽酸萘乙二胺溶液0.05 mL，搖勻后加水定容至25 mL，靜置15 min后，于530 nm下測(cè)吸光值。以2.0 mL蒸餾水替代樣品，測(cè)得吸光值，按式(1)計(jì)算亞硝酸根離子清除率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Office 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，每組數(shù)據(jù)進(jìn)行3個(gè)平行試驗(yàn)，取平均值并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，采用Design Expert 10進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 料液比 由圖1可知，綠豆多酚的提取量隨料液比的提高而增加，當(dāng)料液比達(dá)到1∶15 (g/mL)時(shí)多酚提取量達(dá)到最大值，可能是溶劑增至1∶15 (g/mL)前，乙醇使綠豆多酚與大分子物質(zhì)(蛋白質(zhì)、多糖)間的共價(jià)鍵斷開(kāi)，溶劑越多可使其斷鍵越完全。隨后多酚提取量趨于平穩(wěn)，可能是在多酚提取量達(dá)到頂峰后，增加溶劑也不能使多酚的提取含量提高。從提取效果和溶劑用量綜合考慮，選取最佳料液比為1∶15 (g/mL)。

圖1 不同料液比下的多酚提取量

2.1.2 提取時(shí)間 由圖2可知，綠豆多酚的提取量隨提取時(shí)間的增加先上升，當(dāng)提取時(shí)間為3 h時(shí)多酚提取量達(dá)到峰值，之后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，可能是過(guò)長(zhǎng)時(shí)間暴露在空氣中，多酚會(huì)氧化為醌類(lèi)物質(zhì)或者分解。綜合考慮，選取最佳提取時(shí)間為3 h。

圖2 不同提取時(shí)間下的多酚提取量

2.1.3 提取溫度 由圖3可知，多酚提取量隨提取溫度的升高先上升后下降，當(dāng)提取溫度為50 ℃時(shí)提取量達(dá)最大值。提取溫度為40～50 ℃時(shí)，多酚提取量上升較快，可能是綠豆中部分游離酚轉(zhuǎn)化為結(jié)合酚，且在此溫度范圍內(nèi)可能活化了多酚物質(zhì)使其分子運(yùn)動(dòng)速率變大，從而使多酚物質(zhì)被大量提取出來(lái)；提取溫度超過(guò)60 ℃后，多酚提取量急劇下降，可能是過(guò)高的溫度導(dǎo)致多酚分解或揮發(fā)。故選取最佳提取溫度為50 ℃。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析 根據(jù)Box-Behnken中心組合原理進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，試驗(yàn)因素水平表見(jiàn)表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。

利用Design Expert 10軟件對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，得到以多酚含量(Y)為響應(yīng)值的回歸方程：

圖3 不同提取溫度下的多酚含量

水平X1料液比(g/mL)X2提取時(shí)間/hX3提取溫度/℃-11︰513001︰1535011︰25570

表2 多酚提取量響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

(2)

2.2.2 最佳工藝參數(shù) 采用Design Expert 10軟件優(yōu)化得到最佳綠豆多酚提取工藝參數(shù)為：料液比1∶(g/mL)、提取溫度45.64 ℃、提取時(shí)間1.57 h，預(yù)測(cè)多酚提取量為11.78 mg/g。由于此參數(shù)不利于操作，因此調(diào)節(jié)為料液比1∶12 (g/mL)、提取溫度46 ℃、提取時(shí)間1.6 h。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(平行3次)，得到綠豆多酚的平均提取量為11.74 mg/g，與預(yù)測(cè)值相近，說(shuō)明利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化綠豆中多酚提取量的數(shù)值是真實(shí)可靠的。

表3 方差分析

2.3 綠豆多酚抗氧化活性

2.3.1 清除超氧陰離子自由基能力 通過(guò)試驗(yàn)可知，樣品提取液(0.232 8 mg/mL)對(duì)超氧陰離子自由基的清除率為58.5%，介于紅小豆(0.259 2 mg/mL)(清除率50%)與豇豆(0.283 5 mg/mL)(清除率60%)之間[14]，說(shuō)明綠豆多酚提取液清除能力良好。

2.3.2 清除亞硝酸根離子能力 通過(guò)試驗(yàn)可知，樣品提取液對(duì)亞硝酸根離子的清除率為26.0%，說(shuō)明綠豆多酚提取液具有清除亞硝酸根離子的能力。

3 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，最佳綠豆多酚提取工藝為提取溫度46 ℃，提取時(shí)間1.6 h，料液比1∶12 (g/mL)，該條件下綠豆多酚提取量為11.74 mg/g。對(duì)綠豆多酚提取液進(jìn)行抗氧化性研究發(fā)現(xiàn)，綠豆多酚對(duì)超氧陰離子自由基的清除率為58.5%，對(duì)亞硝酸根離子的清除率為26.0%，具有較強(qiáng)的抗氧化能力。試驗(yàn)并未對(duì)多酚類(lèi)化合物進(jìn)行準(zhǔn)確定性，后續(xù)可采用LC-MS對(duì)綠豆多酚類(lèi)化合物進(jìn)行定性定量分析，并采用大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行分析純化，以篩選出起決定性作用的多酚類(lèi)化合物。