張 琪 朱 丹 牛廣財(cái) 魏文毅 趙 婧 武 悅

(1. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319； 2. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

黑豆為豆科植物大豆的黑色種子，又稱烏豆、黑大豆，在東北地區(qū)產(chǎn)量最大。黑豆?fàn)I養(yǎng)豐富，因含植物固醇、黃酮、皂苷等成分，具有較好的降血脂、降膽固醇、抗氧化等功能[1-3]，是開發(fā)抗氧化、抗衰老食品的優(yōu)質(zhì)藥食兼用資源。

豆豉是一種以大豆為主要原料，經(jīng)過制曲、微生物發(fā)酵階段和后熟而形成的傳統(tǒng)發(fā)酵食品[4]，具有藥食兩用性。目前，豆豉的制作原料以黃豆為主，發(fā)酵采用的菌種較多，所得產(chǎn)品的抗氧化性也各不相同。例如，侯竹美等[5]通過米曲霉發(fā)酵黃豆，發(fā)現(xiàn)黃豆豉在發(fā)酵24 d時(shí)還原能力和總酚含量達(dá)到最高值，總酚含量為0.024 mg/mL；發(fā)酵27 d時(shí)黃豆豉對(duì)羥自由基和DPPH自由基的清除率達(dá)到最大，分別達(dá)到了36.07%和64.86%。吳蘭芳等[6]研究了霉菌型黑豆豆豉的主要成分及其抗氧化活性，結(jié)果顯示：黑豆經(jīng)過選用米曲霉(AspergillusoryzaeRIB40)、米根霉(Rhizopusoryzaestrain FSU 6156)發(fā)酵后，抗氧化活性增強(qiáng)。

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)是發(fā)酵細(xì)菌型豆豉的最主要的菌株，而納豆芽孢桿菌(Bacillussubtilisnatto，BSN)是枯草芽孢桿菌的一個(gè)亞種，其對(duì)環(huán)境具有較高的耐受性和穩(wěn)定性[7]，是制作發(fā)酵食品常用的一種有益菌[8]。例如，徐春明等[9]研究了納豆芽孢桿菌發(fā)酵大豆(黃豆)的不同發(fā)酵階段，納豆總酚和異黃酮含量的變化規(guī)律以及體外模擬消化過程中總酚、異黃酮含量與抗氧化活性的變化，結(jié)果表明：總酚含量提高了65.12%，然而異黃酮含量卻降低了63.30%，在模擬胃消化階段，后熟24 h大豆清除ABTS自由基能力和ORAC值分別是干燥大豆的1.80，2.22倍；模擬腸消化階段，后熟24 h大豆清除ABTS自由基能力和ORAC值分別是干燥大豆的1.70，1.41倍，經(jīng)過發(fā)酵的納豆抗氧化活性加強(qiáng)。

試驗(yàn)擬以黑豆為原料，采用納豆芽孢桿菌為菌種，發(fā)酵制備黑豆豆豉，以總多酚含量和DPPH·清除率為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)來確定其最佳的前發(fā)酵工藝條件，以期為黑豆豆豉工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

1.1.1 原料和試劑

黑豆：黑龍江省農(nóng)墾九三榮軍農(nóng)場(chǎng)；

納豆芽孢桿菌粉：上海賀普實(shí)業(yè)有限公司；

福林酚試劑：上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；

沒食子酸、氫氧化鈉、三氯化鐵、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、三氯乙酸、抗壞血酸、鐵氰化鉀、碳酸鈉：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼基自由基(DPPH)：分析純，梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

電子天平：EX324型，奧豪斯儀器(上海)有限公司；

隔水式恒溫培養(yǎng)箱：GHP-9160型，上海市一恒科學(xué)儀器有限公司；

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：DGG-9053A型，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；

低速離心機(jī)：L420型，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；

紫外—可見分光光度計(jì)：L5型，上海儀電分析儀器有限責(zé)任公司；

立式壓力蒸汽滅菌鍋：LDZX-75KB型，上海中安醫(yī)療器械廠。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程

黑豆→浸泡→高溫高壓蒸豆→冷卻→接菌→發(fā)酵→取樣→測(cè)定

1.2.2 操作要點(diǎn)

(1) 室溫下，黑豆與蒸餾水的比例為1∶5 (g/mL)，浸泡24 h后取出瀝干，然后在121 ℃的高溫高壓蒸汽滅菌鍋中蒸豆處理17 min。

(2) 蒸豆后在室溫下冷卻30 min，接入不同比例的納豆芽孢桿菌粉(均勻撒在黑豆樣品表面)。

(3) 在溫度為35～39 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)1～4 d，進(jìn)行前發(fā)酵，并按發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行取樣，測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。

1.2.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

(1) 發(fā)酵時(shí)間對(duì)黑豆豆豉總多酚含量和DPPH·清除率的影響：將高溫高壓處理的黑豆冷卻后，接入1.5 g/100 g·黑豆納豆芽孢桿菌，置于39 ℃恒溫箱中培養(yǎng)發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間分別為1，2，3，4 d，測(cè)定所得黑豆豆豉的總多酚含量和DPPH·清除率。

(2) 發(fā)酵溫度對(duì)黑豆豆豉總多酚含量和DPPH·清除率的影響：將高溫高壓處理的黑豆冷卻后，接入1.5 g/100 g·黑豆納豆芽孢桿菌分別置于35，37，39，41，43 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)發(fā)酵3 d，測(cè)定所得黑豆豆豉的總多酚含量和DPPH·清除率。

(3) 納豆芽孢桿菌接種量對(duì)黑豆豆豉總多酚含量和DPPH·清除率的影響：將高溫高壓處理的黑豆冷卻后，接入納豆芽孢桿菌，其接種量分別為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 g/100 g·黑豆，后置于41 ℃恒溫箱中培養(yǎng)發(fā)酵3 d，測(cè)定所得黑豆豆豉的總多酚含量和DPPH·清除率。

1.2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、接種量為試驗(yàn)因素，以總多酚含量和DPPH清除率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9(33)正交試驗(yàn)優(yōu)化納豆芽孢桿菌發(fā)酵黑豆豆豉工藝條件。

1.2.5 總多酚測(cè)定 采用Folin-Ciocalteu比色法。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制根據(jù)文獻(xiàn)[10]，修改如下：準(zhǔn)確稱取沒食子酸0.100 0 g，用容量瓶定容至100 mL，得到?jīng)]食子酸標(biāo)準(zhǔn)液濃度為1 000 mg/L。分別配制濃度為0.0，12.5，25.0，50.0，100.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。得到?jīng)]食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖1)方程為：y= 0.018x+0.078 4，R2=0.998 5。

取2 g黑豆樣品加以研磨后加蒸餾水定容至20 mL。3 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL，將其稀釋50倍；

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別加入福林酚顯色劑1 mL，20% Na2CO3溶液3 mL，混勻，在50 ℃水浴反應(yīng)30 min后測(cè)定吸光度。按式(1)計(jì)算總多酚含量[11]。

(1)

式中：

R——總多酚含量，mg/g；

C——樣液總酚濃度，mg/mL；

V——提取液體積，mL；

N——稀釋倍數(shù)；

W——黑豆質(zhì)量，g。

1.2.6 DPPH自由基(DPPH·)清除率的測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)[12]，修改如下：稱取19.7 mg DPPH，用95%乙醇溶解并定容至100 mL(DPPH濃度為0.5 mmol/mL)，配制好后0～4 ℃下避光保存。取2 mL稀釋后的樣液與0.5 mL DPPH溶液，混合均勻后在37 ℃下黑暗處放置20 min，此時(shí)用95%甲醇為空白，在517 nm條件下測(cè)定其吸光度；取2 mL 95%甲醇與0.5 mL DPPH溶液混合，混合均勻后在37 ℃下黑暗處放置20 min，此時(shí)用無水甲醇為空白，在517 nm條件下測(cè)定其吸光度；取2 mL處理好的樣液與0.5 mL 95%甲醇混合，混合均勻后37 ℃下黑暗處放置20 min，此時(shí)用95%甲醇為空白，在517 nm條件下測(cè)定其吸光度。按式(2)計(jì)算DPPH·清除率。

(2)

式中：

Y——DPPH·清除率，%；

Ai——加發(fā)酵液反應(yīng)后DPPH溶液的吸光度；

Ac——加DPPH溶液，不加發(fā)酵液的吸光度；

Aj——加發(fā)酵液，不加DPPH溶液的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0軟件對(duì)試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算，并采用Origin 9.0軟件進(jìn)行作圖分析。所有試驗(yàn)均進(jìn)行3次平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)黑豆豆豉總多酚含量和DPPH·清除率的影響

由圖2可知，在前3 d，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，總多酚含量和DPPH·清除率均升高，說明發(fā)酵初期對(duì)納豆芽孢桿菌的代謝活動(dòng)有很大影響；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間到第3天時(shí)，總多酚含量和DPPH·清除率達(dá)到最高值，分別為3.67 mg/g和84.9%，可能是納豆芽孢桿菌將復(fù)雜的大分子酚類物質(zhì)轉(zhuǎn)化成小分子酚類物質(zhì)，使得總多酚含量升高；此外，隨著發(fā)酵時(shí)間的不斷增加，自身的抗氧化物質(zhì)不斷浸出，而酚類物質(zhì)能給出一個(gè)氫離子并通過共振雜化而穩(wěn)定[13]，且含有的多酚類化合物具有較強(qiáng)的自由基清除能力[14]。發(fā)酵到第4天時(shí)，多酚含量相對(duì)較低，但是，此時(shí)DPPH·清除率仍然較高，說明黑豆豆豉中除了多酚物質(zhì)外，還含有其他具有較高DPPH·清除率的活性物質(zhì)，如黃酮類物質(zhì)、原花青素物質(zhì)等。因此，發(fā)酵時(shí)間選擇2，3，4 d 進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)黑豆豆豉總多酚含量和DPPH·清除率的影響

Figure 2 Effect of different fermentation time on total polyphenol content and DPPH radical scavenging rate of fermented black bean

2.2 發(fā)酵溫度對(duì)黑豆豆豉總多酚含量和DPPH·清除率的影響

由圖3可知，在41 ℃之前，隨著發(fā)酵溫度的升高，總多酚含量也持續(xù)升高，當(dāng)溫度在41 ℃時(shí)，總多酚含量達(dá)到最高，為3.99 mg/g，可能是在發(fā)酵過程中，分子的滲透、擴(kuò)散、溶解速率會(huì)隨著溫度升高而加快[15]，然而高溫可在一定程度上破壞細(xì)胞壁的完整性[16]。當(dāng)溫度為39 ℃ 時(shí)，DPPH·清除率達(dá)到最高?？梢猿醪脚袛喈?dāng)發(fā)酵時(shí)間在39～41 ℃時(shí)總多酚含量高，抗氧化能力強(qiáng)，DPPH·清除率高。由于納豆芽孢桿菌的發(fā)酵溫度一般在38～45 ℃，所以，在后續(xù)正交試驗(yàn)中，發(fā)酵溫度選擇39，41，43 ℃ 3個(gè)水平。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)黑豆豆豉總多酚含量和

Figure 3 Effect of different fermentation temperature on total polyphenols content and DPPH radical scavenging rate of fermented black bean

2.3 接種量對(duì)黑豆豆豉總多酚含量和DPPH·清除率的影響

由圖4可知，隨著接種量的增加，總多酚含量及DPPH·清除率均呈先升高再降低的趨勢(shì)，當(dāng)接種量為2.0 g/100 g·黑豆時(shí)，總多酚含量及DPPH·清除率均達(dá)到最高值，可能是菌種在發(fā)酵的過程中產(chǎn)酸，使pH降低，從而在一定程度上影響酶的活性，微生物的細(xì)胞膜所帶電荷會(huì)有所改變，因此改變了細(xì)胞膜的透性，從而降低了菌種對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝物的排泄[17]。因此，在后續(xù)正交試驗(yàn)中接種量選擇1.5，2.0，2.5 g/100 g·黑豆3個(gè)水平。

圖4 接種量對(duì)黑豆豆豉總多酚含量和

Figure 4 Effect of different inoculation amount on total polyphenol content and DPPH radical scavenging rate of fermented black bean

2.4 正交試驗(yàn)

以發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、接種量為試驗(yàn)因素，按照表1進(jìn)行正交試驗(yàn)，以確定最佳發(fā)酵條件，結(jié)果見表2。由表2可知，對(duì)總多酚含量和DPPH·清除率兩個(gè)指標(biāo)的主次影響順序均為A>C>B。由發(fā)酵產(chǎn)物的總多酚含量的正交試驗(yàn)結(jié)果可知，發(fā)酵的最佳條件是A3B2C2；由發(fā)酵產(chǎn)物的DPPH·清除率的正交試驗(yàn)結(jié)果可知，發(fā)酵的最佳條件是A3B1C3。由表3、4可知，各因素對(duì)總多酚含量和DPPH·清除率的影響均不顯著(P<0.05)。

綜合考慮上述兩個(gè)正交試驗(yàn)結(jié)果的差異，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，如表5所示，最佳的發(fā)酵條件為A3B1C3，即發(fā)酵時(shí)間4 d、發(fā)酵溫度39 ℃、接種量2.5 g/100 g·黑豆，該條件發(fā)酵所得黑豆豆豉的總多酚含量可達(dá)到4.24 mg/g，DPPH·清除率達(dá)到79.86%。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

表3以總多酚含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)的正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

Table3Varianceanalysisoforthogonalexperimentsusingtotalpolyphenolcontentasevaluationindex

來源平方和自由度方差F值顯著性A3.91721.9593.8940.204B0.01520.0080.0150.985C0.23320.1170.2320.812誤差1.00620.503校正總計(jì)5.1728

表4以DPPH·清除率為評(píng)價(jià)指標(biāo)的正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

Table4VarianceanalysisoforthogonalexperimentsusingDPPHscavengingrateasevaluationindex

來源平方和自由度方差F值顯著性A579.1792289.59014.1440.066B52.677226.3381.2860.437C264.3702132.1856.4560.134誤差40.947220.474校正總計(jì)937.1748

表5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)得出，黑豆豆豉前發(fā)酵的最優(yōu)工藝組合為發(fā)酵時(shí)間4 d，發(fā)酵溫度39 ℃，接種量2.5 g/100 g·黑豆，該條件發(fā)酵所得黑豆豆豉的總多酚含量為4.24 mg/g，DPPH·清除率為79.86%。研究結(jié)果表明，采用納豆芽孢桿菌發(fā)酵來生產(chǎn)抗氧化能力較強(qiáng)的黑豆豆豉是可行的。后續(xù)將對(duì)后發(fā)酵中發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度以及食鹽、白酒等輔料對(duì)黑豆豆豉風(fēng)味物質(zhì)形成、營養(yǎng)成分變化、功能因子形成及抗氧化活性的影響作進(jìn)一步的研究。