林 巍 劉曉蘭 任 健 高 健 杜 宏

(1. 齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006； 2. 黑龍江省玉米深加工理論與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

蕓豆是黑龍江種植面積最大的豆類作物之一，營(yíng)養(yǎng)豐富，其中清蛋白含量較高，并且所含氨基酸種類豐富，配比合理。但是由于蕓豆蛋白的理化性質(zhì)限制了其應(yīng)用，目前蕓豆蛋白在食品行業(yè)的利用率還比較低，深加工產(chǎn)品綜合利用技術(shù)水平低且附加值不高。近年來(lái)，眾多學(xué)者致力于蕓豆蛋白功能特性的改善研究，如：劉高梅等[1]研究表明超聲能夠改善蕓豆蛋白的部分理化性質(zhì)和功能性質(zhì)；左鋒等[2]采用乙酰化處理對(duì)蕓豆分離蛋白進(jìn)行了改性，發(fā)現(xiàn)乙酰化改性后蕓豆分離蛋白的表面巰基含量和表面疏水性顯著提高，并且增強(qiáng)了凝膠形成過(guò)程中蛋白質(zhì)分子相互作用；何慶燕等[3]研究了雞肉蛋白與蕓豆蛋白交聯(lián)對(duì)蛋白質(zhì)凝膠性、乳化性等功能性質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)TG酶促交聯(lián)能促進(jìn)雞肉蛋白和蕓豆蛋白交聯(lián)，并有利于改善混合蛋白食品的功能特性。蛋白質(zhì)的美拉德反應(yīng)是蛋白自由氨基與還原糖羰基之間發(fā)生的非酶褐變反應(yīng)，廣泛存在于食品加工和貯藏過(guò)程中，此反應(yīng)能夠有效改善蛋白的功能性質(zhì)[4-5]。但是目前關(guān)于蕓豆蛋白糖基化改性的相關(guān)研究甚少，僅有馮玉超等[6]使用氨基葡萄糖對(duì)蕓豆蛋白進(jìn)行了糖基化改性，發(fā)現(xiàn)糖基化后蕓豆蛋白的溶解性、乳化性、起泡性皆有所提高，表明利用糖基化改善蕓豆蛋白功能性具有可行性。不同的還原糖美拉德反應(yīng)效果有所不同，因此研究并篩選美拉德反應(yīng)最佳的還原糖，可最大程度提高蕓豆蛋白的功能性。試驗(yàn)擬探討3種還原糖與蕓豆清蛋白美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的乳化性與結(jié)構(gòu)之間的構(gòu)效關(guān)系，以期改善蕓豆蛋白的功能特性，為開(kāi)發(fā)穩(wěn)定的蕓豆蛋白高附加值產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料

紫花蕓豆：蛋白含量23.77%，市售；

5,5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、8-苯胺-1-萘磺酸(ANS)：分析純，美國(guó)Sigma公司；

葡萄糖、果糖、乳糖：分析純，天津凱通化學(xué)試劑有限公司；

其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器設(shè)備

多功能酶標(biāo)儀：EnSpire型，美國(guó)珀金埃爾默公司；

電子分析天平：FA1004型，上海巴拓儀器有限公司；

高速離心機(jī)：CF15RXII型，日本日立公司；

真空冷凍干燥機(jī)：Alphal-4/1sc型，德國(guó)Martin Christ公司；

水浴恒溫振蕩器：SHZ-88型，常州潤(rùn)華電器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 紫花蕓豆清蛋白(KPI)的提取 根據(jù)文獻(xiàn)[7]對(duì)紫花蕓豆中清蛋白進(jìn)行提取，提取物-80 ℃冷凍干燥48 h后，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 蕓豆蛋白美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的制備 將提取的蕓豆蛋白配制成30 mg/mL的溶液3份，分別加入葡萄糖、果糖和乳糖，使糖與蛋白質(zhì)量比為1∶1，攪拌均勻后，調(diào)pH值至8.0后，90 ℃水浴中反應(yīng)180 min，反應(yīng)后迅速冷卻，得到蕓豆蛋白(KPI)—各還原糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(KPI與乳糖產(chǎn)物簡(jiǎn)稱為KPI+L、KPI與葡萄糖產(chǎn)物簡(jiǎn)稱為KPI+G、KPI與果糖產(chǎn)物簡(jiǎn)稱為KPI+F)，各產(chǎn)物-80 ℃冷凍干燥48 h后，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 乳化性測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)[8]。

1.2.4 表面疏水性 根據(jù)文獻(xiàn)[9]，用10 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液配制濃度為0.025，0.100，0.250，0.500，1.000 mg/mL 的蕓豆蛋白溶液，設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)374 nm，發(fā)射波長(zhǎng)467 nm，測(cè)定蕓豆蛋白的熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度對(duì)蕓豆蛋白濃度作圖，曲線的初始斜率即樣品的表面疏水值H0。

1.2.5 巰基含量測(cè)定 用pH 8.0的Tris-甘氨酸緩沖液將蕓豆蛋白稀釋為2 mg/mL的蛋白樣品，根據(jù)文獻(xiàn)[9]測(cè)定蕓豆蛋白表面巰基含量和游離巰基含量。

1.2.6 紫外吸收光譜分析 根據(jù)文獻(xiàn)[10]，用10 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液作為空白對(duì)照，并用其將樣品稀釋至蛋白質(zhì)量濃度為1 mg/mL，紫外掃描光譜范圍230～400 nm。

1.2.7 內(nèi)源熒光光譜分析 根據(jù)文獻(xiàn)[10]，用10 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液將樣品稀釋至蛋白質(zhì)量濃度為1 mg/mL。在激發(fā)波長(zhǎng)280 nm條件下，發(fā)射光譜范圍300～480 nm內(nèi)進(jìn)行掃描，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm。

1.3 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS 19.0軟件，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，差異顯著者再進(jìn)行LSD檢驗(yàn)。各組數(shù)據(jù)結(jié)果以(平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)蕓豆清蛋白美拉德產(chǎn)物乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響

如圖1所示，3種還原糖與KPI的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的EAI及ESI均極顯著高于KPI的(P<0.01)；其中KPI+F的乳化性及乳化穩(wěn)定性最理想，乳化性由原來(lái)的37.52 m2/g 增加為98.69 m2/g，乳化穩(wěn)定性由16.88 min增加到28.68 min。美拉德反應(yīng)過(guò)程中糖的引入，使KPI空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，處于蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水性基團(tuán)暴露出來(lái)，在油—水界面發(fā)生變性，可使蛋白具有雙親表面活性劑的功能，增強(qiáng)了對(duì)蛋白表面的保護(hù)，阻止油滴的聚集，使乳化活性增強(qiáng)[11]。

*. 與KPI組相比差異顯著(P<0.05) **. 與KPI組相比差異極顯著(P<0.01)

圖1 糖對(duì)蕓豆清蛋白美拉德產(chǎn)物乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響

Figure 1 Effects of sugars on ESI of maillard products of kidney bean protein

2.2 對(duì)蕓豆清蛋白美拉德產(chǎn)物表面疏水性的影響

表面疏水性(H0)用來(lái)表征蛋白質(zhì)在極性環(huán)境中表面疏水性氨基酸殘基的數(shù)量，可反映蛋白質(zhì)構(gòu)象變化[12]。由圖2可知，與蕓豆蛋白的表面疏水性相比，3種還原糖與蕓豆蛋白美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的表面疏水性均顯著增強(qiáng)(P<0.01)。這可能是KPI與還原糖發(fā)生接枝反應(yīng)，導(dǎo)致KPI空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使蛋白質(zhì)分子內(nèi)氫鍵、靜電、疏水相互作用發(fā)生變化，暴露了蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的疏水性基團(tuán)，掩蓋周?chē)挠H水性基團(tuán)，增加了蛋白的表面疏水性，蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)也隨之改變。

*. 與KPI組相比差異顯著(P<0.05) **. 與KPI組相比差異極顯著(P<0.01)

圖2 蕓豆清蛋白及其美拉德產(chǎn)物的表面疏水性

Figure 2 The surface hydrophobicity of kidney bean protein and its maillard products

2.3 對(duì)蕓豆清蛋白美拉德產(chǎn)物巰基含量的影響

巰基是蛋白質(zhì)中重要的官能團(tuán)，參與弱次級(jí)鍵的形成，維持三級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，其含量變化反映了蛋白的變性程度，對(duì)蛋白質(zhì)功能性質(zhì)有關(guān)鍵的影響，表面巰基含量變化還可反映出蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)的變化[9]。由圖3可知，還原糖的接入，使KPI表面巰基和總游離巰基含量均顯著降低(P<0.01)，可能是美拉德反應(yīng)使蛋白質(zhì)形成高分子多聚體，在這個(gè)過(guò)程中表面巰基可轉(zhuǎn)化為二硫鍵，導(dǎo)致蕓豆蛋白美拉德反應(yīng)產(chǎn)物表面巰基含量的下降；而總游離巰基含量的顯著降低也進(jìn)一步證明了蕓豆蛋白在與還原糖發(fā)生美拉德反應(yīng)后，分子結(jié)構(gòu)中的游離巰基發(fā)生反應(yīng)形成二硫鍵，參與蛋白空間結(jié)構(gòu)的改變，使蛋白的功能性質(zhì)改變。

2.4 對(duì)蕓豆清蛋白美拉德產(chǎn)物紫外吸收光譜的影響

蛋白質(zhì)產(chǎn)生紫外吸收光譜主要是因?yàn)樯彼岷屠野彼嵩?80 nm波長(zhǎng)附近有一個(gè)吸收峰。由圖4可知，蕓豆清蛋白及其與3種還原糖的美拉德產(chǎn)物在284 nm處有最大吸收峰，其中KPI、KPI+L及KPI+G紫外吸收波譜基本一致，未見(jiàn)明顯變化；僅蕓豆蛋白與果糖的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物KPI+F的紫外吸光度明顯增加，可能是KPI+F在溶液中的構(gòu)象發(fā)生改變，蛋白分子外部生色基團(tuán)暴露出來(lái)，引起紫外吸光度升高。此結(jié)果與之前測(cè)得的蛋白乳化性及其穩(wěn)定性的變化相一致，表明不同還原糖對(duì)美拉德反應(yīng)的影響不同，其中蕓豆—果糖美拉德產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)變化最大，功能性質(zhì)改變最明顯。

*. 與KPI組相比差異顯著(P<0.05) **. 與KPI組相比差異極顯著(P<0.01)

圖3 蕓豆清蛋白及其美拉德產(chǎn)物的巰基含量

Figure 3 The sulfhydry content of kidney bean protein and its maillard products

圖4 蕓豆清蛋白及其美拉德產(chǎn)物的紫外吸收光譜

2.5 對(duì)蕓豆清蛋白美拉德產(chǎn)物內(nèi)源熒光光譜的影響

蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光光譜主要是由其分子中的色氨酸殘基側(cè)鏈發(fā)射產(chǎn)生的。色氨酸對(duì)局部環(huán)境的變化具有高靈敏性，通過(guò)蛋白分子中側(cè)鏈的色氨酸殘基變化可以反映美拉德反應(yīng)過(guò)程中蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化[13]。由圖5可知，3種還原糖的美拉德產(chǎn)物的內(nèi)部熒光強(qiáng)度均低于KPI，降低程度為KPI+F>KPI+L>KPI+G，表明KPI與3種還原糖發(fā)生美拉德反應(yīng)，改變了蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)，降低了KPI的熒光強(qiáng)度。最大吸收波長(zhǎng)(λmax)與色氨酸殘基所處微環(huán)境有關(guān)，λmax>330 nm表明色氨酸殘基暴露于蛋白質(zhì)分子外部的極性環(huán)境中，λmax<330 nm表示色氨酸殘基包埋于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的非極性環(huán)境中，λmax越大色氨酸殘基的微環(huán)境極性越強(qiáng)[14]。由圖5還可知，KPI+L的λmax由345 nm(KPI的λmax)變?yōu)?50 nm，而KPI+F和KPI+G的λmax變?yōu)?55 nm，即發(fā)生紅移，說(shuō)明KPI因與糖發(fā)生共價(jià)交聯(lián)，而使色氨酸殘基暴露于更加親水的環(huán)境中。3種還原糖中，果糖反應(yīng)物的熒光強(qiáng)度最低，發(fā)射波長(zhǎng)最長(zhǎng)，此結(jié)果與之前測(cè)得的蛋白乳化性增強(qiáng)及紫外吸收光譜的改變等結(jié)果相一致，進(jìn)一步證明了果糖的反應(yīng)活性最大，美拉德反應(yīng)最強(qiáng)烈，用于蕓豆蛋白美拉德糖基化改性的效果最好。

圖5 蕓豆清蛋白及其美拉德產(chǎn)物的內(nèi)源熒光光譜

Figure 5 Changes of intrinsic fluorescence spectra of kidney bean protein and its maillard products

3 結(jié)論

試驗(yàn)采用美拉德反應(yīng)對(duì)蕓豆清蛋白進(jìn)行改性，制備了蕓豆蛋白和葡萄糖、果糖及乳糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，通過(guò)對(duì)蛋白表面疏水性、巰基含量、內(nèi)部熒光光譜和紫外吸收光譜分析得出，蕓豆蛋白與還原糖發(fā)生美拉德反應(yīng)后，空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，蛋白分子內(nèi)部生色基團(tuán)、疏水性基團(tuán)暴露，色氨酸微環(huán)境改變，導(dǎo)致紫外吸收增加，內(nèi)部熒光強(qiáng)度降低且發(fā)生紅移，使蕓豆蛋白表面疏水性增強(qiáng)，更有利于蛋白吸附到油水界面，使乳化性增強(qiáng)。葡萄糖、果糖和乳糖與蕓豆蛋白發(fā)生美拉德反應(yīng)程度略有不同，從改善蕓豆蛋白的乳化活性及乳化穩(wěn)定性角度看，其中果糖改善效果最好。后續(xù)可對(duì)蕓豆蛋白美拉德反應(yīng)產(chǎn)物在具體食品模型中的應(yīng)用進(jìn)行研究，以利于蕓豆資源的合理開(kāi)發(fā)和用。