譚長安 郭金珠

卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)是常見的婦科腫瘤，發(fā)現時大多已處于疾病晚期，因此死亡率比較高[1-2]。并且卵巢癌干細胞具有高度惡性的生物學行為，容易發(fā)生侵襲轉移，嚴重威脅著婦女的身心健康[3-4]。放化療為晚期卵巢癌的常見治療方法，但是治療后容易復發(fā)[5]。microRNA(miRNA)是近年來在真核生物中發(fā)現的一類長度約為22個核苷酸的非編碼的小RNA分子，miRNA可通過靶向作用于多種腫瘤抑制基因，對腫瘤肝細胞的生長、轉移等有調節(jié)作用[6-7]。miRNA在腫瘤中的表達往往是失調的，與其他腫瘤相似，卵巢癌也有其特異的miRNA表達譜，miRNA可通過靶向作用于多種腫瘤抑制基因或轉移抑制基因，調節(jié)卵巢癌的生長、侵襲和轉移[8]。MicroRNA-21(miR-21)是在肺癌、肝癌、乳腺癌、膠質母細胞瘤、胃癌等多種癌組織中過高表達[9]，在腫瘤各個階段演變過程中，伴隨有信號傳導基因、抑癌基因、致癌基因等異常表達，也存在凋亡受阻、增殖侵襲、失控、轉移等異常變化等[10]。細胞分裂周期蛋白4(cell division cyclin 4，cdc4)是1種細胞分裂周期蛋白質，是控制細胞周期進入M期的關鍵因子之一，在真核生物的細胞有絲分裂中起重要調節(jié)作用[11]。本文具體探討了miR-21靶向cdc4影響人卵巢癌干細胞生物學效應的價值，希望為卵巢癌的防治提供可能的靶點?，F報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

轉染試劑Lipo2000、凋亡試劑盒、Trizol、FBS胎牛血清、青霉素/鏈霉素、0.25%胰酶、CCK-8檢測試劑盒、DMEM培養(yǎng)液(美國GIBCO)，蛋白質提取試劑、6×上樣緩沖液、ECL檢測試劑盒、蛋白BCA定量試劑盒(日本TaKaRa)，miR-21 mimics、miRNA陰性對照(NC)、miR-21 inhibitor(上海吉瑪)，IGF-1抗體、GAPDH抗體(美國abcam)；卵巢癌干細胞OVCAR3。

制冰機、低溫冰箱(日本SANYO)，細胞培養(yǎng)箱、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板、離心管(美國sigma)，臺式離心機(上海奧豪斯)，電泳儀(美國Bio-RAD)。

卵巢癌干細胞OVCAR3細胞株(中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所)。

1.2 細胞培養(yǎng)與轉染

實驗分組：miR-21 inhibitor組、miR-21 inhibitor NC組、miR-21 mimic組、miR-21 mimic NC組、blank組。

采用脂質體細胞進行轉染，轉染前1天，5000個/孔卵巢癌干細胞OVCAR3接種于96孔板上，細胞生長密度在24 h后約為80.0%，在100 μl的無血清培養(yǎng)基中加入6 pmol 的樣本(miR-21 inhibitor、miR-21 inhibitor NC、miR-21 mimic、miR-21 mimic NC)進行轉染，轉染體系終體積200 μl，轉染樣本的終濃度30 nM，每個樣本設置3個復孔。

1.3 細胞增殖、細胞凋亡檢測

在細胞轉染后48 h進行細胞活性的檢測，加入10 μl 的CCK-8試劑，孵育2 h，用酶標儀測定每孔在波長為450 nm處的吸光度，計算相對增殖活性。同時將手記細胞重懸在AnnexinV 結合緩沖液中，稀釋至1×106個細胞/ml；取100 μl 細胞懸液加入和5 μl Alexa Fluor 488 Annexin V 工作液和1 μ 100 μg/ml 的PI，避光室溫孵育15 min；然后加入400 μl AnnexinV 結合緩沖液，用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.4 細胞周期檢測

細胞轉染后48 h，取細胞樣本進行固定，用PBS洗2次，加入100 μl PBS后混勻，同時加入等體積的碘化丙錠染液低溫(4 ℃)混合，尼龍膜過濾后上流式細胞儀檢測細胞周期。

1.5 cdc4的表達檢測

細胞轉染后48 h，收集細胞，加入細胞裂解液，在冰上靜置30 min，使細胞充分裂解，4 ℃ 14 000 rpm 離心10 min，取上清蛋白液。使用BCA 法檢測蛋白樣品的濃度，經過電泳、轉膜、封閉、孵一抗、孵二抗、ECL發(fā)光等步驟，根據曝光所得條帶的灰度值分析cdc4蛋白的表達水平(actin為內參)。

上述所有實驗重復三次，每個樣品取3個平行。

1.6 統計學方法

應用統計軟件GraphPad prism 6.0與SPSS 22.00進行統計學分析，計量資料采用均數±標準差表示，對比方法主要為方差分析、t檢驗、LSD-t檢驗等，檢驗水準為α=0.05。

2 結果

2.1 轉染后miR-21表達水平對比

以blank組為參照，轉染細胞48 h后，qRT-PCR檢測顯示mimic組、mimic NC組、inhibitor組、inhibitor NC組的miR-21的相對表達量分別為10.49±2.18，1.29±0.55，0.20±0.08，1.39±0.19，對比差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2 細胞增殖與凋亡水平對比

轉染細胞48 h后，mimic組比mimic NC組細胞的增殖活性下降，inhibitor組比inhibitor NC組細胞的增殖活性增強，對比差異有統計學意義(P<0.05)；mimic組、mimic NC組、inhibitor組、inhibitor NC組、blank組凋亡率分別為(40.00±3.18)%、(18.19±2.01)%、(7.44±1.11)%、(18.11±1.86)%、(17.22±3.84)%，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同組別轉染后不同時間點的細胞增殖與凋亡水平對比

注：*為與相應的NC組相比，P<0.05。

2.3 細胞周期狀況對比

轉染細胞48 h后，mimic組的G0/G1期細胞數目顯著高于blank組與mimic NC組，S、G2/M期細胞數目顯著減少(P<0.05)。見表2。

2.4 cdc4蛋白表達水平對比

轉染細胞48 h后，cdc4蛋白在mimic組、mimic NC組、inhibitor組、inhibitor NC組、blank組中的相對表達水平分別為0.45±0.22，1.45±0.14，3.89±0.11，1.66±0.33，1.74±0.32，對比差異有統計學意義(P<0.05)。

表2 不同組別的細胞周期狀況對比

注：*為與相應的NC組相比，P<0.05。

3 討論

卵巢癌是高度惡性的婦科腫瘤，在女性生殖系統惡性腫瘤中發(fā)病率次于宮頸癌和乳腺癌，且其易發(fā)生廣泛的腹腔內種植播散，臨床死亡率比較高[12]。雖然根治卵巢癌的方法是早期手術切除，但大部分患者在確診時已發(fā)生遠處轉移，失去了手術治療的指征[13]。目前對于卵巢癌病理與預后因素的研究已日趨成熟，但是有關其分析發(fā)病機制方面沒有定論。

miRNA是1類內源性的非編碼的小分子RNA，其參與細胞增殖、凋亡、腫瘤發(fā)生及侵襲、轉移、血管生成等過程，且具有重要的調控作用[14]。miRNA是重要的轉錄后調控因子，其可作為癌基因或抑癌基因發(fā)揮作用，特別是其異常表達可參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。miR-21 mimic的導入能夠模擬細胞內的內源性miR-21，建立miRNA過表達的模型；而miRNA inhibitor是可以與miR-21完全互補的反義寡核苷酸序列，轉染后可抑制miRNA的功能[15]。miRNA在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中存在直接調控作用，研究顯示卵巢癌組織中有35個miRNA的表達與正常對照標本相比有統計學差異，其中31個miRNA呈現低表達[16]。本研究顯示過表達miR-21能抑制卵巢癌干細胞的增殖活性，增加細胞的凋亡。

miRNAs在腫瘤中的表達往往是失調的，與其他腫瘤相似。鼻咽癌鱗狀腫瘤也有其特異的miRNA表達譜，miRNAs可通過靶向作用于多種腫瘤抑制基因或轉移抑制基因，調節(jié)卵巢癌干細胞的生長、侵襲和轉移[17]。卵巢癌的主要致病基因尚不清楚，而對卵巢癌相關基因定位，或尋找突變位點對卵巢癌發(fā)病機制起重要作用，有利于鼻咽癌的早期診斷[18]。有研究顯示卵巢癌中cdc4蛋白的表達顯著低于癌旁組織及正常組織，cdc4蛋白的表達與卵巢癌患者的性別、年齡、腫瘤部位無關，而與腫瘤浸潤深度、分化程度、臨床分期、淋巴結轉移有關，可成為早期診斷、判斷卵巢癌預后及浸潤轉移的生物學指標[19-20]。本研究顯示轉染細胞48 h后，mimic組的G0/G1期細胞數目顯著高于blank組與mimic NC組，S、G2/M期細胞數目顯著減少(P<0.05)。表明miR-21可使大部分細胞分裂處于G0/G1期，但是在此過程中還有哪些原癌基因和抑癌基因的參與，還需要深入研究。

cdc4是控制細胞周期進入M期的關鍵因子之一，其表達量的變化與腫瘤的發(fā)生機制有關，已被發(fā)現是1種新的腫瘤相關抗原[21]。cdc4能促使cyclin E、c-Myc、c-Jun等癌基因蛋白類的降解，可成為腫瘤生物治療的新靶點[22]。miRNAs可通過與靶基因mRNA的特異性結合來降解mRNA或抑制蛋白的翻譯，miRNAs除參與腫瘤癌細胞的分化外，還在腫瘤細胞的侵襲和遷移過程過程中發(fā)揮重要作用[23]。本研究顯示轉染miR-21到卵巢癌干細胞48 h后，cdc4蛋白的表達量顯著降低。相關研究也顯示cdc4對腫瘤的發(fā)生起促進作用，很多腫瘤中存在cdc4的高表達，抑制cdc4表達可以起到抑癌作用[24]。不過本研究也有一定的缺陷，首先是研究樣本數目較少，其次雖然明確miR-21能抑制細胞增殖與促進細胞凋亡，但是其是否為卵巢癌的抑癌基因還有待深入分析。

綜上所述，過表達miR-21能抑制卵巢癌干細胞的增殖與促進細胞凋亡，調節(jié)細胞周期，其具體機制可能是miR-21通過負調控cdc4的表達而實現。