鄭志剛 華清泉 陳 鋒

鼻咽癌是耳鼻喉科常見的嚴(yán)重癌癥之一，我國南方是鼻咽癌的高發(fā)區(qū)，發(fā)病因素可能與環(huán)境氣候有關(guān)[1]。對(duì)于鼻咽癌的治療臨床上目前有多種治療方法，但手術(shù)過程繁瑣并且患者預(yù)后不佳[2]，對(duì)于這一問題的改進(jìn)，本研究中創(chuàng)新性的應(yīng)用了UBE2T基因表達(dá)的方式以通過泛素-蛋白酶體途徑作用于鼻咽癌中半衰期較短的蛋白和一些結(jié)構(gòu)異常、錯(cuò)構(gòu)且易于檢測(cè)觀察的蛋白[3]，再此蛋白的基礎(chǔ)上通過轉(zhuǎn)染UBE2T特異性siRNA載體，采用MTT法檢測(cè)與鼻咽癌相關(guān)的5-8F細(xì)胞增殖、采用Transwell 遷移侵襲試驗(yàn)檢測(cè)5-8F細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移并利用Western blotting法檢測(cè)5-8F細(xì)胞中逆轉(zhuǎn)錄的UBE2T蛋白表達(dá)于鼻咽癌中的顯像效果[4]。為此，筆者探討UBE2T基因表達(dá)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力的影響從而研究出鼻咽癌5-8F細(xì)胞可成為鼻咽癌治療的分支靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

材料主要包含：鼻咽癌細(xì)胞系5-8F細(xì)胞，空白載體，UBE2T特異性siRNA載體，轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄酶。試劑主要有：TRIZOL試劑、秋水仙素、龍膽紫溶液、無酶的RNA沖洗液、SYBR Green 1 染料、上游引物、下游引物、dNTP。Western blotting檢測(cè)試劑：30克丙烯酰胺和0.8克N,N'-亞甲丙烯酰胺、4×Tris·cl/SDS,pH 8.8、4×SDS電泳緩沖液、TEMED (N,N,N'，N'-四甲基乙二胺)、10%過硫酸銨。MTT法檢測(cè)試劑：MTT 0.5克，100 ml的磷酸緩沖液(PBS)或無酚紅的培養(yǎng)基。Transwell 遷移侵襲試驗(yàn)試劑：無血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM、 1640完全培養(yǎng)基(也可加到20%血清)，無菌PBS，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，結(jié)晶紫染液(0.1%(g/ml)PBS結(jié)晶紫)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

將5-8F細(xì)胞放入瓊脂培養(yǎng)基中放入細(xì)胞保溫箱中進(jìn)行傳代培養(yǎng)后，將培養(yǎng)后的細(xì)胞隨機(jī)分為3組即對(duì)照組、空白轉(zhuǎn)染組和si-UBE2T組。其中對(duì)照組不做任何處理；空白轉(zhuǎn)染組細(xì)胞轉(zhuǎn)染空白載體；si-UBE2T組細(xì)胞轉(zhuǎn)染UBE2T特異性siRNA載體。分別采用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況，采用Transwell遷移侵襲試驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞遷移和侵襲，Western blotting法檢測(cè)各組細(xì)胞UBE2T蛋白表達(dá)，4～6周期后分別對(duì)3組實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行測(cè)量與統(tǒng)計(jì)，并分析數(shù)據(jù)結(jié)果。

1.3 Western blotting檢測(cè)

將3組細(xì)胞分別進(jìn)行Western blotting法檢測(cè)，將培養(yǎng)好的5-8F細(xì)胞放在兩塊干凈的玻璃平板之間離心后備用，將配制好的 聚丙烯酰胺分離膠液體并脫氣，然后放入10%的過硫酸銨和TEMED，輕輕攪拌混勻。按所需分離的蛋白質(zhì)分子大小選擇合適的丙烯酰胺百分比濃度，將以上兩種材料進(jìn)行充分混合后將分離好的5-8F細(xì)胞與混合液一起孵育30 min后進(jìn)行充分清洗，再將硝酸纖維素膜與5-8F細(xì)胞進(jìn)行混合后顯色。

1.4 MTT法檢測(cè)

將3組細(xì)胞分別進(jìn)行MTT法檢測(cè)，取凍存的5-8F細(xì)胞，按照10 000 r/min的離心速度進(jìn)行離心分離，每1 ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2 ml的氯仿，進(jìn)行裂解操作，4攝氏度冰上采用無酶的RNA沖洗液進(jìn)行洗滌，再次10 000 r/min離心5 min，得到RNA。將此RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后再培養(yǎng)以檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況。

1.5 Transwell 遷移侵襲試驗(yàn)

將3組細(xì)胞分別進(jìn)行Transwell 遷移侵襲試驗(yàn)，取凍存的5-8F細(xì)胞，按照20 000 r/min的離心速度進(jìn)行離心后應(yīng)用基質(zhì)膠鋪板后制備5-8F細(xì)胞懸液后檢測(cè)各組細(xì)胞遷移和侵襲情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞UBE2T蛋白表達(dá)比較

si-UBE2T組UBE2T蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于對(duì)照組和空白轉(zhuǎn)染組(P<0.05)；對(duì)照組和空白轉(zhuǎn)染組UBE2T蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1和圖1。

表1 各組UBE2T蛋白表達(dá)比較

注：a為與si-UBE2T組比較，P<0.05。

1為對(duì)照組；2為空白轉(zhuǎn)染組；3為si-UBE2T組。

2.2 各組細(xì)胞增殖情況比較

各組細(xì)胞培養(yǎng)開始時(shí)吸光度值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；si-UBE2T組培養(yǎng)第1 d、3 d和6 d吸光度值均低于對(duì)照組和空白轉(zhuǎn)染組(P<0.05)；對(duì)照組和空白轉(zhuǎn)染組培養(yǎng)第1 d、3 d和6 d吸光度值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 各組細(xì)胞增殖的吸光度值比較

注：a為與si-UBE2T組比較，P<0.05。

2.3 各組細(xì)胞遷移能力比較

si-UBE2T組細(xì)胞遷移率明顯低于對(duì)照組和空白轉(zhuǎn)染組(P<0.05)；對(duì)照組和空白轉(zhuǎn)染組細(xì)胞遷移率比較不具統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，(P>0.05)，見表3。

表3 各組細(xì)胞遷移能力比較

注：a為與si-UBE2T組比較，P<0.05。

2.4 各組細(xì)胞侵襲能力比較

si-UBE2T組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯低于對(duì)照組和空白轉(zhuǎn)染組(P<0.05)；對(duì)照組和空白轉(zhuǎn)染組穿膜細(xì)胞數(shù)比較不具統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見表4和圖2。

表4 各組穿膜細(xì)胞數(shù)比較

注：a為與si-UBE2T組比較，P<0.05。

1為對(duì)照組；2為空白轉(zhuǎn)染組；3為si-UBE2T組。

3 討論

鼻咽癌的病理病因目前認(rèn)為與3種因素有關(guān)，即遺傳因素、病毒因素(主要為EB病毒感染)和環(huán)境因素，對(duì)于鼻咽癌的治療臨床上方法很多但治療效果都不確切，本文主要從基因表達(dá)層面尋求鼻咽癌治療的新靶標(biāo)[5]。

UBE2T基因是1種近年來被發(fā)現(xiàn)的泛素偶聯(lián)蛋白酶，該基因所獨(dú)特的高表達(dá)性與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系[6]，UBE2T基因通過5-8F細(xì)胞的上皮間充質(zhì)胚胎轉(zhuǎn)化后在鼻咽癌的疾病進(jìn)程中起到癌基因的作用，UBE2T基因能通過抑制鼻咽癌抑癌基因的表達(dá)從而促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的增值、轉(zhuǎn)移和侵襲[7]。本研究證實(shí)UBE2T基因?qū)Ρ茄拾┘?xì)胞的干細(xì)胞特性具有調(diào)控作用，并且證明了UBE2T能夠經(jīng)特異性siRNA載體來調(diào)控鼻咽癌相關(guān)基因的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)其增強(qiáng)鼻咽癌干細(xì)胞特性的作用，因此在本研究中顯示，可以將UBE2T基因作為鼻咽癌靶向治療的分支基因靶點(diǎn)[8]，定位準(zhǔn)確，療效確切。

通過對(duì)UBE2T特異性siRNA載體的檢測(cè)5-8F細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力。采用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況，MTT法是1種檢測(cè)鼻咽癌細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法，在本研究中的檢測(cè)原理是5-8F細(xì)胞RNA中的琥珀酸脫氫酶，能使外源性MTT氧化還原為不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能[9]。當(dāng)細(xì)胞增值時(shí)并不影響藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚存在于5-8F細(xì)胞中的數(shù)量，會(huì)隨著細(xì)胞增值而分裂增多，伴隨在細(xì)胞質(zhì)中不斷裂解為更小的粒子，當(dāng)5-8F細(xì)胞增值趨向最大化完成時(shí)，二甲基亞砜(DMSO)能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活5-8F細(xì)胞增值的數(shù)量[10]。在細(xì)胞數(shù)量處于可控的范圍內(nèi)時(shí)MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正相關(guān)[11]。MTT法特點(diǎn)是靈敏度高、經(jīng)濟(jì)，對(duì)于測(cè)量出的細(xì)胞增值的數(shù)量數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。

采用Transwell檢測(cè)各組5-8F細(xì)胞遷移和侵襲，Transwell檢測(cè)實(shí)驗(yàn)是指將5-8F細(xì)胞放入培養(yǎng)板中，培養(yǎng)板中存在上下兩個(gè)小室，在本研究中上下兩個(gè)小室內(nèi)分別存有5-8F細(xì)胞上下兩層的層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔[12]。應(yīng)用此膜可將5-8F細(xì)胞從不同孔徑和經(jīng)過不同處理的聚碳酸酯膜進(jìn)行細(xì)胞遷移、侵襲的研究[13]。

本研究中還需應(yīng)用Western blotting法檢測(cè)各組細(xì)胞UBE2T蛋白表達(dá)，該方法是采用聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，被檢測(cè)物是5-8F細(xì)胞轉(zhuǎn)錄后的UBE2T基因蛋白[14]。經(jīng)過PCR擴(kuò)增分離后蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體如瓊脂膠體上，固相載體吸附蛋白質(zhì)后仍能保持電泳分離的UBE2T蛋白的表達(dá)基因的活性[15]。

本研究中表1顯示si-UBE2T組UBE2T蛋白相對(duì)表達(dá)量均值較低說明表達(dá)的基因產(chǎn)物與鼻咽癌的特異性較高。表2顯示si-UBE2T組培養(yǎng)數(shù)天后有較低的吸光度值，說明UBE2T基因表達(dá)后的有較多的5-8F細(xì)胞增值，表示鼻咽癌在此種基因的調(diào)控下可發(fā)生增值轉(zhuǎn)移至其他組織器官中甚至?xí)奂暗捷^多的淋巴細(xì)胞。表3顯示si-UBE2T組細(xì)胞遷移率在培養(yǎng)觀察數(shù)天后較低，說明對(duì)于鼻咽癌5-8F細(xì)胞有較高的遷移基因的表達(dá)性有像內(nèi)臟器官遷移的危險(xiǎn)。表4顯示si-UBE2T組穿膜細(xì)胞數(shù)較低，說明在鼻咽癌5-8F細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)后對(duì)周圍組織有較強(qiáng)的侵襲性。

本研究的創(chuàng)新性在于首創(chuàng)的利用UBE2T基因表達(dá)對(duì)鼻咽癌進(jìn)行靶向定位治療，可免去臨床上其他手術(shù)治療的繁瑣性和增強(qiáng)患者預(yù)后，細(xì)胞增值率、轉(zhuǎn)移率和侵襲周圍其他組織的概率大大降低，值得臨床其他難治性手術(shù)的借鑒。

綜上所述，UBE2T基因表達(dá)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力有影響，能夠通過UBE2T基因表達(dá)定向治療作為鼻咽癌分支靶向治療的靶標(biāo)。