李夢(mèng)雯， 呂亞莉， 徐國(guó)彤， 呂立夏

(1. 同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院再生醫(yī)學(xué)系生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，上海 200092; 2. 同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院眼科，上海 200072)

年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration, AMD)，也稱(chēng)老年性黃斑變性，是全世界老年人失明的主要原因之一[1]。視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelial, RPE)細(xì)胞的氧化損傷和慢性炎癥被認(rèn)為是AMD的發(fā)展過(guò)程中重要的影響因素[2-3]。應(yīng)激分子伴侶也稱(chēng)為HSPA13，是熱休克蛋白家族的一員，由鈣離子誘導(dǎo)[4]。活性氧類(lèi)(reactive oxygen species, ROS)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載，引發(fā)細(xì)胞凋亡[5-6]。

細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平升高誘導(dǎo)HSPA13基因的表達(dá)上升，因此，本研究探討HSPA13在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜上皮ARPE19細(xì)胞中的表達(dá)情況，以及HSPA13的表達(dá)水平對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的ARPE19細(xì)胞中相關(guān)氧化應(yīng)激指標(biāo)和促炎因子的影響；并在干擾HSPA13表達(dá)后進(jìn)行RNA測(cè)序，對(duì)差異表達(dá)的基因進(jìn)行基因本體(gene ontology, GO)分析及京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)信號(hào)通路分析，為進(jìn)一步探索HSPA13在AMD中的作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

DME/F12培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；鏈霉素及青霉素、CCK8試劑盒、丙二醛(malondialdehyd，MDA)試劑盒、還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天公司；3%H2O2購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；anti-HSPA13、anti-β-actin、二抗購(gòu)自Proteintech公司；TNF-α、IL-8、IL-2和IL-1β ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 使用DME/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加10%的胎牛血清和500μL的青霉素鏈霉素雙抗，在37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人ARPE19細(xì)胞。

1.2.2 CCK8法測(cè)定細(xì)胞活力的改變 實(shí)驗(yàn)前使用細(xì)胞培養(yǎng)基配制H2O2處理液，以2×104/mL的密度將ARPE19細(xì)胞接種在96孔板中，細(xì)胞貼壁后，分別添加含終濃度為10、25、50、100、200、300、400μmol/L H2O2的細(xì)胞培養(yǎng)基處理細(xì)胞，處理4h。將體積分?jǐn)?shù)為10%的CCK8工作液加入H2O2空白對(duì)照組(不含H2O2的細(xì)胞培養(yǎng)組)、各濃度H2O2處理組和只含培養(yǎng)基的無(wú)細(xì)胞對(duì)照組中，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱30min。隨后在450nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的光密度值(D450)。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 待200μmol/L H2O2處理4h，TRIzol裂解液收集總RNA，抽提RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction, qRT-PCR)檢測(cè)HSPA13和抗氧化酶[超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1, SOD1)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶1(glutathione peroxidase 1, GPX1)、過(guò)氧化氫酶(catalase, CAT)]的表達(dá)。各待測(cè)物引物序列如下。HSPA13 SOD1上游引物: 5′-TGTGGCCG-ATGTGTCTAT-TG-3′；下游引物: 5′-GCGTTTCC-TGTCTTTGTACTTTC-3′。GPX1上游引物: 5′-GACTACACCCAGATGAACGAG-3′；下游引物: 5′-GGACGT-ACTTGAGGGAATTCAG-3′。CAT上游引物: 5′-CAGATAGCCTTCGACCCAAG-3′；下游引物: 5′-GTAGGGACAGTTCACAGGTATATG-3′。β-actin上游引物: 5′-GAATCCCCGCCTAAGCTGA-3′；下游引物: 5′-AAGTTCGCGCTGGATAGGGCT-AC-3′。數(shù)據(jù)分析: 3次同樣處理，測(cè)得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以β-actin作為內(nèi)參基因，使用2-ΔΔCT方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 Western印跡法檢測(cè)HSPA13蛋白含量 200μmol/L H2O2處理4h，使用RIPA裂解液裂解細(xì)胞沉淀后，進(jìn)行BCA定量和蛋白變性。經(jīng)SDS-PAGE電泳后將蛋白轉(zhuǎn)到0.45μm的PVDF膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉1h，HSPA13一抗4℃孵育過(guò)夜，相應(yīng)種屬的二抗室溫孵育1h，ECL顯影采集蛋白條帶圖。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，使用Image J軟件進(jìn)行條帶分析，以β-actin作為內(nèi)參，對(duì)條帶的灰度值進(jìn)行半定量分析。

1.2.5 免疫熒光檢測(cè)HSPA13的表達(dá) 待200μmol/L H2O2處理4h，經(jīng)4%多聚甲醛固定、0.1%TritonX-100透膜和3%BSA封閉步驟之后，HSPA13一抗4℃冰箱過(guò)夜，二抗室溫孵育1h，DAPI染核封片，使用Nikon激光共聚焦顯微鏡，拍照分析HSPA13蛋白的表達(dá)。

1.2.6 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 根據(jù)LipofectamineTM3000說(shuō)明書(shū)將HSPA13過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(pEGFP-N2-HSPA13)或siRNA(siHSPA13)轉(zhuǎn)染到ARPE19細(xì)胞中。pEGFP-N2空載體作對(duì)照。pEGFP-N2-HSPA13上游引物: 5′-GTGATGCCCAGAGAGATGACGATC-3′；下游引物: 5′-TCAGTTGAAGTTGGTTTTTTGT-AAATG-3′。靶向GATCCCCGGCTGACGTCTTCC-ACGTC的HSPA13的小干擾RNA(siHSPA13)由拓然生物公司合成。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48h后，采用經(jīng)培養(yǎng)液稀釋的200μmol/L H2O2處理4h，進(jìn)行相關(guān)的檢測(cè)。

1.2.7 MDA和GSH含量測(cè)定及ROS檢測(cè) 根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，采用比色法檢測(cè)ARPE19細(xì)胞內(nèi)MDA、GSH的含量；采用DCF法測(cè)定ROS，用激光共聚焦顯微鏡Nikon A1R檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度。

1.2.8 ELISA檢測(cè)促炎因子的分泌 使用200μmol/L H2O2處理過(guò)表達(dá)或干擾HSPA13的ARPE19細(xì)胞4h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，分別根據(jù)TNF-α、IL-8、IL-2和IL-1β ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。

1.2.9 差異表達(dá)基因的基因本體與通路分析 將RNA測(cè)序得到的有效數(shù)據(jù)中空載組與HSPA13干擾組進(jìn)行比較，對(duì)差異倍數(shù)≥1.5并且P<0.05的基因使用數(shù)據(jù)庫(kù)(DAVID)進(jìn)行GO富集分析和KEGG分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度H2O2處理對(duì)ARPE19細(xì)胞活力的影響

為探討合適的H2O2處理濃度，使用不同的濃度處理細(xì)胞4h，進(jìn)行細(xì)胞活力檢測(cè)。CCK8法檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著H2O2處理濃度的上升，細(xì)胞活力降低。H2O2空白對(duì)照組及10、25、50、100、200、300、400μmol/L H2O2處理組的細(xì)胞活力分別為1.002±0.008991、0.9563±0.0427、0.9666±0.02949、0.8157±0.04948、0.7787±0.03957、0.6405±0.05403、0.4475±0.06583和0.2822±0.03536。100、200、300、400μmol/L的H2O2處理組與H2O2空白對(duì)照組相比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 氧化應(yīng)激誘導(dǎo)ARPE19細(xì)胞中HSPA13的表達(dá)上調(diào)

為模擬氧化損傷的自然條件，本研究后續(xù)均采用差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的200μmol/L的H2O2處理ARPE19細(xì)胞4h建立氧化損傷模型。收集H2O2空白對(duì)照組和200μmol/L H2O2處理組的ARPE19細(xì)胞，檢測(cè)HSPA13的表達(dá)變化。Western印跡法結(jié)果表明，與H2O2空白對(duì)照組相比，200μmol/L H2O2處理組HSPA13蛋白的表達(dá)上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0097，P=0.0152)。另外，采用免疫熒光方法在激光共聚焦顯微鏡下觀察HSPA13的表達(dá)與定位情況，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 HSPA13在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的ARPE19細(xì)胞中表達(dá)上升Fig.1 The expression of HSPA13 was increased in oxidative stress-induced ARPE19 cells A: HSPA13蛋白的表達(dá)水平；B: 細(xì)胞免疫熒光(標(biāo)尺: 50μm)；實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次

2.3 CCK8法檢測(cè)HSPA13的表達(dá)水平對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞活力的影響

ARPE19細(xì)胞受到氧化刺激后，HSPA13的表達(dá)上調(diào)。為了明確HSPA13的表達(dá)水平對(duì)氧化應(yīng)激狀態(tài)下細(xì)胞活力的影響，分別過(guò)表達(dá)或干擾HSPA13，200μmol/L H2O2處理后，CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活力。CCK8法結(jié)果顯示，H2O2空白對(duì)照組、200μmol/L H2O2處理組、過(guò)表達(dá)HSPA13加200μmol/L H2O2處理組和siHSPA13加200μmol/L H2O2處理組的細(xì)胞活力分別為1.145±0.0472、0.593±0.0319、0.808±0.0428、0.394±0.0492。因此，這一結(jié)果提示HSPA13的表達(dá)水平可能在ARPE19的氧化應(yīng)激中發(fā)揮保護(hù)作用。

2.4 HSPA13的表達(dá)水平對(duì)ARPE19細(xì)胞內(nèi)SOD1、GPX1和CAT mRNA的影響

空載體200μmol/L H2O2處理組(Vector+H2O2)的ARPE19細(xì)胞中SOD1、GPX1和CAT的mRNA的表達(dá)均顯著降低，與空載體對(duì)照組(Vector)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與空載體200μmol/L H2O2處理組相比，過(guò)表達(dá)HSPA13加200μmol/L H2O2處理組(HSPA13+H2O2)中SOD1和GPX1的mRNA表達(dá)上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2A～D。相反地，與單獨(dú)200μmol/L H2O2處理組相比，siHSPA13加200μmol/L H2O2處理組中SOD1、GPX1和CAT的mRNA表達(dá)均降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2E～H。

圖2 HSPA13的表達(dá)水平對(duì)ARPE19細(xì)胞內(nèi)SOD1、GPX1和CAT mRNA的影響Fig.2 Effect of the expression level of HSPA13 on SOD1, GPX1 and CAT mRNA in ARPE19 cells A～D： HSPA13過(guò)表達(dá)；E～F： HSPA13被干擾；實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次；*P<0.05；**P<0.01

2.5 HSPA13的表達(dá)水平對(duì)ARPE19細(xì)胞內(nèi)MDA、GSH含量的影響

200μmol/L H2O2處理4h后，MDA的含量顯著上升(P<0.05)，GSH含量顯著下降(P<0.05)；與空載體200μmol/L H2O2處理組相比，HSPA13過(guò)表達(dá)加200μmol/L H2O2處理4h后，MDA含量降低(P<0.05)，GSH含量上升(P<0.05)；相反地，與200μmol/L H2O2處理組相比，siHSPA13加200μmol/L H2O2處理組的MDA含量上升，GSH含量下降，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

圖3 HSPA13的表達(dá)水平對(duì)ARPE19細(xì)胞內(nèi)MDA和GSH含量的影響Fig.3 Effect of the expression level of HSPA13 on MDA and GSH content in ARPE19 cells 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001

2.6 HSPA13的表達(dá)水平對(duì)ARPE19細(xì)胞內(nèi)促炎因子分泌的影響

細(xì)胞遭受氧化損傷后可引發(fā)一系列炎癥反應(yīng)，其中包括促炎因子的分泌。200μmol/L H2O2處理過(guò)表達(dá)或干擾HSPA13的ARPE19細(xì)胞4h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)基上清液檢測(cè)TNF-α、IL-8、IL-2和IL-1β的含量。與空載體對(duì)照組相比，空載體200μmol/L H2O2處理組中TNF-α、IL-8、IL-2和IL-1β的含量均上升，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與空載體200μmol/L H2O2處理組相比，過(guò)表達(dá)HSPA13加200μmol/L H2O2處理組中IL-8、IL-2和IL-1β的含量下降，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖4A～D。相反地，與200μmol/L H2O2處理組相比，siHSPA13加200μmol/L H2O2處理組中TNFα、IL-8、IL-2和IL-1β的含量均上升，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖4E～H。

圖4 HSPA13的表達(dá)水平對(duì)ARPE19細(xì)胞內(nèi)促炎因子分泌的影響Fig.4 Effect of the expression level of HSPA13 on the secretion of related-proinflammatory cytokines in ARPE19 cellsA～D： HSPA13過(guò)表達(dá)；E～F： HSPA13被干擾；實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001

2.7 干擾HSPA13的表達(dá)增加氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的ARPE19細(xì)胞中ROS的水平

ROS常被用作判定細(xì)胞水平氧化損傷程度的指標(biāo)[7]。與H2O2空白對(duì)照組相比，200μmol/L H2O2處理組的DCF熒光信號(hào)明顯增強(qiáng)；與200μmol/L H2O2處理組相比，siHSPA13加200μmol/L H2O2處理組DCF熒光信號(hào)顯著增強(qiáng)，見(jiàn)圖5。結(jié)果表明，ARPE19細(xì)胞內(nèi)HSPA13的水平影響氧化應(yīng)激狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生。

2.8 基因芯片檢測(cè)兩組之間差異表達(dá)的基因

提取空載組和HSPA13干擾組的總RNA進(jìn)行RNA測(cè)序分析，共檢測(cè)到18660個(gè)基因。其中包括HSPA13基因的表達(dá)差異，差異倍數(shù)約為1.33。為了獲得精準(zhǔn)的基因GO富集分析和KEGG信號(hào)通路分析結(jié)果，只將RNA測(cè)序結(jié)果中差異倍數(shù)≥1.5且差異表達(dá)(P<0.05)的基因使用DAVID進(jìn)行分析，因此HSPA13沒(méi)有被篩選進(jìn)入后續(xù)分析步驟。根據(jù)設(shè)定的前提條件進(jìn)行篩選后發(fā)現(xiàn)，差異倍數(shù)≥1.5且P<0.05的差異表達(dá)的基因有318個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)的有64個(gè)，下調(diào)的有254個(gè)，對(duì)這些差異表達(dá)的基因進(jìn)行GO富集和KEGG分析。

2.9 差異基因的GO功能分析

通過(guò)GO分析，可以將差異表達(dá)的基因根據(jù)功能分為生物過(guò)程(biological process)、細(xì)胞組分(cellular component)和分子功能(molecular function)3類(lèi)。表達(dá)上調(diào)的基因分為細(xì)胞外空間、細(xì)胞因子活性和光刺激的感覺(jué)知覺(jué)類(lèi)，表達(dá)下調(diào)的基因分為骨骼系統(tǒng)發(fā)展、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞黏附和腫瘤壞死因子細(xì)胞應(yīng)答類(lèi)，見(jiàn)圖6。

圖5 干擾HSPA13的表達(dá)增加氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的ARPE19細(xì)胞中ROS的水平(標(biāo)尺: 50μm)Fig.5 Knockdown of HSPA13 expression increased oxidative stress-induced levels of ROS in ARPE19 cells(scale： 50μm)

圖6 差異基因的GO富集分析Fig.6 GO enrichment analysis of differentially expressed genes

2.10 差異基因的KEGG信號(hào)通路分析

對(duì)差異基因進(jìn)行KEGG分析，結(jié)果表明共有8條信號(hào)通路與下調(diào)基因相關(guān)(均P<0.05)，見(jiàn)表1。下調(diào)基因的KEGG信號(hào)通路分析結(jié)果顯示多條信號(hào)通路發(fā)生下調(diào)，如ECM-受體相互作用(ECM-receptor interaction)、PI3K-Akt信號(hào)通路(PI3K-Akt signaling pathway)、黏著斑(focal adhesion)、TGF-β信號(hào)通路(TGF-β signaling pathway)和細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用(cytokine-cytokine receptor interaction)。

表1 下調(diào)基因的KEGG相關(guān)信號(hào)通路分析

3 討 論

AMD是發(fā)達(dá)國(guó)家老年人視力喪失的主要原因，但這種復(fù)雜疾病的發(fā)病機(jī)制尚不明確[8]。目前研究證據(jù)表明氧化應(yīng)激和慢性炎癥在年齡相關(guān)的RPE細(xì)胞損傷中發(fā)揮重要作用[9-10]。RPE細(xì)胞遭受長(zhǎng)期氧化刺激導(dǎo)致DNA損傷，細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，細(xì)胞功能被破壞[11]。細(xì)胞遭受氧化損傷可引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子內(nèi)流，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，導(dǎo)致細(xì)胞鈣超載[12-13]。

HSPA13作為熱休克蛋白70家族中重要的一員被克隆并明確定位于人類(lèi)染色體21q11.1[14]。該基因編碼一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為60000的蛋白，亞細(xì)胞定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，其編碼的蛋白N端含有特殊前導(dǎo)疏水序列，這種特殊的結(jié)構(gòu)導(dǎo)致它與其他熱休克蛋白不同的是HSPA13受鈣離子誘導(dǎo)，對(duì)熱刺激無(wú)反應(yīng)[15]。在鱗狀頭頸癌中，在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)的蛋白BAK1、HSPA13和CCND1表達(dá)降低在很大程度上可以抑制腫瘤的發(fā)生[16]。此外，HSPA13還與神經(jīng)退行性疾病如阿爾茲海默癥、癲癇等有關(guān)[17-18]。日本科學(xué)家發(fā)現(xiàn)HSPA13在體外過(guò)表達(dá)通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡通路來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞的存活率[19]。目前，HSPA13在AMD中的作用尚未有相關(guān)報(bào)道。因此，根據(jù)HSPA13的特殊性，本研究推測(cè)HSPA13可能參與了鈣離子介導(dǎo)的RPE細(xì)胞的氧化應(yīng)激過(guò)程。HSPA13是細(xì)胞內(nèi)鈣離子依賴(lài)性蛋白，RPE細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)下，細(xì)胞鈣超載，可上調(diào)HSPA13的表達(dá)。

本研究結(jié)果表明，200μmol/L H2O2處理4h引起ARPE19細(xì)胞中HSPA13的表達(dá)上升。發(fā)現(xiàn)在ARPE19細(xì)胞中過(guò)表達(dá)HSPA13能夠減弱H2O2誘導(dǎo)的促炎因子的釋放并上調(diào)抗氧化酶的表達(dá)，提高GSH的細(xì)胞內(nèi)含量，保護(hù)細(xì)胞活力，提示HSPA13可能在AMD的發(fā)生發(fā)展中有一定的作用。與預(yù)期一致，HSPA13被干擾后轉(zhuǎn)染ARPE19細(xì)胞，ROS產(chǎn)生增加，加劇了RPE細(xì)胞的氧化損傷。

為了更全面了解HSPA13在ARPE19氧化應(yīng)激中的作用機(jī)制，本研究收集空載體組和HSPA13被干擾組的ARPE19細(xì)胞進(jìn)行RNA測(cè)序分析，結(jié)果顯示有318個(gè)基因有顯著的表達(dá)差異。KEGG信號(hào)通路分析發(fā)現(xiàn)，與空載組相比，HSPA13被干擾組有8條信號(hào)通路參與其中。其中包括PI3K-Akt通路、細(xì)胞因子相關(guān)受體通路、TGFβ信號(hào)通路、ECM受體相互作用等。PI3K-Akt信號(hào)通路參與多種細(xì)胞生存與代謝過(guò)程[20-21]。有研究表明，PI3K-Akt通路在氧化應(yīng)激中發(fā)揮重要作用，在AMD體外氧化應(yīng)激模型中，Akt磷酸化的增強(qiáng)可以保護(hù)RPE細(xì)胞免受氧化損傷觸發(fā)的細(xì)胞凋亡和壞死[22]。

KEGG分析表明，HSPA13干擾組中ECM受體相互作用下調(diào)。ECM參與細(xì)胞的分裂、增殖、代謝以及凋亡等多種細(xì)胞生命活動(dòng)，為細(xì)胞存活和代謝的正常進(jìn)行提供穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境[23]。之前研究證實(shí)，ECM的異常與AMD的形成有關(guān)[24-25]。GO分析發(fā)現(xiàn)，ECM相關(guān)信號(hào)通路的基因LAMA4、COL4A1、BMPER、TENM2、COL1A1、MAMDC2、ITGB3、ZNF469和THBS1的表達(dá)均降低，這提示HSPA13影響RPE細(xì)胞的ECM，參與氧化應(yīng)激過(guò)程中ECM的調(diào)節(jié)。另外，KEGG分析還可以發(fā)現(xiàn)，HSPA13干擾組中細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用通路下調(diào)，該通路在AMD模型的炎癥反應(yīng)研究中發(fā)揮重要作用[26]。因此，對(duì)于RNA測(cè)序信號(hào)通路結(jié)果的進(jìn)一步驗(yàn)證是后續(xù)的研究方向。

綜上所述，外源性H2O2可以誘導(dǎo)ARPE19細(xì)胞中鈣應(yīng)激蛋白HSPA13的表達(dá)上升，過(guò)表達(dá)HSPA13能夠減少促炎因子的釋放，提高抗氧化酶的表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)GSH水平，提示HSPA13對(duì)ARPE19細(xì)胞氧化應(yīng)激的保護(hù)作用。本研究從分子水平解析AMD的發(fā)病機(jī)制，為尋找AMD新的治療靶點(diǎn)提供有益的線索。