秦紹釗，洪之國(guó)，王建偉

（1.凱里學(xué)院；2.黔東南州農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)中心，貴州凱里 556011）

油茶（Camellia oleifera Abel），是山茶科（Theaceae）山茶屬（Camellia），油茶是世界四大木本食用油料植物之一[1]，為貴州地區(qū)的鄉(xiāng)土樹(shù)種，栽培歷史悠久，種植區(qū)廣泛，主要分布在黔東南州、銅仁市、黔西南州、畢節(jié)市等地區(qū)，山區(qū)群眾具有豐富的油茶種植經(jīng)驗(yàn)。截至2018年種植面積達(dá)263.4萬(wàn)畝，隨著油茶種植面積的擴(kuò)大和良種使用率的提高，貴州油茶的病害問(wèn)題日趨嚴(yán)重。油茶炭疽病主要危害油茶的葉、果實(shí)及枝梢，造成重大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。

油茶炭疽病發(fā)病的區(qū)域經(jīng)田間調(diào)查觀(guān)察，結(jié)合前期研究和的報(bào)道[3,4]。熊朝偉等，2019報(bào)道玉屏油茶炭疽病為Colletotrichum camelliae[5]。本研究所鑒定的油茶炭疽病松針刺盤(pán)孢菌（Colletotrichum fioriniae）在貴州油茶病害研究中未見(jiàn)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料

2015-2018年采集病葉片于黔東南州天柱縣、錦屏縣及黃平縣；銅仁市玉屏縣、江口縣及松桃縣，分別集中于在6-7月，10-11月采集病樣，典型病征（如圖1-1）。病斑多為梯半圓形、不規(guī)則形，多為半葉型；病斑顏色為黃褐色，病斑部位薄且脆，密生小黑點(diǎn)或凸起，4℃保藏帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原菌分離試驗(yàn)。

圖1-1 油茶炭疽病病葉

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離純化

常規(guī)組織分離法：先用75%的酒精處理病健交界的組織，0.1%升汞溶液消毒，無(wú)菌水漂洗干凈，PDA培養(yǎng)基純化培養(yǎng)，置于4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病原菌的形態(tài)鑒定

取5mm菌餅，在PDA平板26-28℃黑暗16h培養(yǎng)，2-5d連續(xù)觀(guān)察菌落的形態(tài)、顏色。取10μL分生孢子懸浮液在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察記錄其大小及形態(tài)特征。

1.2.3 分子鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析

取20 mg菌絲經(jīng)液氮研磨，樣品DNA提取用生工生物工程（上海）股份有限公司的試劑盒，Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒SK8259。擴(kuò)增引物如下：GpF：5’ATGTGCA AGGCCGGTTTCGC3’，GpR 5’TACGAGTCCTTCTGGCCC AT3’；ACTF5’GCCGTCAACGA CCCCTTCATTGA 3’，ACTR5’GGGTGGAGTCGTACTTGAGCATGT3’。

將測(cè)序rDNA-ACT和rDNA-GADPH序列與GenBank中下載的相關(guān)參考序列分別用ClustalX1.83軟件進(jìn)行比對(duì)分析。在多基因系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果中選出與各分離菌株相似度較高的相應(yīng)序列，將所選序列與Gen-Bank中炭疽菌相應(yīng)基因序列采用MEGA7.0.14軟件中的鄰接法（neighbor-joining，NJ）做聚類(lèi)分析，堿基序列間的空缺（Gaps）作為堿基缺失處理；把所有的堿基狀態(tài)處理為無(wú)序，并給以相同的權(quán)重。自舉檢驗(yàn)（bootstraping）重復(fù)1000次以獲得各分支的支持率，構(gòu)建鄰近法（NJ）系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌菌落與形態(tài)特征

PDA培養(yǎng)基上菌落直徑為8.4-8.9cm，菌落邊緣整齊，輻射狀，氣生菌絲濃密，菌絲白色，呈疏松絨氈狀，中央為灰色至灰綠色，邊緣為白色（如圖2-1 A），菌落反面為深灰色至白色（如圖2-1B）。分生孢子橢圓、細(xì)長(zhǎng)梭形、短梭形；無(wú)色、無(wú)油球；表面光滑；4.8～19.8×2.7～3.9μm（如圖2-2）。

Colletotrichum fioriniae首先被認(rèn)為是尖孢炭疽菌（C.acutatum）的變種（C.acutata var.fioriniae）。本研究分離的代表菌株KLXYL-1-4的菌落形態(tài)、分生孢子形態(tài)與文獻(xiàn)描述一致，初步確認(rèn)菌株KLXYL-1-4為Colletotrichum fioriniae(Marcelino&Gouli)R.G.Shivas&Y.P.Tan Fungal Diversity 39:117(2010)。

圖2-1 KLXYL-1-4培養(yǎng)基的菌落（A正面，B反面）

圖2-2 KLXYL-1-4的分生孢子

2.2 分子鑒定

本研究5個(gè)分離菌DNA為模板，對(duì)其肌動(dòng)蛋白基因（ACT）和3-磷酸甘油醛脫氫酶基因（GAPDH）進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序。NCBIBlastn比對(duì)后，確定5個(gè)菌株同屬于炭疽菌屬松針刺盤(pán)孢菌，與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致。

代表菌株KLXYL-1-4的ACT和GADPH基因序列與其它同屬菌株序列經(jīng)鄰接法（neighbor-joining，NJ）共同構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中，KLXYL-1-4菌分別與松針刺盤(pán)孢菌（C.fioriniae）菌株KY986902.1和KF944354.1聚為一個(gè)獨(dú)立的進(jìn)化枝，親緣關(guān)系置信度高達(dá)99%，能與同屬其它菌株明顯區(qū)分開(kāi)。因此，根據(jù)分離所得鑒定結(jié)果將KLXYL-1-4菌株鑒定為C.fioriniae。

3 結(jié)論與討論

本文通過(guò)擴(kuò)增KLXYL-1-4炭疽菌的ACT-GADPH序列，與GenBank中同屬其他菌株序列比對(duì)分析，聚類(lèi)分析結(jié)果顯示，KLXYL-1-4株炭疽菌形成2個(gè)大的聚類(lèi)群。在對(duì)菌株間的序列比較中，炭疽菌菌株間的序列同源性較高，但仍存在堿基的缺失和插入等堿基變異情況。

本研究分離得到的炭疽菌KLXYL-1-4，采用ACT-GADPH2個(gè)基因分子學(xué)鑒定，再結(jié)合形態(tài)學(xué)，確定KLXYL-1-4菌為松針刺盤(pán)孢菌（C.fioriniae），是貴州油茶上發(fā)現(xiàn)的炭疽病菌新種，增加了對(duì)貴州油茶主要栽培區(qū)炭疽病菌的了解，為進(jìn)一步鑒定油茶炭疽病原提供了理論基礎(chǔ)。