沈燕燕，黃 亮，晏 立，吳曉蓉，邵 毅，梅 鋒

0引言

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是2型糖尿病(diabetes mellitus，T2DM)最常見和最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一[1]。許多研究已經(jīng)證明炎癥反應(yīng)在T2DM患者微血管病變的發(fā)生中起著關(guān)鍵作用[2-3]。地塞米松具有抗炎作用，其已在眼科臨床中用于治療DR[4-5]。全身使用糖皮質(zhì)激素可導(dǎo)致T2DM患者出現(xiàn)血糖(blood sugar，BS)升高、消化性潰瘍及骨質(zhì)疏松等一系列副作用[6]，局部使用糖皮質(zhì)激素也可導(dǎo)致血糖升高[7]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)眼局部注射地塞米松可使血糖升高[8]。眼部地塞米松常用給藥途徑包括局部點(diǎn)眼、眼周注射、玻璃體腔注射。局部點(diǎn)眼由于滴眼液在眼表面常被快速引流，同時受到淚膜、角膜、結(jié)膜上皮屏障的阻擋，造成藥物吸收時間短、局部濃度低、生物利用率低[9]，效果持續(xù)時間短，從而無法到達(dá)眼后節(jié)發(fā)揮治療作用。玻璃體腔注射易出現(xiàn)眼內(nèi)炎癥、孔源性視網(wǎng)膜脫離、眼壓升高、眼部出血等并發(fā)癥[10]。眼周注射在結(jié)膜或筋膜組織下注射的藥物有效地繞過了表面的淚膜和結(jié)膜屏障，且能夠在組織層之間的潛在空間內(nèi)留下大量的藥物并將藥物運(yùn)送到后段，是較為理想的給藥途徑。為此，本研究通過結(jié)膜下、球旁、球后注射三種途徑注射地塞米松，觀察三種途徑注射后對T2DM大鼠房水藥物濃度和血糖的影響，以期為臨床更好地使用地塞米松提供思路。

圖1地塞米松磷酸鈉和潑尼松質(zhì)譜檢測質(zhì)荷比A：地塞米松磷酸鈉；B：潑尼松。

1材料和方法

1.1材料實(shí)驗(yàn)動物：清潔級4周齡SD雄性幼鼠240只，體質(zhì)量180～220g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供[SCXK(湘)2016-0002]，自由攝食飲水，自然光照，保持安靜，室溫26℃，分籠飼養(yǎng)。主要試劑：鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ，美國SCE公司)，地塞米松磷酸鈉注射液(河南潤弘制藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H41020327)，地塞米松磷酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品(批號C101069215，中國食品藥品檢定研究院)，潑尼松(批號C10016502，中國食品藥品檢定研究院)，甲醇和乙腈為分析純。主要儀器設(shè)備：血糖監(jiān)測儀(江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司)，液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀(LCMS-2010EV，日本島津)。本研究符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)且得到我院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1 T2DM大鼠模型建立SD大鼠(n=240)普通飼料(碳水化合物60%、蛋白質(zhì)22%、脂肪10%、其它8%，由南昌大學(xué)動物科學(xué)部提供)適應(yīng)性喂食1wk，然后高糖高脂飼料(蛋白質(zhì)19.8%、碳水化合35.2%、脂肪45.0%，由北京博泰宏達(dá)生物有限公司提供)喂養(yǎng)6wk，禁食24h，腹腔注射亞致病劑量STZ(按30mg/kg劑量給藥，STZ臨用前以pH4.2，0.01mmol/L枸櫞酸緩沖液配成30g/L濃度，置于冰浴上操作)，間隔2d再注射1次，第2次注射STZ 72h后，血糖濃度>16.7mmol/L者即為T2DM大鼠模型。本研究中2次STZ腹腔注射后，192只SD大鼠血糖濃度明顯升高(25.22±7.78mmol/L)，且出現(xiàn)緩慢的消瘦、飲食大幅增多，24h尿量明顯增多，部分大鼠出現(xiàn)爛尾現(xiàn)象，具有糖尿病典型的“三多一少”臨床表現(xiàn)，說明T2DM大鼠模型建立成功。

1.2.2動物分組和藥物處理將造模成功的T2DM大鼠(n=192)隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(n=96，注射地塞米松)和對照組(n=96，注射生理鹽水)，每組T2DM大鼠根據(jù)給藥途徑不同隨機(jī)分為3個亞組，即球旁注射組、球后注射組、結(jié)膜下注射組，每個亞組T2DM大鼠32只，其中24只用于房水藥物濃度測量，8只用于血糖濃度測量。禁食不禁水12h后，T2DM大鼠左下腹腔乙醇消毒后，腹腔注射10%水合氯醛無菌溶液(0.3mL/100g)麻醉。實(shí)驗(yàn)組大鼠根據(jù)分組給予地塞米松磷酸鈉注射液0.1mL[11]，對照組大鼠根據(jù)分組給予生理鹽水0.1mL。

1.2.3血糖濃度測定注射開始后大鼠禁食不禁水，每個亞組隨機(jī)選取大鼠8只，每只大鼠分別于注射0、2、4、8、12、24h連續(xù)尾靜脈穿刺采血，測定血糖濃度(試紙法)。

其次是理解信息。理解信息是在通讀全文后，針對某一句話，放入語境中理解語義，這也需要對專業(yè)術(shù)語有深入了解，需要翻譯者有較強(qiáng)的英語思維，跨越文化差異帶來的影響，將特定情境下的語義正確的表達(dá)出來。

1.2.4房水地塞米松濃度測定

1.2.4.1房水采集注射開始后0.5、2、4、8、12、24h，每個亞組分別隨機(jī)選取4只大鼠并取雙眼房水樣本。取樣時，予10%水合氯醛無菌溶液(0.3mL/100g)腹腔注射進(jìn)行麻醉，0.9%生理鹽水沖洗雙眼，清潔無菌紗布吸干，顯微注射器刺入前房抽取房水25μL。所有樣本置于-20℃冰箱中冷凍保存，待測。

1.2.4.2樣本處理精密吸取15μL房水于1.5mL離心管中，加入5μL潑尼松溶液(內(nèi)標(biāo)物，1600ng/mL)、5μL地塞米松磷酸鈉和60μL乙腈，渦旋7min，于5000r/min離心10min，精密量取上清液20μL注入高效液相色譜儀分析，記錄峰面積，計算房水中地塞米松濃度。

1.2.4.3質(zhì)譜條件離子化方式：電噴霧離子化(ESI)；掃描方式：選擇性負(fù)離子監(jiān)測(SIM)；加熱塊溫度(block)：200℃；曲型脫溶劑裝置溫度(CDL)：250℃；CDL電壓：250V；檢測電壓：1.85kV；霧化氣流速：1.5L/min；干燥氣流速：2.0L/min；質(zhì)荷比：[M-H]-地塞米松磷酸鈉m/z=471，內(nèi)標(biāo)潑尼松m/z=455，見圖1。

1.2.4.4標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制取地塞米松磷酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品制備濃度為100、200、400、800、1600、3200、6400ng/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液，取15μL空白房水(正常大鼠房水)于1.5mL的離心管中，精密加入5μL潑尼松溶液(內(nèi)標(biāo)物，1600ng/mL)、5μL標(biāo)準(zhǔn)工作液和60μL乙腈，配制成質(zhì)量濃度為25、50、100、200、400、800、1600ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)含地塞米松房水樣品，根據(jù)1.2.4.3進(jìn)行操作，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。每個濃度重復(fù)5次。分別以空白房水中地塞米松磷酸鈉的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以地塞米松磷酸鈉與內(nèi)標(biāo)的峰面積比為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=0.0009728X+0.0021639，R2=0.9995715，R=0.9997857。地塞米松在25.0～1600.0μg/mL時線性關(guān)系良好。

表1 注藥前后各組T2DM大鼠血糖濃度

注：aP<0.05vs同組0h；cP<0.05vs同組2h；eP<0.05vs同組4h；gP<0.05vs同組8h；iP<0.05vs同組12h。

圖2不同途徑注藥對T2DM大鼠血糖濃度的影響A：不同途徑注射地塞米磷酸鈉對T2DM大鼠血糖的影響；B：不同途徑注射生理鹽水對T2DM大鼠血糖的影響。

1.2.4.5系統(tǒng)適用性試驗(yàn)(1)精密度試驗(yàn)：取地塞米松磷酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品制備質(zhì)量濃度為1000、2000、4000、6000ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，根據(jù)1.2.4.2樣本處理方法進(jìn)行樣本處理，根據(jù)1.2.4.3進(jìn)樣分析，每個濃度重復(fù)5次，計算日內(nèi)精密度。樣品置于-20℃冰箱中保存連續(xù)5d進(jìn)樣，每個濃度重復(fù)3次，計算日間精密度。日內(nèi)精密度、日間精密度均小于5%，符合實(shí)驗(yàn)要求。(2)回收率試驗(yàn)：取地塞米松磷酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品制備質(zhì)量濃度為1000、2000、4000、6000ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。根據(jù)1.2.4.2樣本處理方法進(jìn)行樣本處理，根據(jù)1.2.4.3進(jìn)樣分析，每個濃度重復(fù)5次，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算樣品檢出量，方法回收率=樣品檢出量/樣品加入量。方法回收率均大于90%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)均小于5%，符合實(shí)驗(yàn)要求。(3)穩(wěn)定性試驗(yàn)：取地塞米松磷酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品，分別于0、1、2、4、6、8、12、16、20、24h時進(jìn)樣20μL，測定地塞米松峰面積，計算RSD。RSD<2%(n=10)，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。(4)重復(fù)性試驗(yàn)：平行精密吸取5份地塞米松磷酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品，每份5.0mL，置于10mL容量瓶中，根據(jù)1.2.4.2樣本處理方法進(jìn)行樣本處理，根據(jù)1.2.4.3進(jìn)樣分析，測定地塞米松峰面積值，計算RSD。RSD<2%(n=5)，表明方法重復(fù)性良好。

1.2.4.6房水地塞米松濃度測定取待測各組T2DM大鼠雙眼房水樣品，根據(jù)1.2.4.2樣本處理方法進(jìn)行樣本處理，根據(jù)1.2.4.3進(jìn)樣分析，記錄峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算房水中地塞米松濃度。

2結(jié)果

2.1不同途徑注藥對T2DM大鼠血糖濃度的影響不同途徑注射地塞米松磷酸鈉前后，各組大鼠血糖濃度時間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F時間=386.419，P時間<0.001)，但組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F組間=0.151，P組間=0.861)，時間和組間交互作用差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義(F時間×組間=1.286，P時間×組間=0.276)。三種途徑注藥后2、4、8、24h大鼠血糖濃度與其注藥前(0h)比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1，圖2A。

不同途徑注射生理鹽水前后，各組大鼠血糖濃度時間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F時間=394.157，P時間<0.001)，組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F組間=0.12，P組間=0.888)，時間和組間交互作用差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義(F時間×組間=2.311，P時間×組間=0.057)。球旁注射組T2DM大鼠注藥后2、4、8、12、24h，球后注射組和結(jié)膜下注射組大鼠注藥后2、4、12、24h血糖濃度與其注藥前(0h)比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1，圖2B。

注藥途徑組別0.5h2h4h8h12h24h球旁注射實(shí)驗(yàn)組108.88±4.18189.63±4.25732.38±4.56109.39±4.9346.88±2.2632.76±2.19對照組31.88±2.3238.08±2.0943.80±1.7340.66±1.6939.64±2.0031.03±1.96 t32.20564.043282.39826.3764.7941.18P<0.001<0.001<0.001<0.0010.0030.283球后注射實(shí)驗(yàn)組114.63±5.30183.22±0.79859.60±3.56112.72±5.8936.18±1.9137.63±2.14對照組32.83±0.9740.29±1.3641.29±2.0540.50±1.5041.30±2.4035.45±3.84 t30.357181.92398.3123.78-3.3380.988P<0.001<0.001<0.001<0.0010.0160.371結(jié)膜下注射實(shí)驗(yàn)組143.45±0.94957.34±3.60435.75±2.01143.98±7.8164.03±1.7334.31±2.11對照組34.15±2.2539.50±0.9743.16±2.1443.03±2.3042.13±3.9730.01±1.66 t89.661492.566267.52124.80310.1243.206P<0.001<0.001<0.001<0.001<0.0010.018

組別0.5h2h4h8h12h24h球旁注射組108.88±4.18a189.63±4.25a732.38±4.56a,c109.39±4.93a46.88±2.26a,c32.76±2.19c球后注射組114.63±5.30a183.22±0.79a859.60±3.56112.72±5.89a36.18±1.91a37.63±2.14結(jié)膜下注射組143.45±0.94957.34±3.60435.75±2.01c143.98±7.8164.03±1.7334.31±2.11 F88.56175248.76215127.27636.454201.0655.361P<0.001<0.001<0.001<0.001<0.0010.029

注：aP<0.05vs同時間結(jié)膜下注射組；cP<0.05vs同時間球后注射組。

2.2不同途徑注藥對T2DM大鼠雙眼房水地塞米松濃度的影響球旁注射地塞米松磷酸鈉/生理鹽水后4h，實(shí)驗(yàn)組大鼠雙眼房水地塞米松濃度達(dá)到峰值(732.38±4.56ng/mL)，注射后0.5～12h，兩組大鼠雙眼房水地塞米松濃度差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；球后注射地塞米松磷酸鈉/生理鹽水后4h，實(shí)驗(yàn)組大鼠雙眼房水地塞米松濃度達(dá)到峰值(859.60±3.56ng/mL)，注射后0.5～12h，兩組大鼠雙眼房水地塞米松藥物濃度差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；結(jié)膜下注射地塞米松磷酸鈉/生理鹽水后2h，實(shí)驗(yàn)組大鼠雙眼房水地塞米松濃度達(dá)到峰值(957.34±3.60ng/mL)，注射后0.5～24h，兩組大鼠雙眼房水地塞米松藥物濃度差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

注射地塞米松磷酸鈉后0.5～24h，球旁注射組、球后注射組、結(jié)膜下注射組大鼠雙眼房水地塞米松濃度差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。注射后0.5、2、8h，球旁注射組和球后注射組大鼠雙眼房水地塞米松濃度均低于結(jié)膜下注射組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。注射后4h，球旁注射組和結(jié)膜下注射組大鼠雙眼房水地塞米松濃度均低于球后注射組，且結(jié)膜下注射組低于球旁注射組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。注射后12h，球旁注射組和球后注射組大鼠雙眼房水地塞米松濃度均低于結(jié)膜下注射組，且球后注射組低于球旁注射組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。注射后24h，球旁注射組大鼠雙眼房水地塞米松濃度低于球后注射組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3討論

本研究發(fā)現(xiàn)，三種不同途徑注射地塞米松磷酸鈉或生理鹽水后2h時，大鼠血糖濃度均有一過性升高，分析認(rèn)為，當(dāng)機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)時，下丘腦-垂體-腎上腺軸和交感神經(jīng)腎上腺系統(tǒng)激活，機(jī)體釋放兒茶酚胺、皮質(zhì)醇、生長激素、胰高糖素等分解代謝激素，這些激素直接刺激糖原分解、糖原異生，升高血中葡萄糖[12]。由于STZ的作用，大鼠胰島B細(xì)胞壞死[13]，導(dǎo)致胰島B細(xì)胞功能缺陷，無法對血糖進(jìn)行有效調(diào)控，導(dǎo)致血糖升高[14]。Zhang等[15]研究發(fā)現(xiàn)，玻璃體視網(wǎng)膜手術(shù)后T2DM患者眼周注射地塞米松后血糖升高，汪彬等[16]研究發(fā)現(xiàn)1型糖尿病大鼠眼局部注射地塞米松后大鼠血糖升高。此外，有研究表明，水合氯醛可提高實(shí)驗(yàn)動物的血糖水平[17]。由此可知，T2DM大鼠血糖升高可能是多因素共同協(xié)作的結(jié)果。本研究發(fā)現(xiàn)，注射地塞米松磷酸鈉后大鼠血糖升高水平略高于注射生理鹽水。Kymionis等[18]評估眼局部使用地塞米松對糖尿病患者血糖水平的影響，結(jié)果顯示地塞米松組糖尿病患者血糖水平顯著升高(P=0.003)，而對照組(平衡鹽溶液)未發(fā)現(xiàn)任何統(tǒng)計學(xué)差異，說明眼局部使用地塞米松提高了控制性糖尿病患者的血糖水平。

本研究結(jié)果表明，眼局部三種途徑給藥后，結(jié)膜下注射較球旁和球后注射后房水地塞米松濃度先達(dá)到峰值。Kim等[19]發(fā)現(xiàn)皺襞部、扁平部是鞏膜最具滲透性的區(qū)域，藥物經(jīng)鞏膜到達(dá)眼前段，且藥物在鞏膜的滲透性并不依賴于其親脂性[20]，本實(shí)驗(yàn)采用的注射用地塞米松磷酸鈉為水溶性，易于鞏膜吸收。因結(jié)膜下注射比球旁、球后注射后藥物能更接近鞏膜，故結(jié)膜下注射比球旁、球后注射經(jīng)鞏膜擴(kuò)散量更大。此外，我們觀察到大鼠眼局部結(jié)膜下注射地塞米松磷酸鈉后，部分液體從針孔處溢出，溢出的藥物可通過角膜途徑吸收。Urtti等[21]研究發(fā)現(xiàn)，局部應(yīng)用滴眼液后前房房水中的藥物峰值濃度可在20～30min后出現(xiàn)；Ghate等[22]研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)膜下注射NaF 2h時可在視網(wǎng)膜上觀察到濃度峰值；Weijtens等[23]評估結(jié)膜下注射地塞米松患者房水、玻璃體和血清中的地塞米松濃度，并與球周注射比較，分析結(jié)膜下注射作為將地塞米松輸送到玻璃體內(nèi)的有效性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射后2.5h，房水中估計的最大地塞米松濃度為858ng/mL，達(dá)到藥物濃度峰值，結(jié)膜下注射2.5mg地塞米松后玻璃體地塞米松峰值濃度比球周注射5mg地塞米松后高出3倍，該研究還發(fā)現(xiàn)地塞米松從房水?dāng)U散到玻璃體腔可能是地塞米松進(jìn)入玻璃體腔的第三種方式。這與本研究觀察到結(jié)膜下注射途徑先出現(xiàn)藥物濃度峰值是一致的。

此外，我們發(fā)現(xiàn)，眼局部三種途徑給藥后，藥物濃度峰值結(jié)膜下注射(957.34±3.60ng/mL)>球后注射(859.60±3.56ng/mL)>球旁注射(732.38±4.56ng/mL)。Cheruvu等[24]研究發(fā)現(xiàn)，脂族化合物如地塞米松在Bruch膜和脈絡(luò)膜內(nèi)顯著滯留，可能是由于黑色素水平較高。視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)和脈絡(luò)膜都含有豐富的黑色素，球旁和球后注射藥物經(jīng)鞏膜滲透進(jìn)入玻璃體內(nèi)，從而彌散至前房，藥物濃度峰值出現(xiàn)在結(jié)膜下途徑之后。Weijtens等[25]評估球周注射、結(jié)膜下注射地塞米松后視網(wǎng)膜下液中地塞米松濃度，研究發(fā)現(xiàn)球周注射、結(jié)膜下注射視網(wǎng)膜下液中最大地塞米松濃度分別為82.2、359ng/mL。提示與球周注射相比，結(jié)膜下注射地塞米松能更有效地將藥物遞送到視網(wǎng)膜下液中。說明經(jīng)結(jié)膜下途徑到達(dá)眼內(nèi)的藥物濃度高于眼周途徑，這與本研究結(jié)果一致。另有研究認(rèn)為，球周注射為有創(chuàng)給藥方式，長期給藥易造成局部異物反應(yīng)，引起結(jié)膜粘連，給患者帶來主觀不適[26]，球旁、球后注射可能導(dǎo)致眼瞼皮下出血、結(jié)膜水腫、球后出血、上瞼下垂、刺破眼球等并發(fā)癥[27]。我們在解剖取樣時也發(fā)現(xiàn)部分大鼠出現(xiàn)眼球球壁局部血腫、球后血腫現(xiàn)象，但具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

綜上所訴，三種途徑注射地塞米松對T2DM大鼠血糖的影響無明顯差異，而結(jié)膜下注射地塞米松操作簡單，可在短時間內(nèi)達(dá)到較高的藥物濃度，是一種較為方便的地塞米松給藥方式。隨著對鞏膜、脈絡(luò)膜、RPE層藥物動力學(xué)認(rèn)知的不斷提升以及材料工程學(xué)、藥物試劑的發(fā)展，眼部給藥方式和新型材料得到了深入研究，期待給患者帶來新的治療希望。