劉四衛(wèi) 崔 玥 孫元元 胡 晶 張文睿 曹孟儒

肺癌嚴(yán)重威脅著人類的生命和健康，非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占所有確診肺癌的85%，NSCLC患者整體5年生存率低于15%[1]。腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是直接導(dǎo)致肺癌治療失敗和患者死亡的主要原因之一[2]。因此尋找治療的新靶點(diǎn)，對(duì)于肺癌的防治具有重要意義。叉頭框蛋白D3(Forkhead box D3，F(xiàn)OXD3)是FOX家族的重要成員之一，叉頭框(FOX)蛋白家族是一類具有翼狀螺旋結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子。FOXD3在FOX家族中具有獨(dú)特的叉頭結(jié)構(gòu)域，不僅起著轉(zhuǎn)錄抑制因子的作用，也可以作為轉(zhuǎn)錄激活因子[3]。

據(jù)報(bào)道，F(xiàn)OXD3在黑色素瘤、胃癌和神經(jīng)母細(xì)胞瘤中均呈低表達(dá)，抑制腫瘤生長(zhǎng)和侵襲。然而，與這些發(fā)現(xiàn)相反，F(xiàn)OXD3在腎癌和子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)上調(diào)，表現(xiàn)出致癌作用[4-6]。因此，F(xiàn)OXD3可能在人類腫瘤中表現(xiàn)出表達(dá)模式和功能的組織特異性。值得注意的是，F(xiàn)OXD3在肺癌中的表達(dá)及其在肺癌發(fā)生發(fā)展中的調(diào)控作用仍有待進(jìn)一步研究。因此本研究將對(duì)FOXD3在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制進(jìn)行研究，為FOXD3作為肺癌的治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

肺癌細(xì)胞A549購(gòu)自上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；1640培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；青霉素&鏈霉素雙抗購(gòu)自上海碧云天公司；FOXD3載體、PCDNA3.1載體、MTT試劑盒、DMSO試劑、Transwell小室購(gòu)自Costar公司；TRIzol購(gòu)自Invitrogen公司；cDNA合成試劑盒購(gòu)自TransGenBiotech公司；Real-time PCR試劑盒、DNA合成引物購(gòu)自蘇州金唯智生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 TCGA(The Cancer Genome Atlas)數(shù)據(jù)庫(kù)表達(dá)分析 從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中下載腫瘤表達(dá)譜數(shù)據(jù)對(duì)FOXD3在腫瘤中的表達(dá)情況進(jìn)行分析。進(jìn)一步對(duì)比數(shù)據(jù)庫(kù)中腫瘤組織以及癌旁正常組織中FOXD3的表達(dá)水平。

1.2.2 GEPIA(Gene Expression Profiling Interactive Analysis)數(shù)據(jù)庫(kù)生存分析 利用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析FOXD3的高低表達(dá)對(duì)腫瘤的總體生存期(Overall survival)的影響。

1.2.3 STRING數(shù)據(jù)庫(kù)蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò) 在數(shù)據(jù)庫(kù)中查找已有證據(jù)表明與FOXD3有直接相關(guān)性的蛋白質(zhì)、有文獻(xiàn)支持與FOXD3有相關(guān)性的蛋白質(zhì)以及預(yù)測(cè)可能與FOXD3有相關(guān)性的蛋白質(zhì)。

1.2.4 Gene Ontology功能富集分析 功能富集是通過(guò)在線數(shù)據(jù)庫(kù)Metascape(http：//metascape.org/)分析，并對(duì)富集結(jié)果進(jìn)行超幾何檢驗(yàn)分析。P<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.5 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)肺癌細(xì)胞(A549)。其培養(yǎng)基中含1%的青-鏈霉素雙抗。細(xì)胞在37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)瓶中細(xì)胞長(zhǎng)到80%時(shí)傳代，細(xì)胞常規(guī)換液。

1.2.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 按照轉(zhuǎn)染試劑比例進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，通過(guò)熒光倒置顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果，確定最佳轉(zhuǎn)染試劑比例，然后正式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。操作方法：選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，在六孔板中每孔加入30萬(wàn)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前觀察細(xì)胞狀態(tài)，待培養(yǎng)到細(xì)胞融合度達(dá)80%后轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染FOXD3質(zhì)粒的A549細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組(A549 FOXD3)，轉(zhuǎn)染PCDNA3.1質(zhì)粒的A549細(xì)胞為對(duì)照組(A549 CTRL)，轉(zhuǎn)染用無(wú)血清培養(yǎng)基，以2 μg質(zhì)粒：10 μL的1X PEI進(jìn)行轉(zhuǎn)染，8 h后換成含有血清的正常培養(yǎng)基，24 h后通過(guò)熒光倒置顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染效率=視野中綠色熒光細(xì)胞數(shù)/視野細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.7 Real-time PCR實(shí)驗(yàn) 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組FOXD3 mRNA的表達(dá)量，具體方法為：收集轉(zhuǎn)染FOXD3質(zhì)粒的A549實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞和轉(zhuǎn)染PCDNA3.1質(zhì)粒的A549對(duì)照組細(xì)胞，然后分別加入1 mLTrizol，震蕩混勻，按照提取細(xì)胞RNA試劑盒操作說(shuō)明提取RNA，按照cNDA合成試劑盒操作說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄RNA得到cDNA，按照RT-PCR相關(guān)操作說(shuō)明擴(kuò)增cDNA。引物為FOXD3，序列為，F(xiàn)OXD3-F：5′-ATGACCTCTCCGGCGGCGG-3′，F(xiàn)OXD3-R：5′CTATTGCGCCGGCCATTTGGCT-3′。內(nèi)參為T(mén)UBULIN，得到CQ值，統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.8 MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 用胰酶將轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞消化，稀釋細(xì)胞后用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，得出細(xì)胞總數(shù)，然后在96孔板中每孔加入1 500個(gè)細(xì)胞，每組細(xì)胞做5個(gè)復(fù)孔，鋪板后4 h待細(xì)胞貼壁，然后檢測(cè)0 h細(xì)胞數(shù)，以后每隔24 h檢測(cè)一次細(xì)胞數(shù)。檢測(cè)方法為：每孔加入20 μL MTT，培養(yǎng)箱中孵育4 h后，小心吸取孔中液體后加入150 μL DMSO，酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞在波長(zhǎng)為570 nm時(shí)的吸光度。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次以上且趨勢(shì)穩(wěn)定。

1.2.9 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 六孔板中A549細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染PCDNA3.1和FOXD3質(zhì)粒后，待細(xì)胞數(shù)長(zhǎng)到90%，用10 μL槍頭沿著直尺垂直劃線，標(biāo)記選取位置并拍照，隨后細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后觀察細(xì)胞遷移情況并拍照，每次拍照前將培養(yǎng)基換成PBS，拍完照換回常規(guī)培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次以上且趨勢(shì)穩(wěn)定。

1.2.10 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 在24孔板中，分別用無(wú)血清培養(yǎng)基將4萬(wàn)個(gè)轉(zhuǎn)染PCDNA3.1質(zhì)粒的A549細(xì)胞和轉(zhuǎn)染FOXD3質(zhì)粒的A549細(xì)胞懸浮，然后分別加到Transwell小室的聚碳酸酯膜上，膜上為500 μL細(xì)胞懸液，膜下為750 μL有血清的正常培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)22 h，然后用0.1%結(jié)晶紫染色30 min，清水清洗結(jié)晶紫，用棉棒將小室內(nèi)膜擦拭干凈。觀察細(xì)胞遷移情況并拍照。

1.2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析所得數(shù)據(jù)，MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中對(duì)每組實(shí)驗(yàn)每個(gè)復(fù)孔進(jìn)行OD570重復(fù)測(cè)量取均值，并將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組不同時(shí)間點(diǎn)的OD值的比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析。Transwell 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果中兩組樣本的均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FOXD3在多種腫瘤中的表達(dá)情況

通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)腫瘤組織與正常組織中FOXD3的轉(zhuǎn)錄水平。表達(dá)差異結(jié)果顯示，共有28種癌癥有差異表達(dá)，其中FOXD3在10種腫瘤中表達(dá)上調(diào)，在皮膚黑色素瘤(SKCM)的表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)(圖1)，而在18種腫瘤中FOXD3表達(dá)下調(diào)，表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)的有結(jié)腸癌(COAD)、直腸腺癌(READ)、睪丸生殖細(xì)胞癌(TGCT)(圖2)。

2.2 腫瘤中FOXD3表達(dá)情況與患者總生存期關(guān)系

利用數(shù)據(jù)庫(kù)GEPIA在多種腫瘤中對(duì)FOXD3的表達(dá)與患者總生存期進(jìn)行分析，結(jié)果顯示在肺鱗癌(LUSC)、皮膚黑色素瘤(SKCM)、腎上腺皮質(zhì)瘤(ACC)以及低分化膠質(zhì)瘤(LGG)4種腫瘤中FOXD3的差異表達(dá)與患者總生存期有關(guān)(P<0.05)(圖3)。

2.3 FOXD3抑制肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)

前期研究發(fā)現(xiàn)FOXD3對(duì)肺鱗癌患者預(yù)后產(chǎn)生影響，為了驗(yàn)證FOXD3在肺鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用，隨后在96孔板中做MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示從24 h開(kāi)始出現(xiàn)趨勢(shì)，72 h差異最顯著且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。轉(zhuǎn)染FOXD3質(zhì)粒的A549細(xì)胞增殖能力弱于轉(zhuǎn)染PCDNA3.1質(zhì)粒的A549細(xì)胞，表明FOXD3能夠抑制肺癌細(xì)胞的增殖能力(圖4)。

圖1 FOXD3在腫瘤中表達(dá)上調(diào)Figure 1 The expression of FOXD3 was upregulated in tumor tissuesNote：T for tumor tissue；N for normal tissue；* P<0.05，when compared with the normal tissues.

圖2 FOXD3在腫瘤中表達(dá)下調(diào)Figure 2 The expression of FOXD3 was downregulated in tumor tissuesNote：T for tumor tissue；N for normal tissue；* P<0.05，when compared with the normal tissues.

圖3 FOXD3表達(dá)與總生存期之間的關(guān)系Figure 3 The relationship between FOXD3 expression and overall survival

2.4 FOXD3抑制肺癌細(xì)胞遷移

為了明確FOXD3對(duì)肺癌細(xì)胞A549遷移能力的影響，在初始劃痕區(qū)域一致的情況下，分別在培養(yǎng)0 h、24 h后觀察實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染FOXD3質(zhì)粒的A549細(xì)胞的遷移速度明顯慢于轉(zhuǎn)染PCDNA3.1質(zhì)粒的A549細(xì)胞，Transwell結(jié)果表明轉(zhuǎn)染FOXD3質(zhì)粒的A549細(xì)胞遷移能力明顯弱于轉(zhuǎn)染PCDNA3.1質(zhì)粒的A549細(xì)胞。以上研究結(jié)果表明FOXD3抑制肺癌細(xì)胞A549遷移能力(圖5)。

圖4 FOXD3對(duì)A549細(xì)胞的增殖能力的影響Figure 4 The effect of FOXD3 on proliferation of A549 cellsNote：A.The expression of FOXD3 was examined in over-expressed FOXD3 A549 cells by RT-qPCR.The expression of FOXD3 was increased when compared to the control A549 cells(*** P<0.001)；B.Cell viability was examined in A549 cells by MTT assay.The cell viability of control A549 cells was increased when compared to overexpressed FOXD3 A549 cells(* P<0.05).

圖5 FOXD3對(duì)A549細(xì)胞遷移的影響Figure 5 The effect of FOXD3 on migration of A549 cellsNote：A.Migration ability of different cancer cells was detected by wound healing assay；B.The wound healing ability of A549 FOXD3 was weaker than that of A549 CTRL cells(***P<0.001)；C.The number of migration in the control and experimental groups(100×)；D.The statistical results of transwell assay between A549 CTRL and A549 FOXD3 cells.The migration ability of A549 FOXD3 was decreased when compared to the control A549 cells(** P<0.01).

2.5 FOXD3相互作用蛋白質(zhì)的預(yù)測(cè)以及功能富集分析

為了進(jìn)一步研究FOXD3可能參與的信號(hào)通路，我們通過(guò)在STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)FOXD3參與的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行預(yù)測(cè)，分析結(jié)果顯示以FOXD3為中心參與多種基因的表達(dá)調(diào)控。例如，F(xiàn)OXD3與SOX2、POU5F1、NANOG等多種蛋白質(zhì)相互作用，隨后并對(duì)其進(jìn)行功能富集分析，結(jié)果顯示相關(guān)蛋白質(zhì)功能主要在激活細(xì)胞增殖有關(guān)基因，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(圖6)。

圖6 FOXD3互作蛋白質(zhì)Figure 6 FOXD3 interacts with other proteins

3 討論

全國(guó)惡性腫瘤發(fā)病率及死亡率呈逐年上升趨勢(shì)，其中肺癌在惡性腫瘤中的死亡率位于首位。由于其預(yù)后差，死亡率高，給社會(huì)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[7]。

到目前為止，F(xiàn)OXD3在腫瘤中的研究還不太深入。據(jù)報(bào)道FOXD3直接與miR-137啟動(dòng)子結(jié)合，激活其轉(zhuǎn)錄，通過(guò)AKT2途徑抑制人肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[8]；FOXD3缺陷能誘導(dǎo)乳腺癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化并與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)[9]；在胃癌中，幽門(mén)螺桿菌感染是導(dǎo)致胃癌發(fā)生的重要因素，感染幽門(mén)螺桿菌會(huì)導(dǎo)致FOXD3的高甲基化，使FOXD3表達(dá)減少，胃癌發(fā)生機(jī)會(huì)增加，并且FOXD3過(guò)表達(dá)會(huì)使CYFIP2和RARB的轉(zhuǎn)錄上調(diào)，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖[4]。然而有研究發(fā)現(xiàn)FOXD3表達(dá)低是胃癌的有利預(yù)后因素[10]。此外，F(xiàn)OXD3通過(guò)EGFR-Ras-Raf-MEK-ERK信號(hào)通路抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖[11]。

本研究對(duì)FOXD3在多種腫瘤中的表達(dá)情況進(jìn)行了全面總結(jié)，發(fā)現(xiàn)FOXD3在多種腫瘤中都存在差異性表達(dá)；同時(shí)也分析了FOXD3對(duì)腫瘤患者總生存期的影響，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)FOXD3的差異表達(dá)對(duì)肺癌患者的總生存期產(chǎn)生影響。因此我們?cè)诜伟┲袑?duì)FOXD3基因進(jìn)行深入研究，首先構(gòu)建FOXD3過(guò)表達(dá)肺癌細(xì)胞系，隨后進(jìn)行了細(xì)胞增殖和遷移侵襲相關(guān)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示FOXD3抑制肺癌細(xì)胞增殖以及遷移侵襲能力。最后本研究通過(guò)在STRTNG數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)FOXD3參與的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)FOXD3與POU5F1、SOX2、NANOG等多種蛋白質(zhì)存在明確的相互作用。并對(duì)這四個(gè)基因進(jìn)行GO功能富集分析。結(jié)果顯示功能主要富集到細(xì)胞增殖上，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。POU5F1是POU轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，在胚胎發(fā)育和干細(xì)胞多能性中起關(guān)鍵作用。該基因在組織中的異常表達(dá)與腫瘤發(fā)生有關(guān)。例如在結(jié)腸癌中POU5F1低表達(dá)患者在根治性手術(shù)切除后無(wú)病生存率高，POU5F1被認(rèn)為是結(jié)腸癌患者的預(yù)后因素[13]。POU5F1在肺癌中也有相關(guān)報(bào)道，研究發(fā)現(xiàn)肺癌的放射抗性與AKT-Onzin-POU5F1軸相關(guān)[14]。SOX2是SRY相關(guān)HMG-box(SOX)轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中干細(xì)胞維持所必需的，同時(shí)還參與胚胎發(fā)育的調(diào)節(jié)。研究表明SOX2與多種惡性腫瘤進(jìn)展有關(guān)，例如，SOX2的異位表達(dá)逆轉(zhuǎn)了人膀胱癌細(xì)胞中ChlA-F對(duì)細(xì)胞侵襲能力的抑制，ChlA-F處理誘導(dǎo)HuR蛋白表達(dá)，并且增加的HuR與USP8 mRNA相互作用，導(dǎo)致USP8 mRNA穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)表達(dá)的升高，升高的USP8隨后充當(dāng)E3連接酶以促進(jìn)SOX2泛素化和蛋白質(zhì)降解；而且ChlA-F處理顯著增加Ser63和Ser73的c-Jun磷酸化，啟動(dòng)miR-200c轉(zhuǎn)錄，增加的miR-200c直接結(jié)合SOX2 mRNA的3′-UTR以抑制SOX2蛋白翻譯[15]。尼古丁是煙草煙霧的成癮成分，不能引發(fā)腫瘤，但可以促進(jìn)體外細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。有研究已證實(shí)尼古丁可以誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞因子SOX2的表達(dá)，這是非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中自我更新和維持干細(xì)胞特性必不可少的[16]。此外，在肺癌中，SOX2與CtBP1的相互作用可以促進(jìn)肺腺癌的生長(zhǎng)，遷移和侵襲[17]。

綜上所述，通過(guò)對(duì)FOXD3進(jìn)行互作蛋白預(yù)測(cè)將為FOXD3的后續(xù)研究指明了方向并提供了理論依據(jù)。