陳光浩 方靖萱 彭素娟 嚴(yán)煒薇 王福海 陳承哲 陳泗川 潘建基 邱素芳

鼻咽癌是我國南方常見的頭頸部惡性腫瘤之一，發(fā)病率約25～30/10萬[1]。鼻咽因解剖部位深，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，惡性程度高，不易早期發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌的早期診斷和治療的研究一直是我國放射腫瘤學(xué)家們研究的重點之一。隨著調(diào)強放射治療技術(shù)的廣泛應(yīng)用，鼻咽癌的局部區(qū)域控制率和總生存率有所提高[2-3]，但中晚期患者5年生存率僅60%～70%[4-5]。因此，闡明鼻咽癌發(fā)病機制、開發(fā)新的治療靶點對提高晚期患者存活率十分重要。

妊娠上調(diào)的非泛素性鈣調(diào)蛋白激酶(Pregnancy-upregulated nonubiquitous calmodulin kinase，PNCK)是鈣調(diào)蛋白激酶I家族的獨特成員，與催化結(jié)構(gòu)域內(nèi)的鈣調(diào)蛋白激酶I最為同源。相關(guān)文獻發(fā)現(xiàn)PNCK基因在乳腺癌和腎癌中呈特異性高表達，該基因與腫瘤細(xì)胞的增殖密切相關(guān)[6]。有報告顯示與良性乳腺組織相比時，PNCK mRNA表達在人類乳腺癌亞組織中上調(diào)3～5倍，而且與細(xì)胞的增殖密切相關(guān)[7]。然而，PNCK基因在鼻咽癌中的表達和作用研究甚少，本研究旨在檢測PNCK在鼻咽癌腫瘤組織中表達水平，并探究PNCK對鼻咽癌細(xì)胞增殖的影響。本研究為揭示鼻咽癌發(fā)病機制、開發(fā)腫瘤治療新靶點提供相應(yīng)的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑

人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2Z保存于福建省腫瘤醫(yī)院腫瘤放射生物研究所。細(xì)胞在含10%胎牛血清和1%雙抗(青霉素/鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2 PNCK基因PSCSI-GFP慢病毒載體構(gòu)建

實驗使用GV115載體，以PNCK基因為模板選取靶點序列：TCAGCAGCGTCTACGAGAT。在此基礎(chǔ)上設(shè)計2個shRNA干擾序列構(gòu)建載體，同時在序列前邊和后邊添加限制性內(nèi)切酶酶切位點。在退火緩沖液內(nèi)溶解單鏈DNA oligo干粉，將濃度為20 μM的混合液放入90℃水浴，15 min后拿出放于室溫環(huán)境下自然冷卻，形成雙鏈片段，具有黏性末端。根據(jù)NEB說明書配制AgeI和EcoRI 50 μL雙酶切反應(yīng)體系，使GV115載體線性化。將反應(yīng)體系于37℃下充分反應(yīng)1 h后，將目的片段切膠回收。根據(jù)Fermentas T4 DNA Ligase說明書配制20 μL雙鏈DNA oligo反應(yīng)體系，并將其連接線性化載體，置于16℃下反應(yīng)1～3 h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，然后進行陽性克隆的菌落PCR鑒定。并對Sanger進行測序測試，在LB液體培養(yǎng)基(含Amp)中加入序列正確的菌液，于37℃下恒溫?fù)u床內(nèi)震蕩培養(yǎng)，過夜后提取質(zhì)粒。

1.3 慢病毒包裝與感染

取細(xì)胞狀態(tài)良好、處于對數(shù)生長期的CNE-2Z細(xì)胞，接種于6孔板中，按照2×105個/孔接種，繼續(xù)培養(yǎng)，確保加入病毒進行感染時細(xì)菌鋪板量達15%～30%。在對照組shCtrl中加入2.5 μL病毒滴度為8×108TU/mL的病毒，在實驗組shPNCK中加入4 μL病毒滴度為5×108TU/mL的病毒。在熒光顯微鏡下觀察感染后的細(xì)胞狀態(tài)及感染效率。

1.4 Real-Time PCR

用Trizol法進行提取實驗組shPNCK和對照組shCtrl的CNE-2Z細(xì)胞總RNA，用M-MLV將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。配制20 μL的體系，進行PCR擴增，反應(yīng)條件為：95℃ 15 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，45個循環(huán)。PCR結(jié)束后，制作熔解曲線，反應(yīng)條件為：95℃ 1 min；冷卻至55℃，使DNA雙鏈充分結(jié)合；從55℃開始到95℃，每增加0.5℃，保持4 s，同時讀取吸光光度值，采用2-ΔΔCT法分析數(shù)據(jù)，實驗至少重復(fù)兩次。實驗所用引物包括PNCK上游：5-TGACATCTCAGAATCAGCCAAAG-3′，下游：5′-GTGTCCGAGCAAAGTTCTTCC-3′；GAPDH上游：5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′，下游：5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3。

1.5 Western blot

提取實驗組shPNCK和對照組shCtrl的CNE-2Z細(xì)胞總蛋白，經(jīng)PBS液兩次洗滌后，棄去PBS，加入適量預(yù)冷的2×Lysis Buffer，細(xì)胞刮刮下細(xì)胞轉(zhuǎn)移入EP管中，冰上裂解10～15 min，取上清用BCA法測定蛋白濃度。每個上樣孔上樣量控制在20 μg蛋白，經(jīng)10%SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。置于5%脫脂牛奶內(nèi)封閉處理1 h，一抗為兔抗人PNCK多克隆抗體(1∶1 000)，4℃孵育過夜，漂洗后以辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，孵育1 h，采用ECL法曝光目的條帶和內(nèi)參，實驗至少重復(fù)三次。

1.6 Caspase3和Caspase7活性檢測

Caspase3和Caspase7活性檢測采用Caspase3和Caspase7活性細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，操作步驟按照說明書進行，實驗至少重復(fù)三次。

1.7 MTT法檢測細(xì)胞增殖

消化、收集對照組shCtrl和實驗組shPNCK的CNE-2Z細(xì)胞以100 μL/孔接種于96孔板中，分板后24～120 h加入20 μL 5 mg/mL的MTT溶液，充分反應(yīng)4 h后完全吸去培養(yǎng)液，注意不要吸掉孔板底部的甲瓚顆粒，后加入100 μL DMSO溶解甲瓚顆粒。經(jīng)2～5 min充分振蕩后，上酶標(biāo)儀檢測OD值，實驗至少重復(fù)三次。

1.8 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

消化、收集對照組shCtrl和實驗組shPNCK的CNE-2Z細(xì)胞，上機離心處理5 min，轉(zhuǎn)速1 300 rmp，去除上清液，放入4℃預(yù)冷的適量D-Hanks液中，pH為7.2～7.4，洗滌細(xì)胞，棄去洗液，沉淀。加入1×binding buffer洗滌細(xì)胞，棄去洗液，沉淀，上機離心處理3 min，轉(zhuǎn)速1 300 rmp，收集細(xì)胞。加入200 μL 1×binding buffer重懸細(xì)胞沉淀一次。加入適量Annexin V-APC染色，于室溫下避光孵育10～15 min。根據(jù)細(xì)胞量，補加400～800 μL 1×binding buffer，上機檢測，實驗至少重復(fù)三次。

1.9 組織免疫組化檢測PNCK蛋白水平

回顧性收集2012年1月—3月在福建省腫瘤醫(yī)院病理確診為首診無轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者原發(fā)灶的石蠟組織10例和慢性鼻咽黏膜炎的正常鼻咽黏膜上皮的石蠟組織10例。10例鼻咽癌患者中，男性8例，女性2例，中位年齡為46歲，Ⅲ期有6例，Ⅳa期4例，所有分期均按鼻咽癌第七版UICC/AJCC分期。該研究所涉及的人組織樣本得到福建省腫瘤醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)，項目倫理號為：2017-051-01。鼻咽癌組織石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化，用PBS配置新鮮的H2O2，室溫封閉10 min。高溫抗原修復(fù)。自然冷卻至室溫后，置入蒸餾水中浸泡10 min，采用10%血清封閉30 min。加入對應(yīng)的一抗(1∶50，Sigma，USA)孵育過夜，TBS洗2遍，每次5 min，加入二抗室溫孵育60 min。DAB染色，蘇木素染核、洗滌、干燥、封片，顯微鏡下觀察。其最終的免疫組化評判標(biāo)準(zhǔn)主要根據(jù)染色強度和陽性細(xì)胞百分比的乘積打分，陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)：0分：0%陽性細(xì)胞數(shù)；1分：1～25%陽性細(xì)胞數(shù)；2分：26～50%陽性細(xì)胞數(shù)；3分：51～75%陽性細(xì)胞數(shù)；4分：≥71%陽性細(xì)胞數(shù)。染色強度評分：0分：無著色；1分：較弱；2分：中等；3分：較強。然后用染色強度和陽性細(xì)胞百分比相乘，算出最后的積分，范圍為0～12分。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0版軟件分析處理所有數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析(One way ANOVA)比較兩組及以上的樣本資料，并采用Bonferroni法進行兩兩比較，通過重復(fù)測量方差分析計算PNCK shRNA轉(zhuǎn)染對CNE-2Z細(xì)胞增殖的影響，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鼻咽癌腫瘤組織中PNCK表達水平

為了檢測鼻咽癌腫瘤組織中PNCK蛋白表達水平，我們收集10例鼻咽癌患者腫瘤組織和10例慢性鼻咽黏膜炎的正常鼻咽黏膜上皮組織。免疫組織化學(xué)方法結(jié)果表明，PNCK在鼻咽癌組織中表達在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核上，與正常組織相比，PNCK在腫瘤中的免疫組化積分明顯較高，即PNCK蛋白在腫瘤組織中表達量明顯升高(P<0.001)(圖1)。

圖1 鼻咽癌組織PNCK蛋白表達水平Figure 1 The expression of PNCK protein in nasopharyngeal carcinoma tissues

2.2 shRNA轉(zhuǎn)染對PNCK基因表達的影響

為了干擾PNCK表達，本研究采用慢病毒感染方法將shPNCK轉(zhuǎn)染至CNE-2Z細(xì)胞中。48 h后，Real time PCR驗證轉(zhuǎn)染效果，實驗組shPNCK的CNE-2Z細(xì)胞中PNCK的表達顯著下調(diào)，與對照組shCtrl相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。Western blot結(jié)果同樣說明shPNCK轉(zhuǎn)染后PNCK蛋白表達明顯降低，提示CNE-2Z細(xì)胞中PNCK基因在mRNA和蛋白水平的表達量受到抑制(圖2)。

圖2 慢病毒干擾CNE-2Z細(xì)胞中PNCK表達Figure 2 The expression of PNCK in CNE-2Z cells transferred lentivirusNote：A.The expression of PNCK at levels of mRNA；B.The expression of PNCK at levels of protein，**P<0.01，when compared with the shCtrl group.

2.3 PNCK shRNA轉(zhuǎn)染對CNE-2Z細(xì)胞增殖的影響

經(jīng)shRNA慢病毒感染72 h后，細(xì)胞鋪于96孔板，鋪板數(shù)為2 000個細(xì)胞。實驗組shRNA轉(zhuǎn)染后24 h及48 h的增殖抑制率與對照組無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，但72、96、120 h的增殖抑制率均明顯高于對照組shCtrl(P<0.05)(圖3)。

2.4 PNCK shRNA轉(zhuǎn)染對CNE-2Z細(xì)胞凋亡的影響

shRNA慢病毒感染后72 h傳代，在室溫中調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至1×104細(xì)胞/孔，并將細(xì)胞按照每孔100 μL加入96孔板中，然后分別將100 μL Caspase3/7反應(yīng)液加入并共孵育2 h，然后上酶標(biāo)儀檢測。結(jié)果表明，與對照組shCtrl比較，實驗組shRNA的CNE-2Z細(xì)胞中Caspase3和Caspase7活性升高，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(圖4)。此外，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，與對照組相比，實驗組CNE-2Z細(xì)胞凋亡率升高(P<0.01)(圖5)，這些結(jié)果提示PNCK基因與CNE-2Z細(xì)胞的凋亡顯著相關(guān)。

圖3 干擾PNCK表達后CNE-2Z細(xì)胞增殖變化Figure 3 The knocking down PNCK inhibited proliferation of CNE-2Z cellsNote：A.The curves of CNE-2Z cells between the control RNA and PNCK shRNA groups at wavelength of 490 nm；B.The fold changes of CNE-2Z cells between the control RNA and PNCK shRNA groups at wavelength of 490 nm.**P<0.01；***P<0.001，when compared with the shCtrl group.

圖4 干擾PNCK表達后CNE-2Z細(xì)胞Caspase3和Caspase7活性變化Figure 4 The activity of caspase-3，7 in CNE-2Z cells after knocked-down PNCKNote：** P<0.01，when compared with the shCtrl group.

圖5 干擾PNCK表達后CNE-2Z細(xì)胞凋亡率變化Figure 5 The apoptotic rates of CNE-2Z cells after knocked-down PNCK Note：** P<0.01，when compared with the shCtrl group.

3 討論

PNCK是近年來研究癌癥靶向藥物方面的熱點之一，它是鈣調(diào)蛋白激酶I家族的獨特成員，與催化結(jié)構(gòu)域內(nèi)的鈣調(diào)蛋白激酶I最為同源，具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，人PNCK編碼基因定位于Xq28，編碼蛋白分子量為38 kDa。研究發(fā)現(xiàn)，PNCK在小鼠乳腺發(fā)育過程中其表達呈現(xiàn)時間和空間特異性，伴隨著乳腺上皮細(xì)胞增殖和終末分化的減少，PNCK的表達逐漸上調(diào)，在懷孕晚期達到最高水平的表達；在乳腺中，PNCK以上皮特異性和異質(zhì)性的方式表達，表明該激酶的表達可能限于特定的乳腺上皮細(xì)胞類型[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，PNCK的表達與乳腺癌轉(zhuǎn)基因小鼠來源的乳腺上皮細(xì)胞系中的癌基因相關(guān)：c-myc或int-2/Fgf3轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺來源細(xì)胞均表達PNCK，而neu或H-ras來源的細(xì)胞則不表達；以類似的方式，人PNCK基因僅在部分人乳腺癌細(xì)胞中表達，表明PNCK可能在乳腺發(fā)育中發(fā)揮作用，并且該激酶的表達被限制在人乳腺上皮細(xì)胞[7]。此外，與良性乳腺組織相比，PNCK基因在人乳腺癌組織中表達上調(diào)3～5倍，而且與細(xì)胞的增殖密切相關(guān)，表明PNCK可能參與乳腺癌發(fā)生發(fā)展。進一步研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌中PNCK可以通過干擾熱休克蛋白Hsp90活性引起配體依賴的EGFR降解[8-9]。除此之外，學(xué)者發(fā)現(xiàn)腎癌患者中PNCK存在高表達；和PNCK低表達患者相比，PNCK高表達的患者總生存率較低，是腎癌不良預(yù)后的獨立預(yù)測因素[10]。以上結(jié)果表明PNCK該基因與腫瘤細(xì)胞的增殖功能密切相關(guān)。

本研究選取福建省腫瘤醫(yī)院活檢鼻咽癌癌組織10例及鼻咽正常組織10例作為對照組，首先通過免疫組織化學(xué)、Real time PCR和Western blot方法比較PNCK基因在鼻咽癌組織和細(xì)胞中的表達情況，發(fā)現(xiàn)PNCK基因在鼻咽癌組織和細(xì)胞中呈高表達。本研究進一步構(gòu)建敲除PNCK基因的鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2Z細(xì)胞為對象，進行后續(xù)細(xì)胞功能實驗，MTT法顯示實驗組(CNE-2Z)細(xì)胞增殖減緩，表明PNCK基因敲除對細(xì)胞增殖功能密切相關(guān)。

大量研究結(jié)果顯示，在腫瘤病情進展及其治療期間細(xì)胞凋亡扮演了重要角色[11-12]。本研究采用凋亡率評價靶向抑制PNCK基因表達對細(xì)胞凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)shPNCK組較對照組的細(xì)胞凋亡數(shù)明顯增多，凋亡率明顯上升，提示PNCK與鼻咽癌細(xì)胞凋亡關(guān)系密切，推測其可能與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的相關(guān)基因的表達相關(guān)。

綜上所述，通過shRNA抑制PNCK基因表達可抑制增殖并誘導(dǎo)凋亡，對鼻咽癌的靶點治療有一定價值。