商迎輝 章麗娜 李夢(mèng)潔 趙范范 劉馨君 魏 俊 黃漢昌 勞鳳學(xué)

（北京市生物活性物質(zhì)與功能食品研究院 北京聯(lián)合大學(xué)功能因子與腦科學(xué)研究院生物化學(xué)工程學(xué)院 北京 100191）

生物素（Biotin）又稱維生素 B7、維生素 H，是一種水溶性B族維生素，由含有一個(gè)硫原子的脲基環(huán)和一條戊酸的側(cè)鏈組成，目前已知8種異構(gòu)體。天然存在的D－生物素具有活性，為哺乳動(dòng)物5種生物素依賴性羧化酶的輔酶，在催化糖原異生，氨基酸分解代謝和脂肪酸合成中起關(guān)鍵作用。生物素還通過共價(jià)鍵與組蛋白結(jié)合，在調(diào)節(jié)基因穩(wěn)定性和表達(dá)中起重要作用[1]。

生物素缺乏癥（Biotin deficiency）以皮膚、黏膜和神經(jīng)系統(tǒng)損害為主[2]。生物素主要來源于酵母、花椰菜、堅(jiān)果類、蛋黃、肝臟和腎臟。人體腸道內(nèi)細(xì)菌可合成一些生物素，一般情況下極少缺乏。然而，由于嬰幼兒腸道功能較弱，需在嬰幼兒食品中強(qiáng)化生物素，以避免生物素缺乏癥的發(fā)生[3]。

生物素測(cè)定方法有微生物法、同位素稀釋法、比色測(cè)定法、熒光測(cè)定法、化學(xué)分光法、薄層色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法、滴定分析法、動(dòng)力學(xué)電位法、蛋白質(zhì)耦合法、競(jìng)爭(zhēng)耦合化學(xué)分光法、酶標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)耦合法、薄層層析法、毛細(xì)管電泳法、動(dòng)物試驗(yàn)法、酶聯(lián)免疫吸附法、微分脈沖伏安等。其中微生物法是最靈敏和應(yīng)用最廣泛的方法，是美國(guó)官方分析化學(xué)家協(xié)會(huì)（AOAC）推薦方法，也是美國(guó)、中國(guó)等國(guó)家的官方指定方法[3]。

我國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.259－2016規(guī)定了食品中生物素的測(cè)定方法，然而該方法操作繁雜，微生物生長(zhǎng)的不確定性強(qiáng)，影響因素較多。按照 CNAS－CL07：2011要求，本研究按照食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.259－2016規(guī)定的方法對(duì)嬰幼兒配方食品中生物素含量進(jìn)行測(cè)定，依據(jù)JJF1059.1－2012和GB/Z22553－2010對(duì)測(cè)定過程中影響檢驗(yàn)結(jié)果的各個(gè)分量進(jìn)行評(píng)估，并給出擴(kuò)展不確定度[4-7]。

1 材料與方法[4]

1.1 主要材料與試劑

試樣：生物素定值樣品嬰幼兒谷粉（嬰幼兒配方食品）QC-RP-010中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心。

菌種：植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），中國(guó)科學(xué)院微生物研究所CGMCC 1.0485。標(biāo)準(zhǔn)品：生物素（標(biāo)準(zhǔn)品，純度 99.6%，批號(hào)：100291-201303），中國(guó)食品藥品檢定研究院。

培養(yǎng)基及試劑：生物素測(cè)試肉湯（批號(hào)：5056924），美國(guó)BD公司；MRS瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：150702），北京陸橋生物技術(shù)有限公司；氫氧化鈉（分析純，批號(hào)：20120201）、無水乙醇（分析純，批號(hào)：20150527），北京化工廠；超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

高壓蒸汽滅菌鍋，日本Tomy公司；BSP-250生化培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；BSA124S電子天平（精度0.1 mg），賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；MS105DU電子天平（精度0.01mg），瑞士MettlerTodedo公司；UV2450紫外/可見光分光光度計(jì)，日本島津公司。

1.3 樣品處理與試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理與稀釋 準(zhǔn)確稱取適量樣品（約含 0.2～0.5 μg生物素）精確至 0.001 g，于 250 mL三角瓶中。加入硫酸溶液100 mL，121℃水解30 min，冷卻后用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至（4.5±0.2）。定量轉(zhuǎn)到250 mL容量瓶中，用水定容，充分混合。用濾紙過濾，棄去最初的幾毫升。吸取濾液5 mL，加入約20 mL水，用氫氧化鈉溶液調(diào)pH為（6.8±0.2），定量轉(zhuǎn)到 100 mL容量瓶中，用水定容。

1.3.2 測(cè)定 按照GB 5009.259－2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中生物素的測(cè)定》6.4～6.7節(jié)要求，制備試樣系列管、標(biāo)準(zhǔn)系列管、滅菌、接種、培養(yǎng)和測(cè)定。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以生物素含量（ng）為橫坐標(biāo)，OD550nm為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 樣品稀釋液中生物素含量計(jì)算

按GB 5009.259－2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中生物素的測(cè)定》6.7.2節(jié)要求計(jì)算。

1.6 樣品中生物素含量計(jì)算

按GB 5009.259－2016標(biāo)準(zhǔn)中6.7.2節(jié)要求計(jì)算，見式（1）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度來源分析[8-11]

根據(jù)整個(gè)試驗(yàn)過程，通過微生物法測(cè)定生物素含量，主要由測(cè)量重復(fù)性、試樣稱量及稀釋、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量及標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、紫外分光光度計(jì)測(cè)量偏差等引入的不確定度。

2.2 測(cè)量不確定度評(píng)估

2.2.1 測(cè)量重復(fù)性引入的不確定度[12-13]按照GB 5009.259－2016對(duì)定值樣品的生物素含量進(jìn)行8次平行測(cè)定，結(jié)果見表1。重復(fù)測(cè)量產(chǎn)生的不確定度屬于A類不確定度。

表1 樣品生物素含量測(cè)定結(jié)果Table1 Result of the repeated measurements

按貝塞爾公式（式2）計(jì)算出試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)差：

按GB 5009.259－2016，日常檢測(cè)做 2個(gè)平行，檢測(cè)結(jié)果取平均值，2次重復(fù)測(cè)試引入的不確定度，見式（3）。

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度，見式（4）。

2.2.2 樣品稱量及稀釋引入的不確定度

2.2.2.1 樣品稱量引入的不確定度 用電子天平準(zhǔn)確稱取樣品1.5002 g，即1500.2 mg，天平精度為0.1 mg，根據(jù)天平檢定證書，最大重復(fù)性誤差為0.2 mg，當(dāng)0≤m≤50 g時(shí)，示值誤差為0.2 mg。采用矩陣分布，包含因子k為，按B類不確定度評(píng)定，標(biāo)準(zhǔn)不確定度，見式（5）。

合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度，見式（6）。

樣品稱量時(shí)的相對(duì)不確定度，見式（7）。

2.2.2.2 樣品稀釋引入的不確定度[14-15]樣品前處理和稀釋過程中使用了250，100 mL容量瓶，5 mL單標(biāo)線吸量管，這些玻璃器具的校準(zhǔn)和室溫對(duì)液體體積的影響，可導(dǎo)致生物素含量測(cè)定的偏差。根據(jù)最大允許誤差，按均勻分布處理，包含因子k為計(jì)算不確定度分量，見式（8）。

相對(duì)不確定度見式（9）。

因此，各玻璃量具在稀釋過程中引入的不確定度見表2。

表2 樣品稀釋時(shí)玻璃量具校準(zhǔn)引入的不確定度Table2 Uncertainties for measuring glasses’calibration in sample

合成玻璃器具校準(zhǔn)引入的不確定度分量見式（10）。

實(shí)驗(yàn)室溫度變化介于（20±5）℃，水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃，按照矩形分布，k為，溫度產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度見式（11）。

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度見式（12）。

合成實(shí)驗(yàn)室溫度變化引入的玻璃器皿相對(duì)不確定度分量見式（13）。

2.2.2.3 樣品稱量和稀釋引入的不確定度的合成

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度[16]

2.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品引入的不確定度 根據(jù)生物素標(biāo)準(zhǔn)品說明書，其純度p=（100±0.4）%，按B類不確定度評(píng)定，區(qū)間的半寬度為0.004，按均勻分布處理，包含因子為則標(biāo)準(zhǔn)品引入的不確定度見式（15）。

2.2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品稱量引入的不確定度 用電子天平準(zhǔn)確稱取生物素標(biāo)準(zhǔn)品100.23 mg，所用天平精度為0.01 mg，根據(jù)天平檢定證書，當(dāng)0.01≤m≤5 g時(shí)，示值誤差為0.01 mg，最大重復(fù)性誤差為0.04 mg。采用矩陣分布，包含因子為按B類不確定度評(píng)定，標(biāo)準(zhǔn)不確定度見式（16）。

合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度見式（17）。

標(biāo)準(zhǔn)品稱量時(shí)的相對(duì)不確定度見式（18）。

2.2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中使用了 1 000，500，250，100 mL 容量瓶，5，1 mL單標(biāo)線吸量管，其中5，1 mL單標(biāo)線吸量管和100 mL容量瓶各使用2次，這些玻璃器具的校準(zhǔn)和室溫對(duì)液體體積的影響，可導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)溶液配制的偏差。根據(jù)2.2.2.2節(jié)相關(guān)公式計(jì)算出玻璃器具校準(zhǔn)引入的相對(duì)不確定度，具體見表3。

表3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制時(shí)玻璃器具校準(zhǔn)引入的不確定度Table3 Uncertainties for measuring glasses’calibration in standard solution preparation

合成玻璃器具校準(zhǔn)引入的不確定度分量見式（19）。

溫度產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度見式（20）。

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度見式（21）。

合成實(shí)驗(yàn)室溫度變化引入的玻璃器皿相對(duì)不確定度分量見式（22）。

2.2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度的合成

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度[9]按照按GB 5009.259－2016中6.2.4節(jié)，標(biāo)準(zhǔn)系列管取8個(gè)生物素含量點(diǎn)，每個(gè)含量點(diǎn)做3個(gè)平行，試驗(yàn)數(shù)據(jù)見表4。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)表，標(biāo)準(zhǔn)系列管吸光值殘差的標(biāo)準(zhǔn)差見式（24），式（25）。

表4 標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)表Table4 Data sheet of standard curve

式中，Aij-（a+ci）——生物素量為ci時(shí)，儀器測(cè)得的吸光值與按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的理論吸光值差值；m——生物素含量點(diǎn)數(shù)；n——每個(gè)點(diǎn)測(cè)量次數(shù)。

式中，Ci——標(biāo)準(zhǔn)系列管中各生物素含量；——標(biāo)準(zhǔn)系列管各管生物素含量平均值。

按照GB 5009.259－2016中6.2.1節(jié)，試樣系列測(cè)試管中加入的試樣稀釋液量取4個(gè)點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)做3個(gè)平行，測(cè)得各管吸光值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的各試樣測(cè)試管中生物素含量見表5。

表5 試樣測(cè)試管中生物素含量Table5 The biotin content of sample testing tubes

標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度見式（26）。

相對(duì)不確定度見式（27）。

2.2.5 紫外－可見分光光度計(jì)引入的不確定度

依據(jù)檢定證書，紫外-可見分光光度計(jì)的透射比示值誤差為0.5%，按均勻分別處理，k為由紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)量偏差引入的相對(duì)不確定度見式（28）。

2.3 合成不確定度的計(jì)算

綜上，試驗(yàn)過程中，影響檢驗(yàn)結(jié)果的各個(gè)因素引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度，見表6。

表6 不確定度分量表Table6 The heft of uncertainty

綜合各不確定度分量，合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度，計(jì)算嬰幼兒谷粉中生物素含量測(cè)定的相對(duì)不確定度見式（29）。

樣品測(cè)定平均值為32.49 μg/100 g，則生物素定值樣品嬰幼兒谷粉測(cè)定的不確定度見式（30）。

2.4 擴(kuò)展不確定度

測(cè)定結(jié)果按正態(tài)分布估計(jì)，置信水平為95%時(shí)，包含因子k=2，擴(kuò)展不確定度可由合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度乘以包含因子獲得，則u=2×1.31 μg/100 g=2.62 μg/100 g。本次測(cè)定的生物素定值樣品嬰幼兒谷粉的生物素含量為（32.49±2.62）μg/100 g。

3 結(jié)論

按照GB 5009.259－2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中生物素的測(cè)定》標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定生物素定值樣品嬰幼兒谷粉中生物素含量，并對(duì)測(cè)定過程進(jìn)行不確定度評(píng)估。結(jié)果顯示，測(cè)量不確定度主要來源于標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合，其次是由重復(fù)測(cè)量引入的，而這兩個(gè)過程都和微生物因素密切相關(guān)，分析認(rèn)為微生物因素對(duì)樣品生物素測(cè)定中的不確定度有非常大的影響。GB 5009.259－2016食品中生物素測(cè)定的原理為生物素是植物乳桿菌必需營(yíng)養(yǎng)素，在生物素測(cè)定培養(yǎng)基中，植物乳桿菌的生長(zhǎng)與生物素含量呈線性關(guān)系，測(cè)試過程中微生物影響不易估計(jì)，可粗略用基于試驗(yàn)及最終結(jié)果的重復(fù)性的標(biāo)準(zhǔn)偏差來表征[17]，也可通過計(jì)算擬合不確定度來評(píng)估微生物因素引入的不確定度[18]。