(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院， 南昌 330045； 2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué),江西特色林木資源培育與利用2011協(xié)同創(chuàng)新中心， 南昌 330045)

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1毛紅椿種子

毛紅椿種子于2015年11月采自江西省龍南縣九連山國家級自然保護(hù)區(qū)蝦公塘保護(hù)站毛紅椿大樹，母樹胸徑62.4 cm，種子保存溫度-18 ℃，千粒質(zhì)量為9.16 g。

1.1.2病原分離樣本

發(fā)芽試驗(yàn)中被真菌感染而發(fā)芽失敗的毛紅椿種子。

1.1.3培養(yǎng)基

孟加拉紅培養(yǎng)基(虎紅培養(yǎng)基)；馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)；馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(PSA培養(yǎng)基)；胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基(CA培養(yǎng)基)；玉米瓊脂培養(yǎng)基(MA培養(yǎng)基)；察氏培養(yǎng)基(CD培養(yǎng)基)。

1.2 方 法

1.2.1毛紅椿種腐病原真菌的分離純化

用接種針挑取染病毛紅椿種子上的菌絲接種在孟加拉紅培養(yǎng)基上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待長出菌落后再用孟加拉紅培養(yǎng)基平皿進(jìn)行劃線分離[8]，每皿為1個處理，3次重復(fù)，長出的單菌落及時挑取至PDA培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)，純化好的菌株接種試管斜面于4 ℃冰箱中保存，備用。

1.2.2毛紅椿種腐病原真菌的致病性檢測

在盒內(nèi)均勻鋪上2 cm厚的脫脂棉，然后覆上1張濾紙，添加蒸餾水將脫脂棉及濾紙充分浸潤，121 ℃滅菌30 min。選取顆粒飽滿、無霉變的毛紅椿種子，先用清水浸泡24 h，再用0.3%KMnO4水溶液浸泡30 min，然后用無菌水洗滌干凈，用無菌鑷子將種子置于發(fā)芽盒內(nèi)。分離菌株斜面試管中加入10 mL無菌水制成菌懸液，取1 mL菌懸液用100 mL無菌水稀釋，最后取5 mL稀釋液均勻滴加到培養(yǎng)盒內(nèi)的種子上，對照培養(yǎng)盒內(nèi)加入5 mL無菌水。培養(yǎng)盒置于25 ℃的光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)15 d，每天觀察種子發(fā)芽和病害發(fā)生情況，以子葉出現(xiàn)視為成苗。

成苗率(%)=(成苗種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%；

種子霉變率(%)=(發(fā)霉種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%。

1.2.3病原真菌的鑒定

1) 形態(tài)學(xué)鑒定。將斜面保藏菌種經(jīng)平皿活化擴(kuò)培后，取直徑為9 mm的菌餅接種于PDA培養(yǎng)基，于28 ℃，黑暗條件下培養(yǎng)，8 d后觀察菌落形態(tài)特征，采用Nikon Ni復(fù)合顯微鏡觀察菌絲及孢子形態(tài)。

2) 分子生物學(xué)鑒定。采用CTAB法提取真菌總DNA。以提取到的總DNA為模板，采用Mix混合試劑(湖南擎科生物技術(shù)有限公司)，以ITS 1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)和ITS 4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)作為引物擴(kuò)增Internal Transcribed Spacer (ITS)序列。PCR擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性40 s，50 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)，72 ℃后延伸10 min。PCR 產(chǎn)物送至北京博邁德生物有限公司進(jìn)行測序。將測得DNA序列提交NCBI的Genbank數(shù)據(jù)庫后進(jìn)行Blast檢索，下載數(shù)據(jù)庫中同源性較高的菌株DNA序列數(shù)據(jù)，與所測毛紅椿病原真菌DNA序列一起組成數(shù)據(jù)集，然后采用MEGA 5.0軟件中Clustal W進(jìn)行多序列比對，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4病原真菌的生物學(xué)特性

1) 不同培養(yǎng)基對菌絲生長的影響。配置PDA、PSA、CA、MA、CD 4種培養(yǎng)基，將供試菌種點(diǎn)種于不同培養(yǎng)基的平皿中央，每種培養(yǎng)基為一處理，每處理3次重復(fù)，于28 ℃，黑暗條件下培養(yǎng)，5 d后用十字交叉法測量菌落直徑。

2) 不同碳源、氮源對病原真菌生長的影響。以CD培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別用相等質(zhì)量分?jǐn)?shù)的葡萄糖、乳糖、麥芽糖、可溶性淀粉替代蔗糖作為碳源；以查氏培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別用相等質(zhì)量分?jǐn)?shù)的酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、硫酸銨、硝酸銨替代硝酸鈉作為氮源。配制不同碳源和氮源的固體培養(yǎng)基，將供試菌種點(diǎn)種于不同培養(yǎng)基的平皿中央，置于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5 d,十字交叉法測量菌落直徑。每處理3次重復(fù)。

1.3 溫度對病原真菌生長的影響

以PDA培養(yǎng)基為供試培養(yǎng)基，設(shè)置0 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、40 ℃共6個處理，每個處理進(jìn)行3次重復(fù)，于黑暗條件、各處理溫度下培養(yǎng)，7 d后用十字交叉法測定菌株菌落直徑。

1.4 pH對病原真菌生長的影響

以PDA培養(yǎng)基為供試培養(yǎng)基，分別用1 mol·L-1鹽酸和1 mol·L-1氫氧化鈉調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH至5、6、7、8、9、10、11、12 共8個處理，滅菌后測量并再次調(diào)節(jié)各處理培養(yǎng)基pH。接種供試菌，置于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5 d, 十字交叉法測量菌落直徑。每處理3次重復(fù)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用DPS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析、多重比較(LSD法)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原真菌的分離及致病性

以霉變腐爛種子為材料(圖1-A)分離得到1#和2#兩株真菌，菌絲特征與霉變種子上白色菌絲特征一致的菌株，致病性檢測如表1和圖1所示。由表1可知，經(jīng)1#和2#菌株處理的種子成苗率顯著低于空白對照，幼苗存活率與對照無顯著差異；2#菌株種子霉變率顯著高于對照和1#菌株，達(dá)到90%；幼苗干重顯著低于對照和1#菌株。2#菌株對種子的感染特征與樣品中霉變種子相同，均為在種子上產(chǎn)生蓬松的白色菌絲，最終種子失去發(fā)芽能力。1#菌株雖能顯著降低種子成苗率，但種子霉變率較低，且感染特征與樣品中霉變種子不相同，主要是在種子周圍產(chǎn)生黑色霉點(diǎn)。以上結(jié)果表明，2#菌株為毛紅椿種子的強(qiáng)致病菌，是樣品種子腐爛的主要原因。因此，對2#菌株進(jìn)行菌種鑒定和生物學(xué)特性研究。分離菌種保藏于江西農(nóng)業(yè)大學(xué)菌種保藏中心，2#菌株編號為JZF 02。

注：A為對照；B為1#菌感染特征；C為2#菌感染特征。圖1 分離真菌對毛紅椿種子的感染特征

注：A為2#菌菌落正面；B為2#菌菌落背面；C為2#菌菌絲及厚垣孢子。圖2 2#菌形態(tài)特征

表1 毛紅椿病原菌對毛紅椿種子的致病能力

菌株編號成苗率/%種子霉變率/%幼苗存活率/%幼苗干重/mg對照78.47±1.66a8.89±1.92b81.64±5.85a2.23±0.23a1#62.23±5.08b7.78±1.92b70.9±12.23a2.10±0.10a2#6.67±5.77c90.0±8.83a60.00±0.00a1.68±0.35b

注：表中小寫字母表示顯著性差異(LSD法，p<0.05)。下同。

2.2 種帶病原真菌的鑒定

2.2.1形態(tài)學(xué)特征

如圖2所示，2#菌在PDA培養(yǎng)基上生長迅速，28 ℃黑暗培養(yǎng)7 d長滿平皿(9 cm)；氣生菌絲發(fā)達(dá)，蓬松，呈白色絮狀；培養(yǎng)初期菌落背面呈白色，隨培養(yǎng)時間加長而逐漸變黃；菌絲透明，直徑3～7.5μm，菌絲的頂端或中間部分膨大產(chǎn)生圓形或卵圓形厚垣孢子；菌絲末端可形成隔膜，斷裂以形成分生孢子，直徑8～27μm。

2.2.2分子學(xué)鑒定

真菌JZF 02(2#菌)的ITS 1 序列長502 bp。經(jīng)過 NCBI BLAST 比對，與菌株Fusariumsp. H 5 LL-2016(321547.1)同源性高達(dá) 99%。選取真菌JZF 02(2#菌)的 前3 個近緣種的基因序列，以黑曲霉(Aspergillusniger)和Discostromafuscellum的基因序列作為對比來構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹?；卩徑臃▽Σ≡婢鶭ZF 02的DNA序列進(jìn)行進(jìn)化分析。如圖 3所示，真菌JZF 02與Fusariumchlamydosporum同處于一個聚類組中，說明真菌JZF 02與Fusariumchlamydosporum的進(jìn)化關(guān)系最近，再結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，真菌JZF 02鑒定為Fusariumchlamydosporum。

表2 病原菌JZF 02在不同培養(yǎng)基上生長的速率

培養(yǎng)基類型PDAPSACAMACD菌落直徑/cm4.13±0.11b5.15±0.07a3.85±0.09c4.10±0.08b3.34±0.09d

表3 不同碳源對病原菌JZF 02生長的影響

指標(biāo)碳源種類葡萄糖乳糖蔗糖麥芽糖可溶性淀粉無碳源菌落直徑/cm6.66±0.20a6.53±0.18a6.92±0.51a7.21±0.29a7.21±0.07a0.74±0.15b氣生菌絲稀疏稀疏稀疏稀疏濃密稀疏色素黃色無黃色淡黃色淡黃色無

表4 不同氮源對病原菌JZF 02生長的影響

指標(biāo)氮源種類硝酸鈉酵母膏蛋白胨牛肉膏硫酸銨硝酸銨無氮源菌落直徑/cm5.97±0.61bc7.52±0.08a6.83±0.98ab 5.66±0.68bc4.53±0.26cd3.73±0.12d0.80±0.04e氣生菌絲濃密濃密稀疏濃密稀疏濃密稀疏

圖3 基于鄰接法對毛紅椿種腐病原真菌JZF 02 DNA序列進(jìn)行進(jìn)化分析

2.3 不同培養(yǎng)基對病原菌生長的影響

病原菌JZF 02(2號菌)在PSA培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌落直徑最大，達(dá)5.15 cm，在查氏培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌落直徑最小，只有3.34 cm。在PDA與MA 2種培養(yǎng)基之間菌落直徑差異不顯著，其他3種培養(yǎng)基之間菌落直徑差異顯著(表2)。菌絲在不同培養(yǎng)基上的生長速率表現(xiàn)為PSA>PDA/MA>CA>CD。

2.4 不同碳源對病原菌生長的影響

除不添加碳源的查氏培養(yǎng)基外，病原菌JZF 02在添加5種不同碳源的察氏培養(yǎng)基上菌落直徑差異均不顯著，在添加可溶性淀粉培養(yǎng)基上菌絲較濃密，且產(chǎn)生淡黃色色素(表3)。以上結(jié)果表明葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖和可溶性淀粉均能被該菌利用，對菌絲生長速率沒有顯著不同的影響，但可溶性淀粉更適合該病原菌的營養(yǎng)條件。

2.5 不同氮源對病原菌生長的影響

病原菌JZF 02在酵母膏培養(yǎng)基上菌落直徑最大，無氮源培養(yǎng)基上菌落直徑最小，硝酸鈉、牛肉膏、蛋白胨3種氮源之間菌落直徑差異不顯著，酵母膏菌落直徑顯著大于其他氮源，硝酸鈉菌落直徑顯著大于硝酸銨和無氮源；硝酸鈉、酵母膏、牛肉膏和硝酸銨菌落氣生菌絲濃密，而其他氮源較稀疏(表4)。以上結(jié)果表明，不同氮源影響菌絲生長速率和菌絲分枝數(shù)，在以上幾種氮源中，酵母膏是該菌最適氮源，該菌能夠利用硝酸鹽，但銨鹽不適合該菌生長。

2.6 溫度對菌株生長的影響

病原菌JZF 02在0～40 ℃均能生長，在25～30 ℃下培養(yǎng)菌落直徑差異不顯著，且在30 ℃下培養(yǎng)菌落直徑最大，達(dá)到6.35 cm，0 ℃下培養(yǎng)菌落直徑最小，只有0.21 cm(表5)。表明25～30 ℃為該菌的最適生長溫度,溫度過高過低均會抑制該菌生長。

2.7 pH對菌株生長的影響

病原菌JZF 02在pH 5～12均能生長，在pH 7～11的條件下培養(yǎng)菌落直徑差異不顯著，且在pH 8的培養(yǎng)條件下菌落直徑最大，達(dá)7.56 cm，說明該菌pH適應(yīng)范圍較寬，嗜好中性偏堿條件。

3 結(jié)論與討論

3.1 討 論

厚垣鐮孢菌(Fusariumchlamydosporum)是一種常見的植物病原菌，會引起苜蓿根腐病[8-9]、玉米莖腐病[10]和國槐潰瘍病[11]等病害，因其對馬唐等惡性雜草的強(qiáng)致病性，也作為生防菌被研究和利用[12]；但從懷山藥中分離的一株優(yōu)勢菌株厚孢鐮刀菌 (FusariumchlamydosporumWollen)對懷山藥不引起明顯病害癥狀，其代謝產(chǎn)物和藥材質(zhì)量之間可能存在某些聯(lián)系[13]。本試驗(yàn)分離鑒定的厚垣鐮孢菌所致毛紅椿病害，是國內(nèi)首次報(bào)道。病原真菌菌絲能夠穿透植物的表皮細(xì)胞侵染植株，同時真菌次生代謝產(chǎn)物可能會引起植物細(xì)胞生理生化性質(zhì)的改變，其致病能力取決于環(huán)境因素，適宜的溫度、濕度、pH等可以促進(jìn)真菌孢子的萌發(fā)，菌絲的生長，從而導(dǎo)致真菌侵染引發(fā)植株病害[14]。本試驗(yàn)中病原菌JZF 02在0～40 ℃和pH 5～12均能生長，在過高或過低溫度以及過酸過堿條件下，只是生長緩慢，說明該菌是一種適應(yīng)性很強(qiáng)的菌種，對不良環(huán)境有較強(qiáng)的耐受力。該菌很容易隨毛紅椿種子擴(kuò)散，并侵染種苗的各個階段。病原菌JZF 02對不同碳源都具有一定的利用能力，可溶性淀粉更適合該病原菌的營養(yǎng)條件，這可能與該菌的分離基質(zhì)——種子含大量淀粉有關(guān)。氮源是生物另一個重要的營養(yǎng)源，同一真菌對不同的氮源的利用能力不同，還會引起真菌次生代謝產(chǎn)物的改變。病原菌JZF 02能夠利用硝酸鹽，但利用硫酸銨和硝酸銨兩種銨鹽的能力較弱，其原理有待進(jìn)一步研究。毛紅椿種子低溫保存也出現(xiàn)霉變現(xiàn)象，室溫下活力更難以保存的現(xiàn)象與其所污染菌的種類有關(guān)。植物病害可能由多種真菌單獨(dú)或復(fù)合侵染所致，因此，明確毛紅椿種際真菌種類及其相互作用也是需要進(jìn)一步研究的內(nèi)容。

3.2 結(jié) 論

從九連山霉?fàn)€毛紅椿種子上分離到2株真菌，其中JZF 02是引起種子霉?fàn)€的強(qiáng)致病菌，經(jīng)鑒定為厚垣鐮孢菌(F.chlamydosporum)，該菌是一種適應(yīng)性很強(qiáng)的菌種，對不良環(huán)境有很強(qiáng)的耐受力，該菌的感染是毛紅椿種子活力喪失的原因之一。此研究為毛紅椿種子活力的保存和病害的防治提供了理論依據(jù)。