石峻，趙紅敏

(西安市第九醫(yī)院 1．婦產(chǎn)科；2.超聲醫(yī)學(xué)科，西安 710054)

稽留流產(chǎn)(MA)是指胚胎或胎兒死亡后仍滯留宮腔內(nèi)未能自然排出，又稱過期流產(chǎn)，多發(fā)生于妊娠12周以內(nèi)，可導(dǎo)致彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)，發(fā)生凝血功能障礙，是一種較難處理的病理性妊娠類型[1]。MA病因復(fù)雜，與胚胎或胎兒染色體異常、母-胎界面免疫失衡、母體生殖道感染、母體內(nèi)分泌異常、細(xì)胞增殖凋亡異常、子宮胎盤循環(huán)障礙、心理狀態(tài)等有關(guān)[2]。有研究認(rèn)為[3]，除了胚胎或胎兒染色體異常導(dǎo)致早期流產(chǎn)這一常見因素，母-胎界面免疫失衡引起母體對胚胎的免疫排斥也是導(dǎo)致MA發(fā)生的重要因素。近年來母-胎界面脫膜組織在MA發(fā)病機(jī)制中的研究受到重視。受精卵著床后子宮內(nèi)膜間質(zhì)受蛻膜化誘導(dǎo)因子刺激增殖和再分化形成蛻膜組織，其功能的正常表達(dá)對妊娠建立與維持及分娩發(fā)動極為重要[4]。有研究顯示[5]，蛻膜組織中存在多種蛋白，其表達(dá)水平的差異對MA造成的影響不盡相同。CD47是一種廣泛表達(dá)于各種細(xì)胞表面膜蛋白，參與β3整合素介導(dǎo)的信號通路，對細(xì)胞生長、凋亡及遷移、血小板激活、細(xì)胞粘附、改變血管通透性等發(fā)揮作用[6]。鈣網(wǎng)蛋白(CRT)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)主要的鈣結(jié)合蛋白，根據(jù)其生物學(xué)功能可分為CRT的佐劑效應(yīng)、胞外CRT的功能、細(xì)胞膜表面CRT的功能和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)功能四個方面；CRT對維持Ca2+穩(wěn)態(tài)、協(xié)助蛋白質(zhì)的折疊和加工、抑制血管生成、參與抗原提呈、細(xì)胞調(diào)亡等具有重要意義[7]。然而，關(guān)于CD47和CRT在人稽留流產(chǎn)胎膜組織中有無表達(dá)，及其之間是否存在一定關(guān)聯(lián)，目前未見報道。為此，本次研究通過對人稽留流產(chǎn)蛻膜組織中的CD47及CRT兩種蛋白進(jìn)行檢測，觀察其表達(dá)情況?，F(xiàn)報道如下：

資料與方法

一、研究對象

1.一般資料：選取2017年6月至2018 年10 月我院婦產(chǎn)科收治并診斷為稽留流產(chǎn)的40例患者資料進(jìn)行研究，納入同期行人工流產(chǎn)的正常早孕患者為對照組(42例)。

2.稽留流產(chǎn)的診斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)早孕反應(yīng)消失，有先兆流產(chǎn)癥狀(陰道出血)或無任何癥狀；(2)子宮不再增大反而縮小，至妊娠中期時胎動消失或無胎動；(3)經(jīng)婦科檢查可見宮頸口閉合，子宮較停經(jīng)周數(shù)小、質(zhì)地較硬，無胎心；(4)B超檢查發(fā)現(xiàn)子宮腔內(nèi)胚囊不規(guī)則，囊內(nèi)反射波紊亂，無胎心搏動；(5)實(shí)驗(yàn)室檢查發(fā)現(xiàn)孕婦血清孕酮及絨毛膜促性腺激素(HCG值)低于正常值；(6)尿妊娠試驗(yàn)呈陰性。

3.納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)兩組孕婦年齡均在18～45 歲之間，妊娠時間均為6～12 w；(2)無全身感染性疾病及其他合并癥，流產(chǎn)前無任何用藥史；(3)既往無自然流產(chǎn)及死胎史，均為單胎妊娠早期流產(chǎn)；(4)月經(jīng)周期規(guī)律，均無生殖系統(tǒng)異常、產(chǎn)道感染；(5)宮腔形態(tài)正常，無宮腔粘連、子宮畸形等子宮器質(zhì)性病變等。

4.排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)既往有習(xí)慣性流產(chǎn)史；(2)有腫瘤病史及妊娠期合并癥；(3)有家族遺傳病或系統(tǒng)性疾病等。

5.試劑及標(biāo)本收集：SP免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋)，兔抗重組人CRT抗體(Santa Cruz，美國)，兔抗人CD47抗體(Santa Cruz，美國)。標(biāo)本收集：在患者排除感染期疾病后行常規(guī)消毒、麻醉，取膀胱截石位，利用彩色多普勒進(jìn)行孕囊確認(rèn)及擴(kuò)宮，通過腹部B超引導(dǎo)，負(fù)壓吸引妊娠囊行刮宮術(shù)并收集其清除組織，將部分所得組織投入95%酒精中固定然后送至病理檢查，待蛻膜分離后利用4%多聚甲醛固定12～24 h。再將固定好蛻膜組織置于組織盒并放入全自動組織脫水機(jī)常規(guī)脫水、浸蠟，并用石蠟包埋，待檢。

二、方法

1.Western Blot檢測兩組患者蛻膜組織中CD47和CRT的表達(dá)情況：制備12%分離膠和6%濃縮膠，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，用麗春紅S染液復(fù)染5 min，水中脫色，標(biāo)記目的蛋白位置后，用蒸餾水洗滌5 min×3次，至完全脫色。將目的蛋白的NC膜條帶放入含5%脫脂奶粉的PBST緩沖液中，室溫下封閉2 h，取出NC膜，加入1∶500倍稀釋的一抗，室溫下緩慢搖動孵育4 h。然后PBST洗滌5 min×3次。然后加入1∶8 000倍稀釋的二抗，室溫下緩慢搖動孵育1 h，PBST洗滌5 min×3次，采用化學(xué)發(fā)光法，統(tǒng)計灰度值。

2.SP法檢測兩組患者蛻膜組織中CD47及CRT的表達(dá)情況：免疫組化SP法實(shí)驗(yàn)方法[8]，石蠟切片，厚度約5 μm，常規(guī)脫蠟，采用1 500 ml檸檬酸鹽抗原修復(fù)，磷酸緩沖鹽溶液(PBS液)震蕩漂洗5 min，3次；然后進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色：滴加過氧化物酶(3% H2O2)阻斷試劑，室溫孵育20 min，滴加山羊血清工作液50 μl，室溫封閉20 min；滴加一抗50 μl/片，4℃恒溫箱過夜；加入生物素標(biāo)記的二抗50 μl/片，37℃孵育30 min；加入辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液50 μl/片，37℃孵育30 min；PBS液漂洗，加入1～2滴DAB 液染色3～10 min，顯微鏡下觀察顯色情況；后將切片投入蘇木素染液復(fù)染5 min，滴加中性樹膠封片，干燥備用，記錄染色結(jié)果。對照組試驗(yàn)用PBS 緩沖液代替一抗，其余操作過程同上。SP免疫組化染色法判定標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù)顯微鏡下細(xì)胞核、胞漿或間質(zhì)有黃色、棕黃色或深褐黃色顆粒判斷為陽性細(xì)胞。選取兩組患者蛻膜組織切片標(biāo)本于顯微鏡下隨機(jī)觀察10個視野范圍(×400)，使用I mage Pro Plus圖像分析系統(tǒng)測算，繪制兩組患者蛻膜組織陽性區(qū)域CRT及CD47的積分光密度值(IOD值)及IOD/Area值，分析其相關(guān)性。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、一般資料比較

稽留流產(chǎn)組(40例)：孕婦年齡21～38 歲，平均(25.6±2.5)歲；孕齡6～12 w，平均(9.7±1.6)w；BMI指數(shù)(23.4±3.1)kg/m2。對照組(42例)，孕婦年齡23～42歲，平均(26.1±2.3)歲；孕齡7～11 w，平均(8.5±1.3)w；BMI指數(shù)(22.7±3.9)kg/m2。兩組患者年齡、孕周等一般基本資料無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

二、Western Blot檢測兩組蛻膜組織中CD47和CRT的表達(dá)

結(jié)果表明，與對照組比較，稽留流產(chǎn)組患者蛻膜組織中CRT表達(dá)極顯著升高，CD47表達(dá)極顯著下降(P<0.01)(圖1)。

A：Western Blot檢測條帶圖；B：兩組蛻膜組織中CD47相對表達(dá)情況；C：兩組蛻膜組織中CRT相對表達(dá)情況。與對照組相比較，**P<0.01

三、SP法檢測兩組蛻膜組織中CD47和CRT的表達(dá)情況

CRT在脫膜組織中定位于細(xì)胞漿及胞膜呈陽性表達(dá)，稽留流產(chǎn)組患者蛻膜組織中CRT表達(dá)升高且高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(圖2)。CD47在蛻膜組織中定位于細(xì)胞漿及胞膜呈陽性表達(dá)，稽留流產(chǎn)組患者蛻膜組織中CD47表達(dá)下降且低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(圖3)。

A：兩組蛻膜組織中CRT免疫組化圖；B：兩組蛻膜組織單位面積內(nèi)CRT濃度。與對照組相比較，**P<0.01

A：兩組蛻膜組織中CD47免疫組化圖；B：兩組蛻膜組織單位面積內(nèi)CD47濃度。與對照組相比較，**P<0.01

四、兩組患者蛻膜組織中CRT及CD47的IOD值

稽留流產(chǎn)組患者蛻膜組織中CRT的IOD值顯著高于對照組，CD47的IOD值顯著低于對照組(P<0.01)。對兩組患者CRT與CD47的IOD值采用Pearman相關(guān)性分析，結(jié)果顯示稽留流產(chǎn)組40例患者蛻膜組織中CRT與CD47的IOD值呈負(fù)相關(guān)(r=-0.648，P=0.012)，對照組患者蛻膜組織中CRT與CD47的IOD值呈正相關(guān)(r=0.324，P=0.023)(表1)。

表1 兩組患者蛻膜組織中CRT及CD47表達(dá)(-±s)

討 論

MA是臨床中較常見的一種流產(chǎn)類型，近年來其發(fā)生率高達(dá)13.4%，發(fā)病機(jī)制尚不明確，降低MA的發(fā)生率，預(yù)防不良妊娠結(jié)局發(fā)生，對我國優(yōu)生優(yōu)育有著深遠(yuǎn)的意義。蛻膜組織使母體和胎兒建立密切聯(lián)系，胚胎通過蛻膜組織從母體獲得營養(yǎng)物質(zhì)。子宮蛻膜功能的正常表達(dá)在妊娠過程中非常重要，當(dāng)蛻膜組織微環(huán)境被破壞后，可能使母體對胎兒無法耐受，發(fā)生免疫排斥導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生，因此，母-胎界面免疫失衡可能是誘發(fā)MA的重要因素。CD47參與胚胎植入和發(fā)育、使蛻膜增殖分化與凋亡、促進(jìn)胎盤新生血管的形成等，其表達(dá)異常會導(dǎo)致免疫調(diào)節(jié)失衡，阻礙胎盤新生血管形成，從而導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局[8]；CRT表達(dá)異?？梢种蒲艿纳桑鰪?qiáng)吞噬細(xì)胞活性，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡和清除。有文獻(xiàn)報道[9]，凋亡細(xì)胞膜表面CRT升高的同時，伴隨CD47表達(dá)量的明顯下降，兩者共同作用可增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的吞噬效率。

CD47與SIRPα結(jié)合通過抑制巨噬細(xì)胞的活性，保證自身正常細(xì)胞不被巨噬細(xì)胞吞噬[10]。CD47表達(dá)缺失可能會增加巨噬細(xì)胞活性和胎盤血管的形成障礙，導(dǎo)致母體對胎兒發(fā)生免疫排斥，從而導(dǎo)致MA發(fā)生[11]。研究采用Western Blot法對兩組患者蛻膜組織中CD47和CRT的表達(dá)情況進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組比較稽留流產(chǎn)組患者蛻膜組織中CRT表達(dá)升高，CD47表達(dá)下降，統(tǒng)計有顯著性差異(P<0.01)。免疫組化SP法檢測發(fā)現(xiàn)CD47在蛻膜組織中定位于細(xì)胞漿及胞膜呈陽性表達(dá)，與對照組比較，稽留流產(chǎn)組蛻膜組織中CD47表達(dá)下降且顯著低于對照組(P<0.01)。說明CD47低表達(dá)會影響母-胎界面免疫失衡，在MA的發(fā)生過程中可能起到了推動作用。細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜表面CRT的出現(xiàn)要早于磷脂酰絲胺酸(PS)，細(xì)胞凋亡時，CRT會由細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)向細(xì)胞膜表面，并密集分布，這種異常表達(dá)和存在于巨噬細(xì)胞表面的受體相關(guān)蛋白(LDL)結(jié)合，向巨噬細(xì)胞發(fā)出信號，以便及時清除凋亡細(xì)胞，避免局部炎癥反應(yīng)的出現(xiàn)[12-13]。在關(guān)于妊娠小鼠蛻膜CRT表達(dá)的試驗(yàn)結(jié)果顯示[14]，妊娠小鼠的脫膜組織中和未孕小鼠的子宮內(nèi)膜中均存在CRTmRNA的表達(dá)，妊娠小鼠脫膜組織中CRT水平顯著高于未孕小鼠子宮內(nèi)膜組織，小鼠在妊娠第4～5 d時CRT達(dá)到高峰，之后CRT下降，說明CRT對胚胎植入可能發(fā)揮一定作用。也有研究表明CRT對小鼠胚胎的心臟發(fā)育有一定影響，正常情況下CRT在小鼠妊娠的第9天左右被激活，第18天后CRT表達(dá)開始減弱；而在CRT過度表達(dá)的小鼠或存在CRT基因缺陷的小鼠中，其心肌厚度病理改變，最終小鼠胚胎因心臟功能紊亂而死亡[15]。研究中顯示，CRT在兩組脫膜組織中也定位于細(xì)胞漿及胞膜呈陽性表達(dá)，稽留流產(chǎn)組患者蛻膜組織中CRT表達(dá)升高且顯著高于對照組(P<0.01)。說明在胚胎著床后MA患者蛻膜組織中CRT合成增加，可能導(dǎo)致CRT由細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞表面，從而釋放大量的吞噬信號，增加了巨噬細(xì)胞活性，同時CRT的增高，抑制了血管生成，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，對MA的發(fā)生起到推動作用。此外，研究中通過分析兩組蛻膜組織中CD47及CRT的IOD值發(fā)現(xiàn)，稽留流產(chǎn)組患者蛻膜組織中CRT的IOD值高于對照組，CD47的IOD值顯著低于對照組(P<0.01)；并對兩組患者CRT與CD47的IOD值采用Pearman相關(guān)性分析，結(jié)果顯示稽留流產(chǎn)組40例患者蛻膜組織中CRT與CD47的IOD值呈負(fù)相關(guān)(r=-0.648，P=0.012)，對照組患者蛻膜組織中CRT與CD47的IOD值呈正相關(guān)(r=0.324，P=0.023)。說明CRT與CD47的平衡表達(dá)可能對母-胎界面免疫環(huán)境的穩(wěn)定和免疫耐受過程具有重要作用；本研究僅對蛻膜組織的CRT、CD47進(jìn)行半定量檢測，結(jié)果說明CRT、CD47可能與MA存在一定關(guān)聯(lián)。母-胎界面存在多種免疫活性細(xì)胞，其究竟是通過脫膜基質(zhì)細(xì)胞/脫膜免疫細(xì)胞還是滋養(yǎng)細(xì)胞參與母-胎界面平衡，仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，蛻膜組織中CRT、CD47的異常表達(dá)，可能對MA進(jìn)程發(fā)揮作用。